一、引起成人腹泻的新轮状病毒在原代人胚肾细胞上的培养和传代（论文文献综述）
杨立君[1]（2021）在《湖北部分地区不同宿主源轮状病毒的分离及其基因组的遗传变异研究》文中研究指明轮状病毒（Rotavirus,RV）可以感染猪、牛、犬猫等多种幼龄哺乳动物,引起腹泻,也可导致5岁以下儿童和婴幼儿感染急性胃肠炎,是一种重要的人畜共患病原体。但目前对不同宿主源轮状病毒相关研究较少,本研究以此为出发点,收集湖北部分地区人、猪、伴侣动物犬猫腹泻相关样品,开展RV的检测及其病原的分离鉴定,同时进行全基因组序列的测定,分析其11个基因片段的基因型,构建各基因片段的进化树,研究其各基因片段的遗传进化关系,以及猪、犬轮状病毒与人轮状病毒的交叉重配关系。主要研究结果如下:1.湖北地区RV流行情况本研究在2018年12月～2020年12月期间,对湖北武汉市、襄阳市和宜昌市的各医院、猪场和宠物医院的人、猪和犬腹泻相关样品和猪肠组织进行采集,共计513份,经RT-PCR检测结果表明,人RV阳性率21.63%（69/319）,猪RV阳性率为35.29%（6/17）,犬RV阳性率为1.12%（2/177）。进一步对阳性样品进行病毒分离鉴定及全基因组测定,了解RV在猪群、宠物犬及人中的感染情况以及其基因型和遗传特征的变化。以期进一步为不同宿主源RV的跨种间传播提供科学证据。2.RV的分离与鉴定为分离和获得RV流行毒株,本研究首先确定易感细胞的最佳胰蛋白酶耐受浓度,最后确定MA-104细胞对所有阳性样本进行RV的分离,使用终浓度为10μg/m L的胰蛋白酶溶液处理病毒液,之后维持液中添加终浓度为5μg/m L的胰蛋白酶。病料接种细胞后进行盲传分离,第6代培养物在接种细胞后48 h出现细胞聚集、皱缩、脱落和拉网状等明显的细胞病变。连续传至第10代后细胞病变呈现稳定的状态,经RT-PCR和间接免疫荧光鉴定为RV。进一步通过PCR扩增VP6基因测序表明,本研究成功分离到湖北地区11株HRV毒株和2株Po RV毒株。经空斑纯化稳定传代的2株Po RV毒株RVA/Porcine/CHN/HB-1/2019和RVA/Porcine/CHN/HB-7/2019的TCID50分别为105.63TCID50/m L、106.1TCID50/m L。结合分离株的全基因组测序结果,本研究首次在国内分离得到G9P[8]型Po RV毒株,为进一步研究G9P[8]型Po RV毒株的生物学特性奠定了基础,也为进一步分析其可能的遗传重配提供了实验材料和研究基础。3.RV的全基因组测序与重配分析为进一步研究成功分离到的11株G9P[8]型HRV毒株和2株G9P[8]型Po RV毒株的各基因片段的基因型及遗传进化关系,本研究共设计15对引物,采用RT-PCR的方法,获得分离株全基因组序列。基因组遗传进化分析显示,有8株G9P[8]HRV毒株在Wa-like的RV基因型中具有DS-1-like的NSP4 E2基因型,提示存在自然发生的基因组间重配现象。2株G9P[8]型Po RV毒株基因组遗传进化分析显示该猪源RV毒株的7个基因片段（VP4、VP1、VP2和NSP2-NSP5）与武汉的人源L2448株及本研究分离的11株G9P[8]型HRV毒株亲缘关系最近,VP7和VP6基因则与武汉的猪源TM-a毒株亲缘关系最近,提示猪和人轮状病毒毒株在中国湖北地区出现重配及跨种间传播的现象。
庞立丽,白爱英,卿钰,张佳艳,李伯阳,章青,李丹地,梁未丽,阚飙,段招军[2]（2020）在《人H组轮状病毒免疫荧光检测方法的建立》文中提出轮状病毒（Rotavirus,RV）是引起婴幼儿病毒性胃肠炎的主要病原体。目前,尚没有人H组轮状病毒（Rotavirus H,RVH）的免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测方法。本研究建立了检测人H组轮状病毒的免疫荧光方法,为研究轮状病毒感染以及与宿主免疫反应之间的作用机制提供技术支撑。本研究首先培养MA104恒河猴肾细胞,感染人H组轮状病毒J19毒株,对病毒进行培养;原核表达纯化病毒VP6蛋白,用纯化的VP6蛋白制备antiVP6抗体;以anti-VP6作为检测抗体,应用免疫荧光检测技术检测J19病毒在MA104细胞中的定位;并利用免疫荧光方法检测J19病毒的荧光灶形成单位（Fluorescence focus units,FFU）,对病毒进行定量。本方法为进一步检测和研究人H组轮状病毒感染机制提供技术条件。
李美霞[3]（2016）在《牛初乳抗轮状病毒的实验研究》文中进行了进一步梳理研究背景及目的轮状病毒（Rotavirus,RV）是球形立体、光滑、无包膜的双链RNA（dsRNA）病毒,属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属,根据VP6分为A-G组,其中A组主要引起婴幼儿严重腹泻,B、C组主要导致成人腹泻,D-G组主要感染各种动物。A组轮状病毒是引起感染性腹泻的重要病原体之一,占儿童肠道感染病因的50%以上。临床上主要采取口服补液及抗病毒治疗,目前尚无有效的抗轮状病毒药物。牛初乳具有促进生长发育、增强抵抗力、调节肠道菌群等作用。本研究主要探讨牛初乳体内抗轮状病毒的作用。方法牛初乳抗A组轮状病毒的实验研究:5日龄ICR乳鼠随机分为6组,每组12只。感染轮状病毒24h后,治疗组分别给予相应浓度的牛初乳和利巴韦林连续进行治疗7天。记录每天乳鼠体重变化及腹泻情况,同时收集乳鼠粪便并检测粪便中病毒滴度及使用试纸条金标法检测粪便中轮状病毒抗原。于感染后3天、7天取乳鼠血清及小肠组织。流式细胞仪检测乳鼠血清中IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF、IFN-γ和MCP-1的表达水平;分别取1DPI、3DPI、7DPI乳鼠小肠组织,检测其中的病毒载量;HE染色观察小肠组织形态学改变及测定空肠绒毛长度的改变;免疫组化观察乳鼠小肠中轮状病毒抗原的分布。结果和结论牛初乳高剂量组和联合治疗组与模型组相比可以增加腹泻乳鼠的体重、减轻腹泻情况;联合治疗组明显降低粪便中RV毒力;在急性感染期牛初乳高剂量组降低乳鼠血清中IL-6、IL-10和IFN-γ的表达,减轻炎症反应,在恢复期牛初乳高剂量组和联合治疗组IL-10、IFN-γ恢复至正常对照组水平（P>0.05）;实时荧光定量PCR结果表明,在感染初期病毒载量无明显变化,在急性感染期及恢复期,治疗组可以抑制小肠组织中病毒复制,其中在急性感染期抑制效果较明显;HE及免疫组化结果表明牛初乳可以抑制小肠组织中轮状病毒抗原的表达,改善小肠绒毛的空泡样、充血、水肿及炎性细胞的浸润等病理损伤。
欧阳雅博[4]（2010）在《天津市腹泻儿童病毒感染情况分析及污水中肠道内病毒的检测》文中认为研究目的:腹泻病作为一个普遍的公众健康问题,仍是导致全球儿童发病和死亡的最重要主要病因。病毒是5岁以下儿童腹泻的主要病因。污水中可能含有大量的病毒性病原体,一些重要的介水传播性病毒包括肠道病毒可通过粪-口途径传播。为了解天津市儿童腹泻病毒性病原体的流行情况,污水中肠道内病毒的存在状况,特开展此研究。研究方法:2008年4月2009年4月收集天津市儿童医院住院腹泻患儿的粪便标本,通过应用金标测试卡,ELASA,细胞培养,（RT-）PCR及测序技术来检测主要的致腹泻病毒性病原体及他们的分子特征,同时对住院儿童的人口学资料（包括性别,年龄,住址）,临床表现资料（如住院天数、腹泻、发热、呕吐、脱水等）进行描述,并探讨其与不同病毒感染的关系。用SPSS统计软件进行数据分析处理。用钙离子絮凝柠檬酸洗脱病毒浓缩法和膜吸附-牛肉汤洗脱病毒浓缩法对二级处理污水出水中病毒进行浓缩,应用（RT-）PCR技术检测浓缩液中病毒,测序确定基因型。研究结果:2008年4月2009年4月共有921例粪便标本用免疫学方法检测轮状病毒及星状病毒。其中的766例通过（RT-） PCR检测腺病毒及人类杯状病毒。所有结果为病毒阳性（除外人类杯状病毒）的粪便标本通过细胞培养及（RT-） PCR进一步鉴定。细胞培养液中阳性的（RT-）PCR产物及粪便中人类杯状病毒的PCR产物用以测序。2008年4月2009年4月天津市住院腹泻患儿病毒感染率由高到低依次为:轮状病毒（28.56%）、腺病毒（17.62%）、诺如病毒（5.87%）及星状病毒（3.15%）。腹泻患儿粪便中病毒（1种以上）检出356例（356/766,46.48%）,其中混合病毒感染占17.42%（62/356）,检出最高的是轮状病毒和腺病毒混合感染34例（54.85%）,其次是轮状病毒和诺如病毒的混合感染11例（17.74%）,腺病毒和诺如病毒共同感染占11.29%（7 /62）,轮状病毒和星状病毒的混合感染占8.06%（5/62）,腺病毒和星状病毒共同感染占4.84%（3/62）,未发现诺如病毒和星状病毒的混合感染病例。有两个病例分别检出三种病毒的混合感染,即轮状病毒、腺病毒和诺如病毒的混合感染及轮状病毒、腺病毒和星状病毒的混合感染。G1型（41/54,75.93%）是轮状病毒感染的主要流行株,其次是G3（11/54,20.37%）、G2及G9分别为（1/54,1.85%）。腺病毒检出率最高型别为Ad41（26/30,86.67%）,剩余均为Ad1（4/30,13.33%）,Ad40未检出。诺如病毒的测序结果显示其全部属于GII型,80.65% （25/31）是GII-4/2006b,19.35%是GII-3（6/31）。星状病毒全部为HAstV-1型。356例病毒阳性的患儿包括119例（33.43%）女患儿及237例男患儿（66.57%）,但性别间检出率相似（分别为42.35%及48.87%）,中位数年龄为7月龄（极差,出生后1小时5岁）。病毒性腹泻以2岁以下患儿为主,但诺如病毒感染患儿的年龄中位数大于其他病毒感染。不同病毒感染患儿的居住地差异对病毒检出无影响。腹泻,呕吐及发热是病毒腹泻患儿中最常见的临床症状,混合病毒腹泻患儿的呕吐比例及脱水比例高于单一病毒感染。诺如病毒及轮状病毒腹泻的脱水比例高于其它腹泻。而星状病毒腹泻的住院时间长于其它病毒腹泻。病毒性腹泻患儿的粪便性状多为水样便,不同病毒感染间差异无统计学意义。多数病毒腹泻发生在第一季度及第四季度,而腺病毒腹泻高峰在第一和第三季度。2009年天津市纪庄子污水处理厂的二级处理出水中检出了甲肝病毒,1型脊髓灰质炎病毒及G6型轮状病毒。三种病毒均在第四季度检出,脊髓灰质炎病毒另一例在第一季度检出。结论:本研究提供了天津市住院病毒性腹泻患儿完整病原学信息及流行病学资料。本研究发现轮状病毒是最常见的婴幼儿腹泻病因,其次为腺病毒、诺如病毒及星状病毒。混合病毒感染对儿童腹泻有重要影响。二级处理出水中检测到不同的病毒类型。污水方面研究表明二级处理出水中病毒的检出可能会污染地表水进而危及人类健康。
马应霞[5]（2010）在《轮状病毒在KMB17细胞上的适应性培养及免疫原性研究》文中研究说明轮状病毒（rotavirus, RV）是引起世界范围内婴幼儿急性腹泻最主要的病原之一,也是造成发展中国家婴幼儿死亡的重要原因,占所有肠道感染病因的50%以上¨。按照内层衣壳蛋白VP-6的组特异性抗原表位不同,可将RV分为A-G7个组,其中A组RV是引起婴幼儿重症腹泻的主要原因。目前尚无治疗RV腹泻的特效药物,口服补液（ORS）治疗的效果也是有限的,特别对重症患儿并不能明显降低其死亡率。因此,世界卫生组织（WHO）认为,研发优质高效安全的RV疫苗是预防、控制RV感染唯一有效的手段。对于任何一种疫苗而言,其安全性和有效性都是疫苗本身最重要的基本要素,在研制疫苗时最大限度地考虑安全性非常重要。影响疫苗安全性的因素很多,其中用于制备疫苗的细胞基质是重要影响因素之一。一般而言,人源性细胞较其他动物源性细胞其安全性要高,但限于多方面的原因,许多疫苗尚不能用人源性细胞制备；但使用人源性细胞取代非人源性细胞制备疫苗是发展方向。轮状病毒疫苗在预防RV感染中发挥了重要作用,但目前国内外RV疫苗主要是在动物源性细胞制备的,用一种人源性细胞来制备RV疫苗是一值得研究的课题。本研究基于这一思路开展了相关探索,我们分别将在Vero细胞上培养的猴轮状病毒P[2]G3株（SA11株）和人轮状病毒P[8]G1株（Wa株）在KMB17细胞（一株用于人用疫苗生产的细胞株）上进行适应培养,各连续传代10代。结果显示,轮状病毒SA11株和Wa株经在KMB17细胞上适应培养后,随着传代代次的增高,细胞病变逐渐增快,病毒感染性滴度呈递增趋势,并稳定在较高水平。用荧光灶法测得SA1l株病毒滴度峰值达到7.751gCCID50／ml,Wa株病毒滴度峰值达到7.331gCCID50／ml。在连续传代的过程中,确定了病毒接种的最佳感染复数（multiplicity of infection, MOI）为0.05。电镜下观察可见典型的轮状病毒颗粒；免疫荧光证实了病毒能在KMB17细胞内复制增殖；且两株适应于KMB17细胞的病毒均可在MA104细胞中形成蚀斑。通过RT-PCR分别扩增两株病毒第1代和第10代的VP7基因测序表明,SA11株病毒VP7基因在传代过程中基因序列未发生改变,保持了良好的遗传稳定性；Wa株病毒VP7基因在传代过程中仅发生了一处基因突变,且为无义突变。用在KMB17细胞上适应培养的RV病毒免疫小鼠,经皮下注射和口服两种免疫途径均获得了针对病毒的特异性抗体,其中SA11株经皮下注射获得的抗体滴度达20480±8192,明显高于经口服免疫的抗体滴度（10240±4096）,经t检验,P<0.05；Wa株经皮下注射获得的抗体滴度为7186±2048,口服免疫获得的抗体滴度为6144±2364,经t检验,P>0.05,无显着差异。本研究成功地将两个血清型的轮状病毒SAll株和Wa株适应至KMB17细胞,并获得了较高感染性滴度的子代病毒,用复制的病毒免疫小鼠,经证实具有较好的免疫原性,为日后轮状病毒的大规模制备以及研制一种对人体更为安全的轮状病毒疫苗奠定了重要的基础。
殷坚[6]（2010）在《秦香颗粒对人轮状病毒致感染乳鼠血清IFN-γ、IL-2的影响研究》文中研究说明目的：通过观察秦香颗粒对HRV感染乳鼠血清中IFN-γ、IL-2的影响,研究秦香颗粒治疗HRV感染性腹泻的可能作用机制,为临床应用提供科学的理论和实验依据。方法：轮状病毒经口感染造模。将70只乳鼠按体重分层,再随机分为7组,每组10只,其中一组为正常组,其他6组造成HRV感染模型,分别为模型组、秦香高剂量组、秦香中剂量组、秦香低剂量组、病毒唑组、肠康片组,共7组。正常对照组常规饲养,其余6组分别灌服生理盐水,秦香颗粒高、中、低剂量,病毒唑及肠康片,每日3次,连续给药5d。观察各组乳鼠的一般情况；断头取血,采用ELISA法检测血清IFN-γ、IL-2水平；胶体金法检测粪便HRV抗原；HE染色后光镜下观察小肠粘膜细胞的病理改变。结果：①造模后12h胶体金法检测乳鼠粪便中HRV抗原,模型组为阳性,正常对照组为阴性；②一般情况观察：HRV感染后,模型组乳鼠活动减少、出现腹泻,体重增长缓慢或下降；正常组无腹泻、体重增长迅速。与模型组相比,各给药组乳鼠一般情况较好,其中以秦香高剂量组腹泻程度最轻。③各组乳鼠粪便HRV抗原转阴率：模型组转阴率为0,病毒唑组为87.5%,秦香高剂量组75%,秦香中剂量组62.25%,秦香低剂量组37.5%,肠康片组62.5%,组间比较无明显差异（P>0.05）。④血清INF-γ含量：与正常组相比,各造模组均有显着升高,差异非常显着（P<0.01）；与模型组相比,肠康片组、秦香中剂量组、秦香高剂量组可显着提高血清IFN-γ含量（P<0.05）,秦香低剂量组差异不明显（P>0.05）。秦香中、高剂量组提高血清IFN-Y的能力明显优于肠康片及病毒唑组（P<0.05）。⑤血清IL-2含量：与正常组相比,各造模组均有显着升高（P<0.01）；与模型组相比,肠康片组、病毒唑组、秦香高剂量组差异显着（P<0.05）,且秦香高剂量组优于病毒唑、肠康片组（P<0.01）。⑥细胞形态学观察示：正常组无异常,模型组小肠粘膜绒毛损伤、炎细胞浸润,各给药组小肠上皮细胞均有不同程度病变,但轻于模型组。各给药组组间比较,秦香高剂量组减轻小肠上皮细胞空泡程度的作用优于病毒唑组和肠康片组。结论：①HRV经口感染,可造成HRV感染腹泻模型；②秦香颗粒各剂量组均可改善HRV感染乳鼠一般情况、减轻腹泻症状,其中秦香高剂量作用优于病毒唑和肠康片。③秦香颗粒可以抑制HRV感染乳鼠粪便中的病毒抗原。④秦香颗粒可增强HRV感染乳鼠血清IFN-γ、IL-2的表达,并呈现一定的量效关系,这可能是秦香颗粒治疗HRV感染腹泻的部分途径。⑤秦香颗粒可以减轻小肠粘膜损伤和炎细胞浸润,可能是其治疗HRV腹泻的机制之一
王敏[7]（2008）在《基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究》文中研究指明A组轮状病毒（Group A Rotavirus,ARV）是引起全世界婴幼儿严重腹泻的最重要病原,在发展中国家,每年至少约600,000儿童死于轮状病毒感染。鉴于轮状病毒危害严重且缺乏有效治疗手段,世界卫生组织一直将发展轮状病毒疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一。由于腺病毒能感染呼吸道和肠道,在诱导全身免疫的同时产生局部粘膜免疫,安全可靠,可以通过口服或滴鼻给药,适于婴幼儿使用,因此,腺病毒载体轮状病毒基因工程疫苗具有良好的前景。我们实验室前期利用腺病毒载体表达轮状病毒保护性抗原,对轮状病毒基因工程疫苗进行了系统研究。我们课题组前期研究表明:用Ad5表达的轮状病毒的VP6和VP7基因,采用滴鼻或灌胃的给药方式,可以在小鼠实验模型上取得良好的细胞免疫和体液免疫效果,并对轮状病毒攻击鼠有一定的保护作用。但是,由于腺病毒对轮状病毒的野生型基因表达量比较低,因此,增强轮状病毒抗原的表达,优化免疫效果,降低重组腺病毒的用量,提高疫苗的安全性等诸多问题就成了发展该疫苗的重要课题。本文通过密码子优化,人工合成了轮状病毒的VP6,VP7基因,通过对蛋白表达量及免疫效果的比较,鉴定了密码优化确实提高了VP6,VP7蛋白的表达量,从而减少了病毒的用量。本研究还检测了口服腺病毒免疫后,不同时间点病毒在小鼠体内的分布,为该疫苗的进一步研究提供了实验资料。1.利用密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒基因的表达量ARV基因的密码子使用与人类密码子相差很远,其AT含量很高。大量研究证明,通过基因密码改造可以有效提高基因的表达量。我们对RV VP6、G1VP7、G2VP7和G3VP7 4个基因依据人的偏爱密码子进行了密码优化,人工合成了优化基因,利用腺病毒Ad5载体（AdEasy系统）在人胚肾细胞293中进行了表达。结果显示,经过密码子优化后,与野生型病毒基因相比,4个基因的蛋白表达量均有显着提高。同时,我们对这4种重组腺病毒进行了连续20代的传代培养,在连续传代过程中,插入的轮状病毒基因一直稳定存在和表达。重组腺病毒rvAdG2VP7（o）在连续传代15代后,重组腺病毒rvAdG1VP7（o）和rvAdG2VP7（o）在连续传代20代后检测到复制型腺病毒（Replication-Competent AdenovirusRCA）的存在。说明重组腺病毒在293细胞中连续传代具有良好的遗传稳定性,传代10代以内一般检测不到RCA,可望满足腺病毒载体疫苗的研发需要。2.密码子优化增强了轮状病毒VP6基因重组腺病毒的免疫效果在证实了通过密码子优化可以提高蛋白表达量后,我们以VP6基因为例,以表达野生型RVVP6基因的重组病毒rvAdVP6为对照,在小鼠模型上通过等量病毒（108TCID50/只/次）3次滴鼻免疫,观察了基因优化重组腺病毒rvAdVP6（o）的免疫效果。结果显示:（1）三次免疫rvAdVP6（o）产生的抗VP6血清IgG抗体水平均明显高于rvAdVP6,说明优化后的重组病毒产生了更强的体液免疫反应;（2）两种重组腺病毒均可诱导粘膜免疫,在肺灌洗液、肺匀浆液、肠匀浆液和粪便中均能检测出较高水平的特异性IgG和IgA,其中,rvAdVP6（o）肺灌洗液、肺匀浆液和粪便中的IgG和IgA水平均显着高于rvAdVP6;rvAdVP6（o）肠匀浆液IgG水平显着高于rvAdVP6,说明优化后的病毒产生了更强的粘膜免疫效果;（3）用ELISpot检测脾细胞培养上清中的γ干扰素（IFN-γ）,结果显示,rvAdVP6（o）产生的斑点数多于rvAdVP6产生的斑点数,说明优化后的病毒产生了更强的细胞免疫效果;（4）RV攻击后检测小鼠的排毒量,发现rvAdVP6（o）免疫组的RV排毒减少率明显高于rvAdVP6,说明优化后的病毒对小鼠的保护性也增强了。综上所述,在等量重组腺病毒免疫的情况下,优化后的VP6重组病毒在体液免疫、粘膜免疫、细胞免疫和攻毒保护方面,均优于优化前,可望在以后的疫苗应用中,达到减少病毒用量的目的。3.重组腺病毒口服免疫后在小鼠体内的生物分布为了探讨重组腺病毒作为口服疫苗的可行性,研究了经灌胃免疫后重组腺病毒在各组织器官中的分布以及抗原表达情况。将小鼠分为两组:rvAdVP6（o）免疫组和PBS对照组,每组70只小鼠,免疫后在7个时间点（4h、12h、1d、4d、7d、14d和28d）分别取5只小鼠,采集14种组织标本,用免疫组织化学方法检测腺病毒载体和轮状病毒VP6抗原,用荧光定量PCR检测腺病毒载体和轮状病毒VP6基因的存在。结果显示:用重组腺病毒灌胃免疫小鼠后,在4h～28d内,在肝、肾、脾、心脏、肺、大肠、小肠、胃、食管、舌、脑、气管、派氏结和卵巢14种组织标本中,均无明显的病理变化;免疫组织化学检测结果显示,只在4h时在大肠和小肠中检测到腺病毒和轮状病毒VP6抗原;荧光定量PCR在4h时在大肠、小肠、胃、食管和派氏结中检测到腺病毒载体和轮状病毒VP6基因;12h时后在大肠、小肠、胃和食管中仍能检测到腺病毒载体和轮状病毒VP6基因,但其拷贝数明显降低;1d后只在大肠和食管中检测到少量的腺病毒载体和轮状病毒VP6基因;在4d、7d后,食管、胃和大肠仍能检测到腺病毒载体基因的存在,其他组织中均检测不到;至14d时,只有在食管中仍能检测到腺病毒载体基因的存在,在其他组织中均检测不到。说明灌胃免疫后,腺病毒载体和VP6基因在小鼠体内可以表达,并在多种组织器官中存在。综上所述,本研究构建了4株表达轮状病毒密码子优化基因的VP6和VP7的重组腺病毒,与野生型基因相比,其在蛋白表达水平和免疫效果上均明显得到提高,在此基础上检测了灌胃免疫后,其在小鼠体内的分布情况,这些研究均未见报道。这些结果的获得,为研制我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗进一步奠定了基础。
李培京,崔晓英,纪绍忠[8]（2008）在《快速培养轮状病毒的提纯及电子显微镜下观察》文中研究说明建立轮状病毒的快速培养和电镜检查的方法。A组轮状病毒SA11株经含10μg/mL蛋白酶的DMEM激活后,在MA104细胞上培养一天,提纯,电镜观察。培养24小时的轮状病毒,提纯后电镜下可观察到大量完整和空心的轮状病毒。结果表明,此法快速培养的SA11病毒,负染后电镜观察很容易看到大量完整轮状病毒。
陈强[9]（2007）在《B组轮状病毒核酸杂交检测方法的建立及其初步应用》文中研究说明人B组轮状病毒（group B rotavirus，GBRV）由我国洪涛1983年首次发现，主要感染成年人，在我国多次引起大规模的暴发性腹泻的大流行。人群B组轮状病毒抗体水平调查结果显示，其他国家和地区人群中都检测到滴度不同的B组轮状病毒抗体。除了中国之外，在周边国家印度、孟加拉等国也相继从散发的霍乱样腹泻病例中检测到B组轮状病毒。本研究旨在建立一种方便、快捷、灵敏高、特异性强的检测技术和方法，用于B组轮状病毒的检测，有助于深入研究B组轮状病毒的生物学特征、流行病学规律、检测技术以及防治措施等。用PCR法对B组轮状病毒nsp5基因作同位素标记，测试探针的灵敏度和特异性，并用于检测腹泻样本。结果显示探针灵敏度达500pg，特异性好，不与无关的基因产生杂交信号。检测来源于武汉市的94例腹泻标本，其中阳性一例，用RT-PCR和序列测定的方法对该检测结果进行了验证。根据B组轮状病毒ADRV的vp7基因序列设计合成引物，在上、下游引物5’端标记生物素，用PCR法制备GBRV vp7基因片段的生物素标记探针，灵敏度达50ng，用同样的方法制备了地高辛标记探针，灵敏度达10ng，特异性好。本研究所采用的核酸杂交方法可用作B组轮状病毒的初筛，也可用来验证其它方法的检测结果，或是用于B组轮状病毒的流行病学研究。
胡英会,芦宝静,尹素改,陈强,王娜,杨继红[10]（2007）在《B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达与抗体的制备》文中进行了进一步梳理目的:在大肠杆菌中表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白并制备其兔抗血清。方法:根据B组轮状病毒（GBRV）WH-2株vp7基因的全序列设计引物,用PCR的方法扩增得到vp7基因的编码区。将其克隆到原核GST融合表达载体pGEX-KG内,转化大肠杆菌E.coliDH5α,IPTG诱导表达人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白,经SDS-PAGE分离纯化表达的蛋白免疫新西兰兔,制备人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白抗血清。结果:经鉴定确认,vp7基因以正确的方式插入到载体中,此重组表达载体经IPTG诱导后,可表达相对分子量为53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白。制备的抗血清经同样诱导表达的表达载体pGEX-KG表达产物吸收后1:500倍稀释后用Western Blot分析,与53.4 kDa的GST-VP7融合蛋白获得特异性显色信号。结论:人B组轮状病毒WH-2株VP7蛋白成功在大肠杆菌中GST融合表达,所表达的蛋白和制备的抗体不但为研究结构与功能提供了物质基础,也为GBRV所引起的疾病预防、诊断和治疗等流行病学研究和临床诊断奠定了基础,具有重要实际应用价值。
二、引起成人腹泻的新轮状病毒在原代人胚肾细胞上的培养和传代（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、引起成人腹泻的新轮状病毒在原代人胚肾细胞上的培养和传代（论文提纲范文）
（1）湖北部分地区不同宿主源轮状病毒的分离及其基因组的遗传变异研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语表(ABBREVIATION) |
| 1 文献综述 |
| 1.1 RV病原学特征 |
| 1.1.1 RV形态结构 |
| 1.1.2 RV培养特性 |
| 1.2 RVA分子生物学特性 |
| 1.3 RVA临床症状和发病机制 |
| 1.4 RVA分型 |
| 1.5 动物源RVA的跨种间传播到人 |
| 1.5.1 RVA跨种间传播的途径 |
| 1.5.2 猪RVA跨种间传播到人 |
| 1.5.3 猫和犬RVA跨种间传播到人 |
| 1.5.4 牛RVA跨种间传播到人 |
| 2 目的与意义 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 病料 |
| 3.1.2 细菌、毒株和细胞 |
| 3.1.3 载体 |
| 3.1.4 引物序列 |
| 3.1.5 主要试剂 |
| 3.1.6 培养基及相关试剂的配制 |
| 3.1.6.1 细菌培养及感受态细胞制备的相关试剂 |
| 3.1.6.2 细胞培养的相关试剂 |
| 3.1.6.3 其他相关试剂 |
| 3.1.7 分子生物学分析软件 |
| 3.1.8 主要实验仪器及设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 病料处理与组织破碎 |
| 3.2.2 病毒RNA提取 |
| 3.2.3 病毒基因组的反转录 |
| 3.2.3.1 RNA模板变性 |
| 3.2.3.2 第一链c DNA合成 |
| 3.2.4 病毒检测 |
| 3.2.4.1 PCR检测HRV |
| 3.2.4.2 PCR检测Po RV |
| 3.2.4.3 PCR检测CRV |
| 3.2.5 电泳检测PCR产物 |
| 3.2.6 RV VP6 基因扩增 |
| 3.2.7 PCR产物回收与纯化 |
| 3.2.8 外源DNA片段与载体的连接反应 |
| 3.2.9 大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法) |
| 3.2.10 连接产物转化 |
| 3.2.11 重组质粒的菌落PCR鉴定 |
| 3.2.12 质粒的小量制备 |
| 3.2.13 质粒的小量提取 |
| 3.2.14 测序 |
| 3.2.15 轮状病毒的分离与鉴定 |
| 3.2.15.1 HT 29 细胞和MA-104 细胞的复苏 |
| 3.2.15.2 细胞的传代培养 |
| 3.2.15.3 HT 29 细胞和MA-104 细胞的胰酶耐受实验 |
| 3.2.15.4 样品的准备 |
| 3.2.15.5 轮状病毒的激活 |
| 3.2.15.6 轮状病毒的增殖 |
| 3.2.15.7 收毒 |
| 3.2.15.8 RT-PCR检测盲传分离的病毒 |
| 3.2.15.9 间接免疫荧光检测 |
| 3.2.15.10 病毒的纯化及病毒滴度的测定 |
| 3.2.16 RV全基因组的分段克隆 |
| 3.2.17 轮状病毒基因分型 |
| 3.2.18 基于RV各基因片段分别构建系统发育树 |
| 3.2.18.1 序列校正、拼接 |
| 3.2.18.2 多序列比对 |
| 3.2.18.3 序列遗传距离分析 |
| 3.2.18.4 NJ系统发育树构建 |
| 3.2.19 基于RV各基因片段的重组分析 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 湖北部分地区RV流行情况 |
| 4.2 RV的分离与鉴定 |
| 4.2.1 细胞胰蛋白酶耐受浓度的筛选 |
| 4.2.2 细胞病变结果 |
| 4.2.3 RT-PCR检测结果 |
| 4.2.4 间接免疫荧光检测结果 |
| 4.2.5 PoRV的空斑纯化及TCID_(50)的测定 |
| 4.3 RV的全基因组测序 |
| 4.3.1 分离株全基因组扩增结果 |
| 4.3.2 分离株VP7 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.3 分离株VP4 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.4 分离株VP6 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.5 分离株VP1 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.6 分离株VP2 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.7 分离株VP3 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.8 分离株NSP1 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.9 分离株NSP2 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.10 分离株NSP3 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.11 分离株NSP4 基因的遗传进化分析 |
| 4.3.12 分离株NSP5 基因的遗传进化分析 |
| 4.4 分离株各基因片段的重组与重配分析 |
| 4.4.1 分离株各基因片段的重组分析 |
| 4.4.2 分离株各基因片段的重配分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 湖北地区RV流行情况 |
| 5.2 RV的分离与鉴定 |
| 5.3 RV的全基因组测序与重配分析 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（2）人H组轮状病毒免疫荧光检测方法的建立（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1病毒和细胞 |
| 2病毒感染MA104细胞 |
| 3 VP6-his蛋白的表达及纯化 |
| 4免疫荧光检测 |
| 5特异性试验 |
| 6荧光灶形成单位测定 |
| 结果 |
| 1 J19毒株感染MA104细胞 |
| 2 VP6-his蛋白的大量表达及纯化 |
| 3免疫荧光结果 |
| 4免疫荧光的特异性 |
| 5荧光灶形成单位结果 |
| 讨论 |
（3）牛初乳抗轮状病毒的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 轮状病毒概况 |
| 1.1.1 轮状病毒的生物学性状 |
| 1.1.2 轮状病毒的复制周期 |
| 1.1.3 轮状病毒的致病性 |
| 1.1.4 轮状病毒的致病机制 |
| 1.1.5 轮状病毒腹泻的治疗 |
| 1.2 牛初乳的认识 |
| 第2章 牛初乳抗轮状病毒的实验研究 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 药品 |
| 2.1.2 细胞株 |
| 2.1.3 病毒株 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.1.6 主要试剂 |
| 2.1.7 主要试剂 |
| 2.1.8 Real—time PCR引物设计 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 轮状病毒的扩增 |
| 2.2.3 轮状病毒毒力的测定 |
| 2.2.4 实验分组 |
| 2.2.5 乳鼠腹泻模型的建立及治疗 |
| 2.2.6 观察指标 |
| 2.2.7 乳鼠粪便抗原的检测 |
| 2.2.8 乳鼠粪便病毒滴度的检测 |
| 2.2.9 乳鼠血清中IL-6、IL-10、IL-12p70、TNF、IFN-γ、MCP-1因子的检测 |
| 2.2.10 Real-Time PCR检测乳鼠小肠病毒量 |
| 2.2.11 形态学观察 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 病毒致细胞病变情况 |
| 2.3.2 轮状病毒滴度的测定 |
| 2.3.3 观察指标 |
| 2.3.4 乳鼠粪便抗原检测 |
| 2.3.5 乳鼠粪便病毒毒力的检测 |
| 2.3.6 乳鼠血清中IL-12p70、MCP-1、TNF、IL-6、IL-10和IFN-γ的检测 |
| 2.3.7 Real-Time PCR检测乳鼠小肠中病毒RNA载量 |
| 2.3.8 病理组织的改变及小肠绒毛高度的测量 |
| 2.3.9 免疫组织化学检测 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（4）天津市腹泻儿童病毒感染情况分析及污水中肠道内病毒的检测（论文提纲范文）
| 缩略词表 中文摘要 Abstract 前言 第一部分 天津市腹泻患儿病毒性病原体的检测及分离 |
| 第一章 天津市腹泻患儿轮状病毒感染研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第二章 天津市腹泻患儿星状病毒感染研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第三章 天津市腹泻患儿腺病毒感染研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第四章 天津市腹泻患儿杯状病毒感染研究 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第五章 天津市腹泻患儿病毒感染情况综合分析 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 第二部分 污水中肠道内病毒的检测 |
| 第六章 两种浓缩水环境中肠道病毒方法的比较 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 |
| 第七章 污水中肠道内病毒的检测 |
| 第一节 引言 |
| 第二节 实验材料与方法 |
| 第三节 结果 |
| 第四节 讨论 |
| 第五节 小结 结论 参考文献 综述 个人简历 攻读硕士期间发表文章 致谢 |
（5）轮状病毒在KMB17细胞上的适应性培养及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 一、论文 |
| (一) 中文摘要 |
| (二) 英文摘要 |
| (三) 引言 |
| (四) 实验材料与方法 |
| (五) 结果与分析 |
| (六) 讨论 |
| (七) 小结 |
| (八) 参考文献 |
| 二、文献综述 |
| 三、附录 |
| 四、攻读学位期间发表文章情况 |
| 五、致谢 |
（6）秦香颗粒对人轮状病毒致感染乳鼠血清IFN-γ、IL-2的影响研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照表 |
| 引言 |
| 第一部分 动物实验 |
| 一、材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2.方法 |
| 2.1 动物模型建立与分组: |
| 2.2 给药 |
| 2.3 动物标本采集 |
| 2.4 检测指标 |
| 2.5.统计学分析 |
| 二、结果与分析 |
| 1.秦香颗粒对RHv感染乳鼠一般情况的影响 |
| 2.秦香颗拉对HVR感染乳鼠腹泻及死亡率的影响 |
| 3.秦香颗粒对HRV感染乳鼠粪便病毒抗原阴转率的影响 |
| 4.秦香颗粒对HRV感染乳鼠外周血清IFN-γ的影响 |
| 5.秦香颗粒对HRV感染乳鼠血清IL-2的影响 |
| 6.秦香颗粒对HRV感染乳鼠小肠粘膜修复的影响 |
| 第二部分 讨论 |
| 一、现代医学对HRV腹泻研究现状 |
| 1. 流行病学特点 |
| 2. 病理生理特点 |
| 3. 致病机理研究 |
| 3.1 HRV入侵肠上皮细胞的机制 |
| 3.2 HRV导致腹泻的机制 |
| 4. 免疫机制研究 |
| 4.1 细胞因子在轮状病毒感染中的免疫调节 |
| 5. 西医治疗 |
| 5.1 营养疗法 |
| 5.2 液体疗法 |
| 5.3 干扰素 |
| 5.4 微生态疗法 |
| 5.5 黏膜保护剂治疗 |
| 二、中医学对HRV腹泻的认识和研究现状 |
| 1. 病因病机 |
| 2. 中医药治疗 |
| 2.1 辨证论治 |
| 2.2 专方治疗 |
| 2.3 针灸推拿治疗 |
| 3. 中药作用机理研究 |
| 三、秦香颗粒与HRV腹泻 |
| 1. 秦香颗粒方特点、其现代药理学研究 |
| 1.1 秦香颗粒组方特点 |
| 1.2 秦香颗粒各组成药物的现代药理学研究 |
| 2. 秦香颗粒治疗腹泻研究进展 |
| 3 秦香颗粒对HRV感染乳鼠腹泻的作用机理初探 |
| 3.1 秦香颗粒对HRV感染乳鼠粪便病毒抗原阴转率的影响 |
| 3.2 秦香颗粒对HRV感染乳鼠血清IFN-γ的影响 |
| 3.3 秦香颗粒对HRV感染乳鼠血清IL-2的影响 |
| 四、秦香颗粒的研究与展望 |
| 第三部分 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 图1 HRV感染乳鼠一般情况 |
| 图2 各组乳鼠小肠组织病理改变(HE,400倍) |
| 附录 |
| 一 综述 |
| 二 在读期间发表论文 |
| 参考文献 |
（7）基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 利用密码子优化提高重组腺病毒中人轮状病毒基因的表达量 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章 密码子优化可增强轮状病毒VP6基因重组腺病毒的免疫效果 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 重组腺病毒口服免疫后在小鼠体内的生物分布 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 附录 密码优化的基因序列 |
| 攻读博士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）B组轮状病毒核酸杂交检测方法的建立及其初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 B组轮状病毒的病毒学特点 |
| 1.1 形态结构 |
| 1.2 B组轮状病毒的理化性质 |
| 1.3 B组轮状病毒的基因组及其编码蛋白质 |
| 1.4 RNA在 PAGE上迁移特征 |
| 1.5 B组轮状病毒的分离培养 |
| 2 人B组轮状病毒的流行病学 |
| 3 检测方法 |
| 3.1 电镜法(electronic microscope，EM) |
| 3.2 免疫学检测技术 |
| 3.3 基因检测技术 |
| 3.4 病毒分离 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第二章 同位素标记nsp5基因探针及其杂交检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 探针灵敏度试验 |
| 2.2 探针的特异性试验 |
| 2.3 杂交温度对探针灵敏度的影响 |
| 2.4 探针检测腹泻样本 |
| 2.5 阳性样的RT-PCR认证 |
| 2.6 nsp5基因克隆质粒的限制性内切酶分析 |
| 2.7 含nsp5基因的克隆质粒的PCR分析 |
| 2.8 阳性样nsp5基因序列测序结果如下 |
| 3 讨论 |
| 第三章 生物素标记vp7基因探针及其杂交检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 生物素标记vp7基因探针的电泳检测 |
| 2.2 探针标记效率 |
| 2.3 探针灵敏度 |
| 3 讨论 |
| 第四章 地高辛标记vp7基因探针及其杂交检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 探针灵敏度测定 |
| 2.2 探针特异性测定 |
| 2.3 探针检测腹泻样本 |
| 3 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表的论文、科研成果等 |
| 致谢 |
四、引起成人腹泻的新轮状病毒在原代人胚肾细胞上的培养和传代（论文参考文献）
- [1]湖北部分地区不同宿主源轮状病毒的分离及其基因组的遗传变异研究[D]. 杨立君. 华中农业大学, 2021(02)
- [2]人H组轮状病毒免疫荧光检测方法的建立[J]. 庞立丽,白爱英,卿钰,张佳艳,李伯阳,章青,李丹地,梁未丽,阚飙,段招军. 病毒学报, 2020(06)
- [3]牛初乳抗轮状病毒的实验研究[D]. 李美霞. 吉林大学, 2016(09)
- [4]天津市腹泻儿童病毒感染情况分析及污水中肠道内病毒的检测[D]. 欧阳雅博. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010(05)
- [5]轮状病毒在KMB17细胞上的适应性培养及免疫原性研究[D]. 马应霞. 昆明医学院, 2010(09)
- [6]秦香颗粒对人轮状病毒致感染乳鼠血清IFN-γ、IL-2的影响研究[D]. 殷坚. 湖南中医药大学, 2010(02)
- [7]基因优化的表达人轮状病毒重组腺病毒免疫效果研究[D]. 王敏. 中国疾病预防控制中心, 2008(05)
- [8]快速培养轮状病毒的提纯及电子显微镜下观察[J]. 李培京,崔晓英,纪绍忠. 现代科学仪器, 2008(01)
- [9]B组轮状病毒核酸杂交检测方法的建立及其初步应用[D]. 陈强. 华中师范大学, 2007(04)
- [10]B组轮状病毒WH-2株vp7基因的原核表达与抗体的制备[J]. 胡英会,芦宝静,尹素改,陈强,王娜,杨继红. 中国卫生检验杂志, 2007(05)