一、PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究（论文文献综述）
吴伟文[1]（2019）在《实时荧光定量和等温核酸扩增检测莲藕潜隐病毒技术的建立与应用》文中指出莲藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡莲科莲属多年生宿根水生草本植物,是我国重要的特色水生蔬菜。莲藕中含有丰富的营养物质,受到国内外消费者的喜爱。在我国莲藕主产区,发生地下茎瘦小僵硬、表面出现深入皮层的黑褐色点斑和条斑的“僵藕”问题,前期研究表明,“僵藕”极有可能是由病毒侵染引起的。目前,已报道的在莲藕上发生的病毒主要有:莲藕潜隐病毒（暂定名）（Lotus latent virus,LLV）,黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）、莲藕条斑病毒（Lotus streak virus）,芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus,DsMV）和苹果茎沟病毒（Applestemgroovingvirus,ASGV）。本实验室前期在对上述病毒的初步研究中发现LLV的发生最普遍,分布最广泛,但该病毒的稳定的检测技术尚未建立。为此,本论文研究了基于实时荧光定量和等温核酸扩增的该病毒的检测技术体系,并利用该检测技术研究了 LLV在莲藕中的分布。主要结果如下:1、建立了 RT-qPCR、LAMP和RPA 3种LLV检测体系,其中,RT-qPCR检测体系灵敏度最高,最低检测限度为7×101拷贝.μl-1,是RT-PCR的100倍,适用于脱毒莲藕种苗的检测鉴定;LAMP检测体系最低检测限度为7×103拷贝·μl-1,与RT-PCR一致,且具有可视化特点,适用于田间诊断;RPA检测体系反应时间短,速度快,最低检测限度为7x103拷贝·μl-1,可作为大量莲藕样品检测时的有效手段。2、利用灵敏度最高的RT-qPCR检测技术,分别对“僵藕”样品不同部位进行LLV定量检测。结果发现,LLV在“僵藕”顶芽后第一节地下茎中浓度最高,并且逐节递减。对“僵藕”做种后新结莲藕的地下茎的表皮层、气孔周围基本组织、维管束组织以及中央薄壁细胞的检测发现,在维管束和气孔周围基本组织中LLV的浓度显着高于表皮层及中央薄壁细胞。
何静[2]（2018）在《江油附子乌头花叶病毒分子检测的研究》文中提出附子,又名乌头或附片,附子是毛茛科植物乌头根的子根,具强心、镇痛、抗炎、降低血糖、局部麻醉的作用并且能够抗肿瘤、抗衰老和回阳救逆。主要化学成分有乌头碱、中乌头碱、次乌头碱、去氧乌头碱、塔拉乌头胺等。附子采用块根繁殖,这种无性繁殖方式能积累病虫害,导致产量下降和品质退化。附子受病虫害并造成了很多疾病包括:白绢病、白粉病、根结线虫病、花叶病等,同时连作障碍使附子病害不断积累,使附子品种退化并且严重影响正常生长,极大地限制了附子的种植生产。近年来在乌头道地产区江油常发生乌头花叶病毒病害,发生较高的年份或田块发病率最高可达70%80%。本研究通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从分子方面鉴定附子地道产区四川江油乌头花叶病植株的病原物种类及其特性,并分析了病毒在不同部位的表达量差异,为乌头花叶病的防治奠定理论基础,具体研究结果如下:1.花叶病乌头中黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）外壳蛋白基因（CP）的克隆及序列比对分析根据GenBank中己收录的CMV的外壳蛋白基因的一段长度为375bp的保守序列设计特异引物:CMV（cp-F、R）,以花叶病乌头植株叶片和须根RNA反转录的cDNA作为底物,阴性对照选取健康的组培乌头叶片进行RT-PCR扩增。优化克隆条件,退火温度为55.7℃为得到的最优的克隆条件。经纯化、转化、测序得到一段长度为375bp核苷酸序列。与国内外已报道的18种代表性CMV分离物cp基因的核苷酸与氨基酸的序列相似性为74.8%-98.2%,73.4%-99.2%,与CMV亚组II的核苷酸相似性96.1%-98.2%,与CMV亚组II的氨基酸相似性为96.0%-99.2%,CMV分离物与中国分离物（CMV-PCT2）氨基酸序列相似性最高达到99.2%。遗传进化分析显示与中国分离物（Zin和Hubei-1）和美国分离物（DKRD）亲缘关系较近,聚在CMV亚组II分支,将其命名为CMV-FZ。3、花叶病乌头中CMV外壳蛋白基因的理化性质分析蛋白的理化性质预测分析,推测其分子式为C610H1004N186O183S3,相对分子量13952Da,等电点（PI）为10.77。该蛋白的不稳定系数为62.80,属于不稳定蛋白。脂肪系数为71.76,亲水性系数为-0.650。CMV-FZ基因编码125个氨基酸,比较蛋白的氨基酸组成,最多的两种氨基酸分别是Ser（丝氨酸）、Arg（精氨酸）,所占比例分别是12.0%、11.2%,氨基酸残基（Asp+Glu）带负电荷的为10个,氨基酸残基（Arg+Lys）带正电荷的为23个。疏水性预测表明CMV-FZ基因是亲水蛋白。预测蛋白质序列CMV-FZ亚细胞定位于叶绿体转运肽和细胞核中,跨膜区预测该蛋白为非跨膜蛋白,信号肽预测该蛋白可能在跨膜运输中起信号识别作用,成熟肽始于第17位氨基酸,含有信号肽序列为ALMDKSESTNASRTSRR。剪切位点位于第17-18位氨基酸。3、花叶病乌头中CMV外壳蛋白基因的蛋白质结构预测及motif预测CMV-FZ基因所编码蛋白质的二级结构预测分析结果显示,蛋白二级结构中有有5个β（Strand,e）折叠含量为17.1%,一个α螺旋（Helix,h）含量为15.4%,无规则卷曲（Coil,c）含量最高为67.5%。对CMV-FZ进行蛋白三级结构预测,预测结果与已报到1f15.1蛋白相似度很高,1f15.1是黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus CMV）（STRAIN FNY）。分别对CMV-FZ和其它4个CMV分离物和PSV的cp蛋白序列进行保守基序分析。结果显示这些CMV氨基酸序列均含有高度保守的motif 1-motif 6核心保守基序。CMV-FZ蛋白与亚组II CMV-Wem和Hubei-1蛋白的保守基序几乎完全相同。进一步说明CMV-FZ属于CMV亚组II。4、荧光定量检测CMV病毒在乌头不同部位的表达量用内参基因EF1、ACTIN相关引物克隆样本cDNA经测序根据基因比对分析,EF1与NCBI中的EF1基因（FJ389748.1）的相似度为93%,且在乌头块根、须根、叶中表达相对稳定。EF1基因相对保守,挑选EF1基因作为乌头内参基因。对花叶病乌头的叶、块根、须根进行实时荧光定量检测,分析CMV-FZ基因在乌头各部位表达量的差异,结果表明CMV病毒在叶片、须根和块根的表达量呈显着性差异,其中在叶片的表达含量最高,须根第二,块根最少。综上所述,通过对附子地道产区四川江油的乌头花叶病植株病原物种类进行分子鉴定并对基因序列分析其特性,结果表明黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus CMV）侵染花叶病症状的乌头。从分子上对乌头花叶病病原物进行了鉴定及序列分析,得到了一个关于乌头中黄瓜花叶病毒的鉴定体系,为其综合防治提供科学依据。
李晋文[3]（2017）在《猴B病毒血清学检测方法的比较及表位研究》文中研究指明目的猴B病毒（Monkey B virus,BV）（也称猴疱疹病毒I型（Cercopithecine herpesvirus 1））,是重要的人兽共患病原,属一类病原,四级生物安全实验室防护。国家标准检测要求猴B病毒作为抗原,但由于生物安全问题,其抗原制备受到很大限制,因此使用替代抗原进行其血清学检测并对其比对验证。方法应用2种ELISA方法（抗原分别为BV和HVP2）、1种IEA方法（抗原为HSV-1）和1种IFA方法（抗原为HSV-1）对本实验室135份送检恒河猴血液样品进行筛查,对阳性及可疑样品再用Western Blot（抗原为HSV-1）方法以及以HSV-1 gCl纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法验证。结果HVP2-ELISA、BV-ELISA、HSV-1-IEA和HSV-1-IFA阳性检出率分别为36.3%、38.5%、35.6%和34.1%;4种方法检测结果一致的样品占91.9%（124/135）,阳性结果均可被WB和免疫印迹方法确证;可疑样品11份,27.3%（3/11）的样品经验证检验为阳性。结论几种抗体检测方法检测结果符合率较高,均可以作为初筛检测方法;阳性样品及可疑样品的确证检验应使用多种方法,避免漏检;在ELISA法初筛检测中,阳性样品的判定标准可适当降低,避免可疑样品漏检。目的:鉴定B病毒特异的检测抗原表位。方法:利用生物信息学的预测分析技术对BV和HSV全病毒的序列进行分析比对,选择B病毒特异表位以及B病毒可能的线性表位肽段合成多肽;同时,利用跨叠多肽阵列技术,针对B病毒核心抗原蛋白gB和gD的氨基酸序列进行跨叠阵列设计并合成多肽。再利用合成肽与B病毒标准血清样品进行ELISA验证,评价表位肽段的特异性和敏感性。结果:ELISA测定结果显示,gD蛋白肽段（序列为AQLPPNWHVPEAS）和gB蛋白肽段（序列为YVRELLREQERRPGDAAATPKPSA）可检测猴B病毒抗体,与传统ELISAL比较,二者的组合检测敏感性为98%（49/50）;然而,使用生物信息学预测的B病毒特异表位在多次实验无法获得证实。结论:多肽表位抗原,在ELISA实验中与病毒颗粒抗原相比,具有较为一致的准确性,且检测灵敏度高,此类抗原可以作为初筛的检测技术应用于猴B病毒检测;生物信息学预测的B病毒特异表位多位于B病毒的功能基因位置,抗原性较差,而最后具有检测应用价值的表位仍位于核心抗原蛋白中。
王鹏飞[4]（2016）在《实验动物金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体多重PCR检测方法的建立与初步应用》文中研究表明目的:实验动物是生命科学研究的基础和条件,实验动物的质量直接影响众多领域科学实验的准确性,也关系到实验动物从业人员和动物实验操作者的健康。因此,实验动物的微生物质量控制已纳入国家标准。肺支原体（Mycoplasma pulmonis）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是实验动物微生物检测需要排除的病原体,也是实验动物常见的易感病原体,在大小鼠、豚鼠、地鼠和兔中感染率可达到百分之几,甚至百分之几十,相对其它病原体感染率较高。目前对实验动物携带的金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体的鉴定主要以分离纯化培养、生化试验等方法进行,存在费时费力、需要有经验的技术人员以客观指标加主观判断鉴定的缺点,如金黄色葡萄球菌从分离细菌到发出检测报告往往需要48h,绿脓杆菌需要长达72h,而肺支原体培养完成检测则需21天。而PCR（Polymerase Chain Reaction）技术以其简便、快速、准确等优点已在临床医学疾病诊断等领域得到广泛应用,理论上同样也可应用于实验动物的病原微生物检测,但普通PCR方法单管每次只能检测一种病原体,不能满足单管检测多种病原体的实际需要,更满足不了大样本、快速、准确的检测。多重PCR（multiplex PCR）可以在同一管反应体系中扩增出大小不同的核酸片段,具有快捷方便、高通量等优点。多重PCR如果应用在实验动物微生物检测中,可以同时检测多种病原体,适合大量实验动物微生物检测与鉴定,具有高灵敏性、高效性、高特异性和低成本性等优点。本研究目的是针对三种实验动物病原体金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体,建立多重PCR检测方法,并与传统的微生物检测方法比较,检验多重PCR检测方法的可操作性和准确性。方法:1、将金黄色葡萄球菌标准株转接到SP琼脂培养基,培养24h后转接到血液琼脂培养基上进行分离与纯化培养,显微镜镜下观察,进行血浆凝固酶试验和甘露醇发酵试验;将绿脓杆菌标准株转接到NAC液体培养基,后转接到nac固体培养基上进行分离与纯化培养,显微镜镜下观察,生化鉴定,氧化酶试验,42℃生长试验;将肺支原体接到液体培养基中,一周后进行观察。2、通过文献查找肺支原体、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌特异性引物,使用blast分析各病原体引物特异性;进行pcr扩增,对扩增产物进行测序,通过生物信息学分析验证扩增产物正确性;3、优化pcr反应体系,检测pcr方法的特异性和敏感性。将模板dna按照10倍的比例进行梯度稀释,分别以稀释后的模板dna进行扩增;用接种针挑取菌落加入到装有普通营养肉汤的试管中,放入37℃恒温摇床中进行扩菌,将摇好的菌液按着10倍比例进行梯度稀释,转接到固体培养基上培养,提取菌液核酸进行pcr扩增;pcr扩增其他非目的菌进行特异性实验。4、将肺支原体、金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的基因组dna在同一反应体系同时扩增,并且在反应体系中加入细菌通用引物做为内质控,调整和优化反应体系成分和反应条件,建立三种病原体多重pcr检测方法。选择具有实验动物生产资质的单位供应的动物:大小鼠共45只,采集实验动物回盲部内容物或粪便以及动物气管分泌物,提取核酸进行三种病原体多重pcr的检测,同时进行传统培养检测方法,将两种检测结果比较,检验多重pcr检测方法的可操作性和准确性。结果:1、金黄色葡萄球菌在sp固体培养基上形成黄色的菌落,转接血琼脂平皿形成灰白色、周围有β溶血环的菌落;菌体形态为革兰阳性球菌,排列成葡萄状;甘露醇发酵试验为阳性;血浆凝固酶试验为阳性。绿脓杆菌在nac琼脂平皿上形成扁平菌落,边缘不齐呈锯齿状,大部分菌落可产生绿色色素而致使培养基呈绿色;菌体特征为革兰阴性杆菌,菌体长短不一;各生化鉴定管阴阳性结果正确;氧化酶试验和42℃生长试验为阳性。肺支原体液体培养颜色由红色变为黄色。2、获得三种病原体的特异性引物,并通过blast比对验证引物的特异性,金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体扩增产物大小分别为153bp、375bp和266bp,其测序结果分别与genebank对应序列（sequenceid分别为:gb|dq507378.1、dbj|ab926025.1、gb|kp836312.1）相似度分别为97.00%、98.90%和99.59%。3、PCR特异性实验:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体特异性实验结果,除标准菌株扩增出阳性条带外,其它菌种均扩增阴性;敏感性实验:金黄色葡萄球菌PCR扩增最小检出DNA核酸量为1pg、最小检出菌落数为2CFU;绿脓杆菌PCR扩增最小检出DNA核酸量为10pg,最小检出菌落数为14CFU;肺支原体PCR扩增最小检出DNA核酸量为1pg。4、建立了金黄色葡萄球菌、肺支原体、绿脓杆菌和细菌通用基因的多重PCR扩增体系,其产物经琼脂糖电泳出四个条带,片段大小从小到大分别为153bp、266bp、375bp和520bp。PCR检测实验动物24h培养物中的菌落,其结果与实验动物微生物检测结果一致;检测实验动物粪便,检测结果与传统培养鉴定方法相比有差异。结论:成功建立金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体多重PCR检测体系,有较好的敏感性、特异性和重复性。用于实验动物微生物检测,检测结果与传统培养检测方法一致,并且多重PCR方法快速、简便、准确,初步验证了本检测方法具有良好的可操作性和准确性,为今后应用于实验动物微生物的检测奠定了基础。
汪乾坤[5]（2015）在《神农架金丝猴常见病流行病学初步研究》文中进行了进一步梳理川金丝猴（Rhinopithecus roxellana）为我国特有物种,国家一级重点保护动物。《中国濒危动物红皮书》和世界自然保护联盟（IUCN）分别将川金丝猴列为濒危物种（E）和易危物种（VU）。湖北神农架是我国川金丝猴地理分布的最东缘,只有1200多只,其中神农架大龙潭有野生金丝猴（人工补食群）约80只;小龙潭有笼养猴（野外救治个体）9只,生存状态极度濒危。疾病问题是危害和威胁金丝猴种质资源保护的重大问题之一。因此对神农架金丝猴常见病进行流行病学初步研究具有重要意义。本研究主要包括对神农架大龙潭和小龙潭金丝猴结核、致泻性病原菌、B病毒和猴巨细胞疱疹病毒等猴常见重大病原微生物进行病原学或血清流行病学调查,并建立了猴结核IFN-?检测方法。1.猴结核IFN-γ体外释放检测法的建立与初步应用传统猴结核检测方法为结核菌素眼睑皮内注射检测法（简称皮试）,具有特异性差、对猴体刺激大、操作时间长、不可追溯等缺点。本研究旨在建立猴结核IFN-γ体外释放检测法,用于猴结核病的特异性诊断。运用本实验室保存的原核表达的猕猴IFN-γ重组蛋白免疫Balb/C小鼠,再利用杂交瘤细胞技术获得12株高效价的单克隆抗体;同时免疫日本大耳白兔获得猕猴IFN-γ抗血清,经纯化后得到高效价猕猴IFN-γ多克隆抗体。首先用所获得的鼠抗IFN-γ单克隆抗体及兔抗IFN-γ多克隆抗体建立了检测猕猴IFN-γ的夹心ELISA,检测重组猕猴IFN-γ的灵敏度达到62.50pg/m L。该IFN-γ检测法与进口商品化试剂盒的总体符合率为93.84%,?=0.7800,表明具有较好的一致性。以眼睑皮试法为参考方法,先用皮试法检测146只猕猴,再用进口商品化的IFN-γ检测试剂盒检测猕猴外周血淋巴细胞在牛和禽结核菌素刺激下释放的IFN-γ量,利用ROC曲线确定猕猴结核IFN-γ检测法的临界值为114.5pg/m L,对皮试法的灵敏性为68.18%,特异性为91.94%。应用本研究所建立的猕猴IFN-γ检测法对10份神农架金丝猴血液样本进行检测,凝集素刀豆蛋白Con A刺激的全血样本产生的IFN-γ浓度为1512?166.0 pg/m L,与猕猴样本产生的IFN-γ水平类似（猕猴产生的IFN-γ浓度为1050?278.0 pg/m L）,表明本方法可以用于金丝猴结核病的检测。10份金丝猴临床样本经牛结核菌素和禽结核菌素刺激的全血样本与阴性对照全血样本产生的IFN-γ浓度无差别,表明10只金丝猴结核病均为阴性。总之,该研究建立了猴结核IFN-γ体外释放检测法,在猕猴结核检测中进行了初步应用,并可望用于金丝猴结核病检测,从而为猴结核检测提供了新型技术手段。2.神农架金丝猴粪便中致泻性病原的分离鉴定本研究旨在对从神农架采集的38只金丝猴的76份粪便样品（包括8份腹泻样品）进行致泻性病原鉴定,包括致泻性大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌等。结果从2只腹泻猴样本中鉴定出两株致泻性大肠杆菌,沙门氏菌和志贺氏菌未检出。对所分离细菌进行了培养特性和形态特征观察及生化试验,进一步开展了一系列检测,如PCR分群、毒力相关基因检测、O抗原鉴定、LD50试验、药敏试验等。PCR分群结果表明,分离得到的两株菌属于大肠杆菌D群;PCR扩增出eae（482bp）、esc V（544bp）等毒力基因,确定所分离菌株为非典型肠致病性大肠杆菌（a EPEC）。对a EPEC进行分型鉴定,扩增出黏附素β（562bp）基因,表明两株分离株为黏附素β亚型;分离得到的菌株血清型均为O98;两株分离菌株对小鼠致死性较弱,LD50分别为1.130×108 CFU和5.260×107CFU。药敏试验结果表明,两株菌都对氨基糖苷类、氟喹诺酮类和磺胺类等抗生素敏感。在第三代头孢中,大肠杆菌应该对头孢噻肟和头孢他啶耐药敏感,但检测发现分离株对这两种药耐药。此外,其中菌株1对亚胺培南和美洛培南耐药,而菌株2对其敏感。以上结果表明,此次神农架金丝猴腹泻可能是由非典型肠致病性大肠杆菌引起的,其中一株菌已具有一定的耐药性。研究结果为金丝猴腹泻性疾病的防治提供了科学依据。3.神农架金丝猴常见病毒病血清流行病学初步调查本研究旨在对神农架小龙潭7只笼养猴和大龙潭3只野生猴血清进行猴常见9种病毒抗体检测,包括B病毒（BV）、猴T细胞趋向性病毒（STLV-1）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴逆转录D型病毒（SRV）、猴泡沫病毒（SFV）、猴巨细胞病毒（Rh CMV）、猴水痘病毒（SVV）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus）和甲肝病毒（HAV）。结果,10只金丝猴中有6只猴B病毒Ig G抗体阳性,感染率为60%（6/10）;2只猴巨细胞病毒（Rh CMV）抗体阳性,感染率为20%（2/10）;猴T细胞趋向性病毒（STLV-1）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴逆转录D型病毒（SRV）、猴泡沫病毒（SFV）、猴水痘病毒（SVV）、柯萨奇病毒（Coxsackievirus）和甲肝病毒（HAV）等未检出。由于金丝猴物种的濒危地位,只采集10只猴的血液样本,但此研究结果却对金丝猴疾病的监测和防控具有重要意义。
孙涛[6]（2015）在《猴B病毒gD蛋白表达、纯化及单克隆抗体的制备》文中进行了进一步梳理猴B病毒（SimianB virus,BV）是一种引起人畜共患病的双链DNA病毒,猕猴为其自然宿主。猴在感染B病毒后,通常不表现明显的临床症状,有时表现出口腔的疱疹样损伤如口腔溃疡、结膜炎或牙龈炎,随后转变成慢性感染。B病毒主要通过唾液或生殖道分泌物经被感染猴所咬伤及抓伤传染给人类,造成的死亡率超过70%,且病患多表现为脑炎、脑脊髓炎等严重症状,且目前无特效的抗病毒治疗法。BV能够引起人和非猕猴灵长类的高致死率,给实验动物研究人员带来巨大的潜在危害。在猴B病毒编码的各种蛋白质中,gD蛋白具有种群和型特异性,是保守的结构蛋白,在病毒的进化中变异率比较低,携带有群特异性抗原决定簇,能刺激被感染机体产生强的群特异性免疫反应,对于易发生变异的猴B病毒的血清学诊断具有重要的应用价值。本研究在对猴B病毒gD基因进行分析和密码子优化的基础上,进行基因的人工合成和gD蛋白的原核表达,并制备其相应的单克隆抗体,为建立一种快速、有效的检测BV的诊断试剂研制奠定基础。主要研究内容和结果如下:1.猴B病毒gD蛋白的原核表达及纯化产物鉴定参照已公布的猴B病毒E2490毒株全序列,分析其中编码gD蛋白的基因序列,根据大肠杆菌的密码子偏爱性进行密码子优化,并由苏州金唯智生物科技有限公司进行DNA合成。合成的基因片段选用pET-32a原核表达载体进行表达。将gD基因片段克隆于pET-32a表达载体中、经抗性筛选、PCR扩增、限制性内切酶分析、测序分析,筛选获得BV-gD基因片段正向插入、有正确读码框的阳性克隆。阳性克隆质粒在E.coli Rosetta（DE3）感受态细胞中经IPTG诱导表达,筛选到重组载体pET-32a/gD。镍琼脂糖凝胶亲和层析柱分离重组载体pET-32a/gD表达的带His标签的重组gD蛋白。SDS-PAGE、Western blotting实验表明,表达蛋白为融合蛋白,分子量约为53kDa,这些重组蛋白得到正确表达。2.猴B病毒gD蛋白的单克隆抗体制备及鉴定本研究通过原核表达的猴B病毒囊膜蛋白（gD）为免疫原,纯化后经皮下免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。以重组gD蛋白作为检测原进行包被,用间接ELISA筛选抗gD阳性细胞株,采用有限稀释法对其进行亚克隆,经过3次亚克隆,共获得5株能稳定分泌抗BV gD蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4E3、3E7、3F8、1H3和4B6,其细胞培养上清ELISA效价均为1:640,腹水ELISA效价分别为1:2X 106、1:2×105、1:2×105、1:2×103和 1:2×102。亚类鉴定结果显示,单抗 1H3 和 4E3 为IgG2b亚型,单抗3E7、3F8和4B6为IgG1亚型,轻链均为K链。SDS-PAGE分析表明,五株单抗纯化后均能有两条明显的条带。间接免疫荧光实验结果表明,5株单抗均能很好的识别HSV-2感染Vero细胞中的gD同源蛋白,Western-blotting实验结果显示,3E7、3F8及4E3均能很好的识别HSV-2感染Vero细胞中的gD同源蛋白,而4B6和1H3则不能很好的识别。说明单抗3E7、3F8以及4E3株识别的gD蛋白抗原表位为HSV-2和BV之间相对较为保守的线性表位,而4B6和1H3可能仅别gD蛋白中的构象型表位,或识别的表位为BV gD蛋白中不同于HSV-2的区段,对BV病毒有较强的特异性。本研究制备了大量的重组BV-gD蛋白抗原,并通过ELISA实验验证了,其与感染BV的猴血清有特异性反应,总符合率为75%,这为猴B病毒检测试剂盒的研制奠定了基础。制备的单克隆抗体为进一步研究gD囊膜蛋白功能、建立BV检测方法以及HSV-2的基础研究均可提供一种有力的工具。
张倩[7]（2014）在《羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒的构建及初步评价》文中认为羊传染性脓疱病是由羊传染性脓疱病毒引起的绵羊、山羊等反刍动物以及人类的一种急性、高度嗜上皮性、接触性传染病。该病在世界养羊业发达的国家和地区广泛流行，危害较大，造成严重的经济损失，目前尚无有效的治疗药物；接种疫苗被认为是控制该病可靠而有效的手段。当前常规弱毒苗和灭活苗存在毒力返强、不安全、免疫保护率不高等缺点，急需开发一种新型的候选疫苗株以便更好的预防该病的发生和流行。羊痘病毒作为载体表达外源基因的有效性已经被大量研究所证实。因此，本研究选取商品化的山羊痘弱毒疫苗作为载体，构建表达羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组山羊痘病毒，并对其遗传稳定性、理化特性和免疫原性进行检测和初步评价，旨在获得能同时预防山羊痘和羊传染性脓疱病的双价基因工程疫苗。为此，本研究主要开展以下研究工作：1.分离鉴定羊传染性脓疱病毒。对新疆地区疑似羊传染性脓疱病的羔羊唇部结痂进行采集，研磨过滤后接种Vero细胞，分离培养病毒，待出现明显细胞病变时，收集细胞进行电镜观察；通过PCR技术扩增羊传染性脓疱病毒B2L基因，进行测序分析。同时对该分离株和Genbank上公布的中国其他省市区的30个分离株的B2L基因序列进行生物信息学分析并构建系统进化树。实验结果显示：羊传染性脓疱病毒接种细胞后出现明显的细胞病变，通过电镜观察到200nm左右的病毒粒子；PCR技术检测出了大小为1137bp的特异性目的片段。该分离株与其他分离株的核苷酸序列同源性为96.0%-99.1%，氨基酸的同源性为88.7%-99.2%；系统进化树分析显示该分离株与NX/YC-2010分离株遗传距离最近。2.构建羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒并研究其生物学特性。本研究利用同源重组技术构建含有良好免疫原性的ORFV011（B2L）基因的重组山羊痘病毒。采用PCR技术扩增B2L基因，通过分子克隆技术构建重组载体，并利用脂质体法将其转染已接种山羊痘弱毒株病毒的BHK-21细胞，进行同源重组。利用X-gal蓝白斑筛选重组山羊痘病毒rGPV-B2L。应用PCR、间接免疫荧光和Western免疫印迹等方法对重组病毒进行检测与鉴定。通过TCID50对该重组病毒的理化特性进行评价。实验结果显示：本研究成功构建了重组病毒转移载体。通过蓝白斑筛选纯化获得了重组山羊痘病毒rGPV-B2L，并且连续传代20次后重组病毒B2L基因能够在BHK细胞中稳定的复制、转录及表达。理化特性检测显示该重组病毒经55℃30min或紫外照射60min即可被灭活，且对强酸、强碱、有机溶剂等较敏感。3.初步评价重组山羊痘病毒的毒力及免疫效果。为了评价该重组病毒作为候选疫苗的免疫效果，本文采用初免-加强免疫的策略对6-8周龄的雌性小鼠进行皮下注射，通过间接ELISA检测小鼠血清中的特异性抗体水平，通过双夹心ELISA评估其细胞免疫和体液免疫水平，同时通过攻毒实验对该重组病毒的免疫保护力进行评价。结果显示：重组病毒候选疫苗首免后1周，血清中即可检测到B2L特异性抗体；加强免疫后，血清中的抗体水平显着升高，表明该重组病毒可激发较高的体液免疫。对IFN-γ和TNF-α等细胞因子的检测结果显示，该重组病毒也可强烈地激活机体细胞免疫应答。因此，本研究证实该重组病毒候选疫苗能够刺激小鼠产生特异性的细胞免疫应答和体液免疫应答。此外，我们通过攻毒实验对重组病毒的保护力进行评价发现，本研究构建的重组病毒候选疫苗能够提供有效地免疫保护作用。该研究结果为今后进行本体动物的免疫试验及临床的初步应用提供理论依据，同时也为ORFV免疫特性的阐明奠定基础。本研究结果表明我们成功分离到羊传染性脓疱病毒，并且获得了可稳定表达羊传染性脓疱病毒B2L基因的重组山羊痘病毒疫苗候选株，其具有一定的免疫原性，对ORFV具有一定的抵抗能力，为今后制备羊传染性脓疱-羊痘基因工程活载体疫苗奠定基础，使同时预防山羊痘和羊传染性脓疱病成为可能。
董罡[8]（2013）在《猕猴B病毒流行病学调查及其囊膜蛋白表达与表位检测》文中研究指明B病毒是动物源性传染性疾病，在自然宿主（猴）中的感染率高（血清学阳性率为10%60%），对人的致死性强（死亡率超过70%）；此外，B病毒属于生物安全4级病原，是潜在的生物战剂。因此，B病毒已成为实验猴质量和相关从业人员安全的严重威胁。当前，受困于B病毒基础研究的不足，准确诊断和有效防治一直裹足不前。有鉴于此，本课题以中国源猕猴的B病毒流行病学调查为基础，以诱导机体免疫应答的主要靶点——B病毒囊膜蛋白gC和gD为重点，以B病毒诊断和防治为目的，研究了B病毒在我国实验猴群中的流行病学特点；克隆表达了囊膜蛋白gC和gD基因，探讨了重组蛋白的诊断价值；制备和纯化了gC和gD的抗体，研究了抗体对病毒感染的影响；鉴定了gC和gD的抗原表位，为B病毒的防治奠定了基础。1．中国源猕猴感染猴B病毒的流行病学调查从四川、北京、海南、和广西收集的953份不同年龄阶段猴血清，检测血清中是否存在B病毒抗体。结果显示：344份血清抗体阳性，阳性率为36.1%；就实验猴群而言，不同猴群的B病毒感染率差异较大（最低为10.4%，最高为48.2%）；就年龄而言，12岁龄猴群的抗体阳性率明显低于成年猴群（阳性率分别为18.4%和53.2%）。对13份B病毒抗体阳性猴的血清和三叉神经组织DNA进行PCR检测，结果显示：仅4份动物的三叉神经组织DNA样品为PCR阳性（30.8%）；扩增产物分析表明，gL基因的GC含量为64.1%，gD为74.2%，且gL的扩增条件和效果明显优于gD。说明B病毒感染猴后将在部分动物神经节中建立潜伏，而gL基因更适合作为分子鉴定的靶标。2．B病毒囊膜蛋白gC和gD的克隆、表达及诊断价值评价利用扩增的gC和gD基因，构建原核表达载体pET-28b（+）-gC和pET-28b（+）-gD，在IPTG诱导下获得大小约为46KDa以包涵体形式表达的gD重组蛋白；pET-28b（+）-gC未见目的蛋白表达。以优化后的gC基因密码子序列，获得约为50KDa的gC重组蛋白。利用重组蛋白gC和gD，通过ELISA反应条件优化，建立了血清抗体的ELISA检测方法。其中，重组蛋白gC和gD的最适包被量分别为150ng/孔和100ng/孔，待测血清稀释度为1:810，兔抗猴IgG-HRP的工作浓度为1：30000。所建立的gC-ELISA敏感性和特异性分别为83.3%和100%，gD-ELISA为100%和90.0%；同比例混合gC和gD，敏感性可提高到100%，特异性为95.0%。3．猴B病毒囊膜蛋白gC和gD抗体制备及表位研究利用重组蛋白gC和gD免疫小鼠制备抗血清，同时采用亲和层析从B病毒阳性猴血清中纯化gC和gD抗体。细胞感染实验显示，只有gD抗体能抑制病毒感染，而gC抗体作用不明显。利用生物信息学软件分别在gC和gD蛋白上发现7、7个可能的抗原表位，合成表位肽段并经B病毒阳性血清证实，gD蛋白上的4个肽段(46LPPLEQKTD54、106RGAPEATRSDA116、291PELAPEERGTSRTPGD306和361AVYLVRRRGR370)和gC蛋白上的3个肽段(32STPAGRPGASRPGGVKRANR51、53AAPARGRGSSNGTGPGSTSAQFRCRRPD81和298RDSVSFSRRNAT309)都能与阳性血清反应，表位肽的敏感性为40.0%80.0%，特异性均为100%。
鞠斌[9]（2013）在《携带HIV-1 pol基因的新型SHIV嵌合病毒的构建及生物特性分析》文中认为人类免疫缺陷病毒1型（Human immunodeficiency virus1, HIV-1）和艾滋病（Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS）发现至今已有三十余年,目前仍然严重威胁着人类的健康和生命。现阶段HIV疫苗研发尚未成功,临床上抗病毒治疗仍然占据主导地位；现有抗HIV药物和治疗方案虽然能够有效抑制感染者及病人体内病毒复制,降低病毒载量,延缓疾病进程和延长病人寿命,但是仍然无法完全清除感染者及病人体内潜伏病毒。原因在于,HIV作为逆转录病毒,其逆转录酶缺乏校正活性,在体内复制的过程中产生大量变异,在临床治疗过程中,这些残余病毒在药物选择压力下产生耐药突变累积,造成病毒载量反弹,这是艾滋病患者抗病毒治疗失败的主要原因。因此,新药研发和组合用药方案的评估工作势在必行,体内药物有效性评价在指导临床用药方面起着至关重要的作用。然而目前,临床上研究分析受到一些不确定因素的影响,如无法长期监测病人体内病毒变异和耐药性突变,同时动物模型中缺乏合适的靶标病毒,二者共同制约了该领域研究的发展。针对此现状,本研究从以下两个方面展开：第一部分,以艾滋病恒河猴药物模型为基础,探究体内病毒长期变异及耐药性突变的产生机制；第二部分,构建涵盖多个艾滋病药物靶点的嵌合病毒,用于组合药物筛选研究。一方面,在本实验室建立的RT-SHIV、SIV恒河猴药物评价模型的基础上通过监测给药期间与给药前或者给药后血浆病毒,发现RT-SHIV/TC模型G1102V、G1104V、G1105V和G1106V,以及RT-SHIV/AE模型G1109V体内病毒对齐多拉米双夫定敏感性下降,SIVmac239模型RM39、090671、090665和081363对PMPA敏感性下降,提示体内耐药病毒株的出现。为系统监测RT基因耐药位点的变化,本研究建立了一种能从感染猴血浆中扩增全长rt基因的PCR方法。使用BioEdit和DNAMAN软件进行氨基酸序列比对,发现G1102V在给药过程中体内病毒发牛17处氨基酸改变,其中M184V为一处已知的抗胞嘧啶类似物药物拉米夫定（3TC）突变位点,1215T为一处T215的回复突变,该突变本身不会影响病毒对核苷类逆转录酶抑制剂的敏感程度,但是提示体内可能存在一些像T215Y/F这样的抗拉米夫定（3TC）突变的存在；G1109V猴体内病毒在给药前就发生了6处氨基酸突变,虽然没有发现已知的抗齐多拉米双夫定的耐药突变位点,但很可能存在一些潜在的耐药突变,并在药物的选择压力下累积,从而造成了该猴在给药过程中血浆病毒载量反弹：SIVmac239感染的4只猴在给药之后体内病毒共有8处氨基酸改变,其中S205L和M502I共同存在于4只猴中,提示可能为抗PMPA潜在的耐药突变位点。另一方面,以SIVmac239全长质粒为骨架,利用基因工程手段替换进HIV-1完整pol基因共得到9株嵌合病毒质粒,同时含有HIV-1蛋白酶、逆转录酶和整合酶3个药物靶点,拟用于多种药物组合用药评估；转染293T细胞,收集转染上清,发现8株嵌合病毒均能高水平表达SIV骨架上的Gag P27蛋白,同时两株嵌合病毒SHIV-pol-NL43和SHIV-pol-32具有逆转录酶活性；分别感染TZM-b1细胞和CEMx174细胞鉴定其感染和复制能力,结果发现在检测的时间段内感染和复制能力较弱。通过定点突变技术将SHIV-pol-32质粒上由于构建过程中酶切位点的引入而造成的一处氨基酸改变回复得到SHIV-pol-32-XCApa,感染CEMx174细胞的第9天可以在细胞表面检测到病毒蛋白,说明成功构建一株具有感染性SHIV-pol病毒株,进一步细胞和动物水平传代适应,以获得感染和复制能力较强的嵌合病毒株,本研究为构建新型艾滋病药物模型奠定了基础。综上所述,本次研究完善了RT-SHIV和SIV/恒河猴药物评价模型,发现了一些已知的和潜在的与耐药性相关的突变位点。构建得到了一系列的替换进HIV-1全长pol基因的SHIV-pol嵌合病毒,本研究为优化现有艾滋病药物模型提供了必要信息,为探索构建新型艾滋病药物模型奠定了基础。
董罡,袁菊芳,叶华虎,徐刚,孙波,喻元,聂奎,韩文瑜[10]（2012）在《猴B病毒血清学和PCR检测结果比较》文中研究表明目的:比较猴B病毒血清抗体和病毒PCR检测结果,阐明动物感染后病毒在机体内的存在状况。方法:采集成年猴血清和三叉神经组织,首先通过ELISA方法检测血清中B病毒抗体,然后采用B病毒gL和gD基因引物通过PCR方法扩增血清DNA和三叉神经组织DNA,比较2种方法的检测结果,并对扩增产物进行序列分析。结果:22份猴血清中,B病毒抗体呈阳性的有13份（59.1%）;PCR结果显示,抗体阴性动物及所有血清DNA模板中均无阳性扩增,但在13份抗体阳性动物的三叉神经组织DNA样品中,PCR阳性4份（30.8%）;gL和gD基因扩增条件及产物分析表明,gL基因的GC含量为64.1%,gD为74.2%,且gL的扩增条件和效果明显优于gD。结论:B病毒感染猴后,将在部分动物神经节中建立潜伏,而gL基因更适合作为分子鉴定的靶标。
二、PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究（论文提纲范文）
（1）实时荧光定量和等温核酸扩增检测莲藕潜隐病毒技术的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 莲藕病毒病研究进展 |
| 1.1 莲藕潜隐病毒 |
| 1.2 黄瓜花叶病毒 |
| 1.3 莲藕条斑病毒 |
| 1.4 芋花叶病毒 |
| 1.5 苹果茎沟病毒 |
| 2 植物病毒检测技术研究进展 |
| 2.1 生物学检测法 |
| 2.2 电子显微镜检测 |
| 2.3 血清学检测 |
| 2.4 分子生物学检测 |
| 3 植物病毒运动研究进展 |
| 3.1 植物病毒胞间运输研究 |
| 3.2 植物病毒长距离运输分子机理 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 莲藕潜隐病毒检测体系的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR鉴定 |
| 2.2 实时荧光定量RT-PCR检测体系的建立 |
| 2.3 LAMP检测体系的建立 |
| 2.4 RT-RPA检测体系的建立 |
| 3 讨论 |
| 第三章 莲藕潜隐病毒在“僵藕”中的分布研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 “僵藕”顶芽中莲藕潜隐病毒的分布 |
| 2.2 “僵藕”主茎中莲藕潜隐病毒的分布 |
| 2.3 “僵藕”侧茎中莲藕潜隐病毒的分布 |
| 2.4 6株“僵藕”中莲藕潜隐病毒的浓度分析 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（2）江油附子乌头花叶病毒分子检测的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 乌头的研究概况 |
| 1.2 栽培中存在的主要问题 |
| 1.2.1 连作障碍 |
| 1.2.2 乌头的病虫害及防治 |
| 1.3 植物病毒病研究进展 |
| 1.4 黄瓜花叶病毒研究进展 |
| 1.5 乌头花叶病研究进展 |
| 1.6 病毒检测方法 |
| 1.6.1 生物学检测法 |
| 1.6.2 电子显微镜检测方法 |
| 1.6.3 血清学方法 |
| 1.6.4 分子生物学方法 |
| 1.6.5 环介导等温扩增技术(La MP) |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料、试剂及仪器 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试剂的配制及试验工具前处理 |
| 2.2.2 RT-PCR检测病害乌头植株 |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR分析CMV在乌头不同部位表达量 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 RT-PCR检测病害乌头植株 |
| 3.1.1 病株表型 |
| 3.1.2 RNA提取及检测 |
| 3.1.3 cDNA检验 |
| 3.1.4 RT-PCR反应 |
| 3.1.5 连接及转化 |
| 3.1.6 测序得到目标序列 |
| 3.2 荧光定量PCR |
| 3.2.1 内参基因筛选 |
| 3.2.2 荧光定量检测CMV |
| 3.3 序列比对 |
| 3.4 CMV-FZ基因序列分析 |
| 3.4.1 对CMV-FZ进行结构域查找 |
| 3.4.2 对CMV-FZ进行ORF查找 |
| 3.4.3 CMV-FZ理化性质分析 |
| 3.4.4 蛋白疏水性分析 |
| 3.4.5 跨膜蛋白预测 |
| 3.4.6 CMV-FZ亚细胞定位 |
| 3.4.7 信号肽预测 |
| 3.4.8 蛋白二级结构查找 |
| 3.4.9 蛋白三级结构预测 |
| 3.5 蛋白motif分析 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的与学位论文内容相关的学术论 |
| 参考文献 |
（3）猴B病毒血清学检测方法的比较及表位研究（论文提纲范文）
| 第一部分 猴B病毒血清学检测方法的比较 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1. 猴B病毒感染 |
| 2. B病毒的分子生物学特性 |
| 3. B病毒的检测现状 |
| 3.1 国内检测方法研究现状 |
| 3.2 国外检测方法研究现状 |
| 材料和方法 |
| 1. 恒河猴样本血清 |
| 2. HSV-1病毒抗原的生产和纯化以及所建立的WESTERN BLOT检测方法 |
| 2.1 HSV-1病毒抗原的生产和纯化 |
| 2.2 Western Blot检测方法的建立 |
| 3 免疫荧光法(IFA)检测方法 |
| 3.1 HSV-1抗原片的制备 |
| 3.2 HSV-1-IFA方法 |
| 4. HSV-1免疫酶法(IEA)检测方法 |
| 5. 酶联免疫吸附法(ELISA) |
| 6. HSV-1 GC1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法 |
| 结果 |
| 1. HSV-1病毒蛋白经SDS-PAGE展示可显示血清样品中抗病毒抗体特异结合 |
| 2. 初筛检测方法的比较 |
| 3. 可疑血清样品的判定 |
| 讨论 |
| 第二部分 猴B病毒诊断表位的研究 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1. 标准样品库的建立 |
| 2. 生物信息学预测表位的设计和合成 |
| 2.1 差异表位和可能线性表位的序列设计 |
| 2.2 多肽阵列芯片的合成(北京博肽未名生物科技有限公司) |
| 3. 跨叠多肽阵列的设计和合成 |
| 4. 多肽芯片的杂交实验 |
| 5. 肽段ELISA检测方法的建立 |
| 6. BV-ELISA检测B病毒抗体(商品试剂盒,购买自珠海经济特区海泰生物制药有限公司) |
| 7. HVP2-ELISA检测B病毒抗体(商品试剂盒,购买自苏州西山生物技术有限公司) |
| 结果 |
| 1. 优选生物信息学预测表位做后续分析 |
| 1.1 多肽芯片的合成 |
| 1.2 预测表位的筛选 |
| 2. 表位的鉴定 |
| 2.1 生物信息学预测表位的鉴定 |
| 2.2 跨叠多肽表位的鉴定 |
| 3. 肽段ELISA参数优化 |
| 4. 已鉴定表位的敏感性评价 |
| 4.1 Cut off值的判定 |
| 4.2 多样本的肽段ELISA检测及与传统ELISA方法的比较 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 个人信息 |
| 致谢 |
（4）实验动物金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体多重PCR检测方法的建立与初步应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 多重PCR在实验动物病原体质量控制中的应用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）神农架金丝猴常见病流行病学初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 (Abbreviation) |
| 1. 前言 |
| 1.1 问题的由来 |
| 1.2 文献综述 |
| 1.2.1 金丝猴疾病研究进展 |
| 1.2.1.1 金丝猴分类与生物学特性 |
| 1.2.1.2 金丝猴疾病的研究进展 |
| 1.2.2 非人灵长类结核病诊断方法研究进展 |
| 1.2.2.1 X-光胸透 |
| 1.2.2.2 结核菌素皮肤试验 |
| 1.2.2.3 血清学诊断方法 |
| 1.2.2.4 细菌学检测 |
| 1.2.2.5 分子生物学检测方法 |
| 1.2.2.6 IFN-γ 体外释放法 |
| 1.2.2.7 展望 |
| 1.2.3 致泻性大肠杆菌概述 |
| 1.2.3.1 致泻性大肠杆菌分类及毒力基因 |
| 1.2.3.2 致泻性大肠杆菌致病性 |
| 1.2.4 非人灵长类动物常见病毒性疾病 |
| 1.2.4.1 胃肠道病毒感染 |
| 1.2.4.2 猴疱疹病毒感染 |
| 1.2.4.3 肝炎病毒感染 |
| 1.2.4.4 反转录病毒感染 |
| 1.3 研究目的 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 猴结核IFN-γ 体外释放检测法的建立与初步应用 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 细胞株、免疫原与实验动物 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.1.3 主要相关溶液的配制 |
| 2.1.1.4 主要仪器 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.1.2.1 猕猴IFN-γ 单克隆抗体的制备 |
| 2.1.2.2 Mm IFN-γ 单克隆抗体的鉴定 |
| 2.1.2.3 Mm IFN-γ 多克隆抗体的制备 |
| 2.1.2.4 Mm IFN-γELISA检测方法的建立 |
| 2.1.2.5 猕猴临床样本结核病的检测 |
| 2.1.2.6 金丝猴临床样本结核病的检测 |
| 2.2 神农架金丝猴粪便中致泻性病原的分离鉴定 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 样品 |
| 2.2.1.2 试剂及主要仪器 |
| 2.2.1.3 培养基及主要溶液的配制 |
| 2.2.1.4 实验动物 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 分离纯化 |
| 2.2.2.2 大肠PCR分群 |
| 2.2.2.3 毒力基因检测 |
| 2.2.2.4 O抗原血清型鉴定 |
| 2.2.2.5 分离菌株对小鼠的毒力试验及LD50 测定 |
| 2.2.2.6 药敏试验 |
| 2.3 神农架金丝猴常见病毒病血清流行病学初步调查 |
| 2.3.1 材料 |
| 2.3.1.1 样品来源 |
| 2.3.1.2 试剂及主要仪器 |
| 2.3.2 方法 |
| 2.3.2.1 RhCMV、SVV和Coxsackievirus抗体检测方法 |
| 2.3.2.2 HAV竞争ELISA检测方法 |
| 2.3.2.3 斑点免疫印迹法 |
| 3. 结果与分析 |
| 3.1 猴结核IFN-γ 体外释放检测法的建立与初步应用 |
| 3.1.1 MmIFN-γ 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.1.1 免疫小鼠融合前效价 |
| 3.1.1.2 杂交瘤细胞的筛选及克隆 |
| 3.1.1.3 单克隆抗体的纯化 |
| 3.1.2 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.1.2.1 单克隆抗体的亚型测定 |
| 3.1.2.2 单克隆抗体效价的测定 |
| 3.1.2.3 单克隆抗体和多克隆抗体Western blot分析 |
| 3.1.3 MmIFN-γ 多克隆抗体的制备及效价测定 |
| 3.1.4 MmIFN-γ ELISA检测方法的建立 |
| 3.1.4.1 单抗和多抗最佳工作浓度的确定 |
| 3.1.4.2 Mm IFN-γ 单克隆抗体敏感度的测定 |
| 3.1.4.3 猕猴结核IFN-γ 体外释放检测法的建立 |
| 3.1.5 猕猴临床样本结核病的检测 |
| 3.1.6 金丝猴临床样本结核病的检测 |
| 3.2 神农架金丝猴粪便中致泻性病原的分离鉴定 |
| 3.2.1 沙门氏菌和志贺氏菌分离鉴定 |
| 3.2.2 致泻性大肠培养特性和生化反应 |
| 3.2.3 大肠杆菌PCR分群 |
| 3.2.4 致泻性大肠杆菌毒力相关基因检测 |
| 3.2.5 O抗原血清型鉴定 |
| 3.2.6 分离菌株对小鼠的毒力试验及LD50 测定 |
| 3.2.7 药敏试验 |
| 3.3 神农架金丝猴常见病毒病血清流行病学初步调查 |
| 3.3.1 部分病毒抗体间接ELISA检测结果 |
| 3.3.2 部分病毒抗体斑点免疫印迹试验检测结果 |
| 3.3.3 病毒抗体检测结果分析 |
| 3.3.3.1 病毒感染的整体情况 |
| 3.3.3.2 病毒感染率与年龄关系 |
| 4. 讨论 |
| 4.1 猴结核IFN-γ 体外释放检测法的建立与初步应用 |
| 4.2 神农架金丝猴粪便中致泻性病原的分离鉴定 |
| 4.3 神农架金丝猴常见病毒病血清流行病学初步调查 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和撰写论文情况 |
| 致谢 |
（6）猴B病毒gD蛋白表达、纯化及单克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究现状 |
| 1.2.1 猴B病毒的生物学特征 |
| 1.2.2 猴B病毒的病毒增殖周期 |
| 1.2.3 猴B病毒的理化特征 |
| 1.2.4 猴B病毒的基因组结构 |
| 1.2.5 猴B病毒的细胞培养 |
| 1.2.6 致病性及临床症状 |
| 1.2.7 猴B病毒的检测方法 |
| 1.2.8 猴B病毒的治疗与预防 |
| 1.2.9 单克隆抗体在猴B病毒研究中的应用 |
| 1.3 抗原与抗体 |
| 1.3.1 抗原简介 |
| 1.3.2 抗原的制备 |
| 1.3.3 抗体简介 |
| 1.3.4 抗原与抗体的反应 |
| 1.3.5 抗体的制备 |
| 1.3.5.1 多克隆抗体的制备 |
| 1.3.5.2 单克隆抗体的制备 |
| 1.4 免疫分析 |
| 1.4.1 Western blot分析方法 |
| 1.4.2 酶联免疫吸附分析方法 |
| 1.4.3 间接免疫荧光分析方法 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 1.6 实验技术路线图 |
| 第二章 猴B病毒重组gD蛋白的原核表达 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株载体与酶类 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要试剂配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因BV-gD基因的获得 |
| 2.2.2 pET-32a-gD重组质粒的提取 |
| 2.2.3 重组质粒双酶切和菌液PCR验证 |
| 2.2.4 重组质粒转化E.coli Rosetta (DE3)感受态细胞 |
| 2.2.5 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.6 确定表达产物在细胞内存在形式 |
| 2.2.7 重组蛋白的大量表达 |
| 2.2.8 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.9 蛋白浓度的测定(BCA方法) |
| 2.2.10 目的蛋白的Western-Blot验证 |
| 2.2.11 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 BV-gD基因的获得 |
| 2.3.2 重组质粒pET-32a-gD的酶切鉴定 |
| 2.3.3 重组蛋白的诱导表达及可溶性分析 |
| 2.3.4 重组蛋白的纯化条件 |
| 2.3.5 重组蛋白浓度的测定结果 |
| 2.3.6 目的蛋白的Western-Blot验证结果 |
| 2.3.7 间接ELISA检测方法的建立 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 抗BV单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物和细胞 |
| 3.1.2 实验试剂 |
| 3.1.3 实验溶液的配制 |
| 3.1.4 实验仪器 |
| 3.1.5 免疫小鼠及多抗血清效价检测 |
| 3.1.6 SP2/0骨髓瘤细胞的准备 |
| 3.1.7 免疫脾细胞以及饲养细胞的制备 |
| 3.1.8 细胞融合 |
| 3.1.9 杂交瘤细胞上清检测 |
| 3.1.10 杂交瘤细胞的克隆化(有限稀释法) |
| 3.1.11 杂交瘤细胞的冻存与复苏 |
| 3.1.12 BV单克隆抗体细胞上清效价测定 |
| 3.1.13 BV单克隆抗体的亚型鉴定 |
| 3.1.14 BV单克隆抗体腹水制备及其抗体效价测定 |
| 3.1.15 HSV-2病毒的培养 |
| 3.1.16 单克隆抗体纯化及浓度测定 |
| 3.1.17 间接免疫荧光验证单抗与HSV-2gD同源蛋白的特异性 |
| 3.1.18 Western-Blot鉴定单抗对病毒编码蛋白的反应性 |
| 3.1.19 单克隆抗体稳定性鉴定 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 间接ELISA法检测多抗血清效价 |
| 3.2.2 杂交瘤细胞株的建立 |
| 3.2.3 单克隆抗体细胞上清效价的测定 |
| 3.2.4 单克隆抗体亚型鉴定结果 |
| 3.2.5 单克隆抗体腹水效价测定 |
| 3.2.6 单克隆抗体纯化及浓度测定 |
| 3.2.7 HSV-2病毒培养 |
| 3.2.8 五株单抗的间接免疫荧光验证结果 |
| 3.2.9 五株单抗的Western-Blot验证结果 |
| 3.2.10 gD重组蛋白单克隆抗体的稳定性分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
| 附录B 其他需要说明的内容 |
（7）羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒的构建及初步评价（论文提纲范文）
| 导师评阅表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 综述一 羊传染性脓疱病毒的研究进展 |
| 1 羊传染性脓疱病毒概况 |
| 2 ORFV 的分子生物学研究现状 |
| 3 ORFV 疫苗研究进展 |
| 综述二 山羊痘病毒载体研究进展 |
| 1 山羊痘病毒概述 |
| 2 山羊痘病毒基因组结构 |
| 3 山羊痘病毒载体研究现状 |
| 第二章 实验研究 |
| 实验一 ORFV 的分离鉴定及遗传进化分析 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验二 羊传染性脓疱病毒 B2L 基因重组山羊痘病毒的构建及生物学特性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 实验三 重组山羊痘病毒 rGPV-B2L 毒力及免疫效果的初步评价 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）猕猴B病毒流行病学调查及其囊膜蛋白表达与表位检测（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 1.1 猴 B 病毒的基本结构和特性 |
| 1.1.1 猴 B 病毒发现及其分类 |
| 1.1.2 猴 B 病毒的结构特征及其超微结构 |
| 1.1.3 B 病毒的分子生物学特性 |
| 1.1.4 猴 B 病毒的生活周期与潜伏感染 |
| 1.2 猴 B 病毒的发病机理 |
| 1.2.1 猴群中猴B病毒的感染 |
| 1.2.2 B病毒对人的感染 |
| 1.3 猴 B 病毒感染的检测 |
| 1.3.1 病毒学方法 |
| 1.3.2 分子生物学方法 |
| 1.3.3 血清学方法 |
| 1.4 B 病毒的预防与治疗 |
| 参考文献 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 中国源猕猴感染猴 B 病毒的流行病学调查 |
| 第一节 我国不同地区实验猕猴的 B 病毒流行病学调查 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 试验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 B 病毒感染后在机体内的存在形式 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 本章小结 |
| 第二章 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的克隆、表达及诊断价值评价 |
| 第一节 B病毒囊膜蛋白gC和gD基因克隆 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 重组 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的制备 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三节 重组蛋白 gC 和 gD 的诊断价值评价 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 实验结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 本章小结 |
| 第三章 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 抗体制备及表位研究 |
| 第一节 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的抗体制备及其对病毒感染的影响 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二节 B 病毒囊膜蛋白 gC 和 gD 的表位分析及鉴定 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 本章小结 |
| 全文总结 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（9）携带HIV-1 pol基因的新型SHIV嵌合病毒的构建及生物特性分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 主要英文缩写词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 一 引言 |
| 二 实验材料 |
| 三 实验方法 |
| 四 实验结果 |
| 五 讨论 |
| 第二部分 |
| 一 引言 |
| 二 实验材料 |
| 三 实验方法 |
| 四 实验结果 |
| 五 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人基本情况 |
| 硕士期间论文发表及参会情况 |
（10）猴B病毒血清学和PCR检测结果比较（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 猴B病毒抗体的免疫酶法学检测 |
| 1.3 猴B病毒基因组DNA的提取 |
| 1.4 猴B病毒的PCR检测 |
| 1.5 PCR扩增产物分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 猴B病毒血清抗体检测结果 |
| 2.2 猴B病毒gL、gD基因PCR反应条件的优化 |
| 2.3 猴B病毒gL基因的扩增 |
| 2.4 猴B病毒gD基因的扩增 |
| 2.5 PCR产物测序及序列分析 |
| 2.6 PCR法与免疫酶法对猕猴感染猴B病毒检测结果的阳性率比较 |
| 3 讨论 |
四、PCR在猴B病毒鉴定中的应用研究（论文参考文献）
- [1]实时荧光定量和等温核酸扩增检测莲藕潜隐病毒技术的建立与应用[D]. 吴伟文. 扬州大学, 2019(02)
- [2]江油附子乌头花叶病毒分子检测的研究[D]. 何静. 西南科技大学, 2018(02)
- [3]猴B病毒血清学检测方法的比较及表位研究[D]. 李晋文. 北京协和医学院, 2017(02)
- [4]实验动物金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和肺支原体多重PCR检测方法的建立与初步应用[D]. 王鹏飞. 河北医科大学, 2016(04)
- [5]神农架金丝猴常见病流行病学初步研究[D]. 汪乾坤. 华中农业大学, 2015(02)
- [6]猴B病毒gD蛋白表达、纯化及单克隆抗体的制备[D]. 孙涛. 昆明理工大学, 2015(05)
- [7]羊传染性脓疱病毒B2L基因重组山羊痘病毒的构建及初步评价[D]. 张倩. 石河子大学, 2014(03)
- [8]猕猴B病毒流行病学调查及其囊膜蛋白表达与表位检测[D]. 董罡. 吉林大学, 2013(08)
- [9]携带HIV-1 pol基因的新型SHIV嵌合病毒的构建及生物特性分析[D]. 鞠斌. 北京协和医学院, 2013(S2)
- [10]猴B病毒血清学和PCR检测结果比较[J]. 董罡,袁菊芳,叶华虎,徐刚,孙波,喻元,聂奎,韩文瑜. 生物技术通讯, 2012(06)