一、苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素的质谱分析（论文文献综述）
曹蓓蓓[1]（2020）在《对灰飞虱高毒力的新型Bt杀虫蛋白基因克隆及其活性研究》文中研究指明灰飞虱是水稻上非常重要的半翅目害虫,不仅能通过刺吸式口器吸取水稻等作物汁液,掠夺其营养物质,直接危害作物,同时还在水稻、玉米等作物间传播植物病毒,严重影响了水稻、玉米等农作物的安全生产。此类害虫主要依靠化学农药进行防治,但化学农药长期滥用带来了害虫抗药性上升、农药残留、环境污染、食品安全等一系列严重后果,急需开辟新的绿色防控途径。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）已被广泛的应用于多种水稻鳞翅目害虫的绿色防控。近年来,本实验室在大量分离筛选Bt菌株资源的基础上,发现了两株对灰飞虱具有活性的野生菌株,并从中分别克隆了cry64Ba、cry64Ca和cry78Aa三种新基因,这些基因表达产物对灰飞虱均具有很高的毒杀作用。由此说明从Bt菌株资源中筛选新的对飞虱高毒力杀虫蛋白是可行的。本研究在Bt基因组高通量测序基础上,以对灰飞虱高毒力的cry64Ba、cry64Ca和cry78Aa基因为参照,利用生物信息学技术分析挖掘新型Bt杀虫基因,并以灰飞虱为靶标害虫,结合传统的生物活性测定,克隆对灰飞虱具有显着杀虫活性的新基因,为灰飞虱的生物防治提供重要的菌株和基因资源。主要结果如下:（1）利用生物信息学技术,经BLAST比对,从实验室前期完成的1368个Bt菌株草图数据库获得162条cry78Aa1基因同源核苷酸序列,确定了17株含有cry78-like基因的候选Bt菌株。（2）生测结果发现P14E12、B4F11、C8D6、T5D8、B15C9这5株候选菌株总晶体蛋白对灰飞虱具有一定程度的杀虫活性,致死率在40-80%。这些菌株的采集地具有一致性,均来自于北京百望山森林公园。（3）完成了P14E12、B4F11、C8D6、T5D8、B15C9共5株菌株的Bt基因注释,蛋白结构预测发现这些菌株含有的cry78-like基因编码的蛋白均含有RicinB＿lectin和Toxin＿10超家族保守结构域。（4）无活性菌株Bt P14C1、P14F6、C14F11、P10C11、A4A4、B9B3的蛋白样品经胰蛋白酶消化后对灰飞虱的致死率均有所提高,其中C14F11、P10C11两种菌株总晶体蛋白经胰蛋白酶消化前后的活性具有显着性差异。（5）分别从B4F11、A3F10、P10C11、P14F6、T5D8、A4A4、C14F11、P14E12菌株中克隆cry78-like基因共8种,这些基因编码蛋白与Cry78Aa1的氨基酸序列相似性介于31.8-54.3%;在大肠杆菌中成功表达了7种新基因,这些蛋白分子量在41.6-43.7 kDa之间,与预测蛋白分子量大小一致;其中Protein 6、Protein 10、Protein 11三种蛋白可溶性表达,蛋白分子量分别为42.5、43.7、42.4 kDa。生物活性初筛结果显示这三种Cry78-like蛋白对灰飞虱三龄若虫一定程度的杀虫活性,在30μg/mL时校正死亡率分别为90.15%、40.99%、26.23%。（6）选取初筛活性最好的Protein 6蛋白进行深入研究。该蛋白由来源于活性Bt菌株B4F11的gene6编码,包含380个氨基酸残基,预测的分子量约为42.5 kDa,具有Ricin＿B＿Lectin和Toxin＿10超家族保守结构域。其对灰飞虱三龄若虫具有很高杀虫活性,致死中浓度LC50为9.72μg/mL。gene6基因序列已提交给NCBI GenBank,登录号为MN075151,与Cry78Aa1氨基酸相似性为54.3%,被Btδ-内毒素国际命名委员会命名为cry78Ba1,这是第二等级的新基因。（7）Cry78Ba1蛋白与目前已知的过敏原均无序列同源性,在90℃加热10 min即可变性失活。Cry78Ba1蛋白在模拟胃液处理15 s内完全降解失活,但模拟肠液中消化1 h仍具有杀虫活性。由此推测Cry78Ba1蛋白被人或高等动物摄入后在胃液中可被迅速降解短肽,在进入肠道时应当已经丧失了毒性。在本研究测试范围内,就消化和吸收而言,该蛋白没有发现对人类或哺乳动物的安全隐患。综上,本研究基于高通量测序技术获得Bt菌株基因组草图数据以及生物信息学方法比对现有活性基因的同源核苷酸序列,从候选菌株活性筛选、同源基因活性鉴定两方面出发,挖掘对灰飞虱具有高毒性的Bt菌株与基因。这说明,在Bt野生菌株中发现对灰飞虱等刺吸式口器害虫有活性的Bt菌株具有很大的潜力。研究结果为发掘对半翅目刺吸式口器害虫高毒力的Bt菌株及基因提供了新思路;同时,本研究获得的Cry78Ba1蛋白为稻飞虱高效、绿色防控方面创造了有利条件。
林白容[2]（2016）在《源自煤矿的苏云金杆菌的分离及其新基因的筛选鉴定》文中研究说明苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensi,Bt）是一种广泛用于农业害虫生物防治的昆虫病原菌,而表达Bt杀虫蛋白的转基因抗虫棉是当前最为重要的防治棉铃虫害手段。由于棉铃虫对第一代.传基因Bt棉已产生极强抗性,因此,亟需寻找一种新的对棉铃虫有效的Cr毒素来延缓或抵消其抗药性。但由于各种人为干扰或农药残留等因素,导致、普通分离源中较难分离获得新型Bt菌株,因此,寻找特殊生境分离源对挖 Bt新基因具有重大意义。基于以上思路,本研究以煤矿为分离材料,并从.15份煤矿样品中分离出2株Bt,编号分别为BRC-LBR1和 BRC-LBR2。由于两分（?）术来源特殊,为进一步了解其各方面的生物学特性,分别对其进行了形态学、生理生化分析。经光学显微镜检测发现2株菌均具有菱形伴胞晶体。生（?）化检测结果表明,两分离株大部分指标均相同,仅在与脲酶水解反应上（?）差异。选取两分离株及Bt库斯塔克亚种菌株HD73对棉铃虫（Helicoverpa（?）nigera）进行生物测定,结果表明,两分离株对棉铃虫均有活性,且BRC-LBR1对棉铃虫的毒力效果高于标准菌株HD73。利用11对通用引物对两分离株进行Cry毒素基因分析,结果表明,2株菌均含有cry1基因型。经克隆、测序后发现,BRC-LBR1中的cry1亚基因型与cry1Ac同源性极高,达99%;相较之下,BRC-LBR2中的cry1亚基因型与cry1Ka同源性较低,为98%,且尚未见到杀虫基因cry1Ka对棉铃虫有效的报道,因此选取分离株BRC-LBR2进行基因组测序分析,以期挖掘得到对棉铃虫有效的新基因。经NGS测序发现,BRC-LBR2中含有2种编码杀虫蛋白的基因,将2段基因全长序列登录NCBI,获得登录号分别为KU761577和KU761578,并提交Bt毒素命名委员会正式命名为cry1Be5和vip3Ad6。利用Thermo Scientific高效液相质谱仪对分离株BRC-LBR2的伴胞晶体蛋白进行鉴定,结果表明,分离株表达的杀虫蛋白为Cry1Be类,与基因组测序所得结果一致。利用生物信息学分析cry1Be5和vip3Ad6基因序列及其编码蛋白的理化性质等,并对两种蛋白的功能结构域、二级结构及三维结构等进行分析预测。综合以上结果表明,从煤矿这一特殊生境中能够分离获得Bt菌株,且挖掘得到1个对棉铃虫有效的新基因,这不仅拓宽了 Bt采集来源的种类,丰富了 Bt的生态学背景,还为Bt新基因的快速挖掘鉴定提供了新的方向,对其进一步的推广应用也具有重要的指导意义。
胡泉芳[3]（2014）在《苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究》文中提出苏云金芽胞杆菌（Bacillus turiesnginis,简称Bt）是目前世界上应用最为广泛的微生物杀虫剂,其生物活性主要来源于杀虫晶体。研究Bt杀虫晶体形成的分子机制,对提高杀虫晶体蛋白的产量,增强Bt菌株杀虫毒力以及构建高效广谱的Bt工程菌株具有重要意义。有报道表明枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis,简称Bs）的同类残食行为能够影响芽胞的形成周期,因此本研究对Bt菌株是否存在同类残食行为开展了研究。根据Bt4.0718菌株基因组测序结果及生物信息学比对分析,发现该菌株含有Bs同类残食行为基因模块的同源序列,其中质粒上存在sdpRI-sdpABC模块,染色体上存在sdpRⅡ模块。同时发现Bt无晶体突变株XBU001的染色体上只含有sdpRⅡ模块。利用荧光染色技术及激光共聚焦显微镜观察发现,在对数生长期Bt4.0718菌株群体中只存在活菌体,而在稳定生长前期及稳定生长中期同时存在活菌体与死菌体,这些结果说明Bt4.0718菌株在培养过程中存在同类残食现象。在此基础上,本研究构建了 Bt无晶体突变株XBU001中sdpRⅡ基因模块的缺失突变株,扩增得到Bt4.0718菌株的sdpRI-sdpABC模块并克隆到pHT315载体,转化XBU001,为对同类残食行为基因模块进行初步研究奠定了基础。130～140 kDa的Cry1类原毒素非毒性C-端区域中富含半胱氨酸（Cys）残基,研究者普遍认为这些Cys残基对原毒素组装形成晶体具有重要作用,此外,在昆虫中肠蛋白酶水解激活的过程中被切除的部分N-端非毒性部分也包含了半胱氨酸残基。为了深入研究非毒性区域Cys残基的功能,本研究克隆了 Bt库斯塔克亚种（subsp.kurstaki）HD73菌株的cry1Ac基因,利用丝氨酸（Ser）扫描突变,对Cry1Ac原毒素非毒性区域的Cys进行单点突变及逐一叠加突变,将Cry1Ac原毒素非核心毒性区域的16个半胱氨酸（Cys）替换成丝氨酸（Ser）,并在本室无晶体突变株中XBU001中进行表达。相差显微镜观察所有重组工程菌株仍然能形成典型的菱形晶体,SDS-PAGE表明cry1Ac基因突变前后,所有突变重组工程菌株仍能表达130 kDa大小的目的蛋白。这些结果说明Cry1Ac原毒素非毒性部分的16个半胱氨酸残基的单点、多点突变并未影响其晶体的形成及表达。此外,表达野生和所有Cys残基叠加突变的Cry1Ac重组工程菌株对棉铃虫（Helicoverpa armigera）的毒力无明显差异。本论文还研究了 Bt杰加森亚种（subsp.jegathesan）Cry30Ca的ORF2辅助蛋白对Cry11A表达的影响,通过基因工程重组技术,构建了置于cyt1AP/STAB 序列启动下cry11A单独、p20与cry11A、orf2-30Ca与cry11A的共表达载体。聚丙烯酰胺凝胶包埋技术结合质谱鉴定表明,辅助蛋白P20、ORF2-30Ca与Cry11A发生了共表达,相差观察分析表明3株重组工程菌株都能产生包涵体,SDS-PAGE分析ORF2-30Ca与Cry11A共表达时,其Cry11A的蛋白表达量仅为单独表达Cry11A或P20与Cry11A共表达时的1/2。对四龄致倦库蚊(Culex 的生测结果分析表明,ORF2-30Ca与Cry11A共表达时重组工程菌株的毒力也有所降低。这些结果均说明了 ORF2-30Ca不能辅助Cry11A的正确折叠,从而导致其形成的包涵体不稳定,在菌株内或菌株裂解后发生了降解。综上,本论文发现了 Bt4.0718菌株存在同类残食行为并对其基因模块功能进行了初步分析,为后续研究该行为对发酵周期的影响提供了借鉴基础。同时,Cry1Ac原毒素非毒性区域Cys残基的定点突变研究和ORF2-30C对Cry11A的辅助功能研究丰富了人们对杀虫晶体形成及表达调控机制的认识,为今后提高杀虫晶体蛋白表达量及构建高效Bt杀虫菌株提供了思路。
刘霜[4]（2014）在《苏云金芽胞杆菌伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白形成相关性的研究》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种生物杀虫剂,它的特点是高效且杀虫谱广,它的杀虫特性主要取决于在芽胞期产生的大量杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）。目前,分子伴侣对芽胞杆菌中cry基因的影响主要集中于P19、P20、ORF1和ORF2的研究上,而groel、groes基因对cry基因的调控作用还不确定。本研究对Bt4.0718菌株-营养期（T1）,芽胞形成早期（T2）,芽胞形成中期（T3）和芽胞形成晚期（T4）的GroEL和GroES进行了免疫印迹分析,构建了重组表达质粒pET28a-GroEL和pET28a-GroES并转化E.coli BL21（DE3）,成功得到 GroEL 和 GroES 融合蛋白,HisTrap 亲和色谱纯化融合蛋白,免疫兔子制备多克隆抗体,western blotting分析显示,在四个时期都检测到了 60KDa的GroEL和10 KDa的GroES蛋白,GroEL和GroES蛋白在菌株培养10h即有表达,20h达到高峰,而后逐渐减弱,并且GroEL和GroES蛋白的表达丰度明显低于内参蛋白30s核糖体蛋白的表达丰度。本文运用基因重组技术敲除了苏云金芽胞杆菌KCTF12菌株中的groel基因,构建了groel基因缺失突变株,通过相差显微镜观察结果显示,与原始菌株KCTF12相比,groel基因的缺失导致菌株的生长明显延迟,形成的伴胞晶体蛋白变小,说明groel基因对菌株的生长有重要的意义,而且其在伴胞晶体的形成过程中发挥一定的作用。为了进一步研究GroEL、GroES与伴胞晶体蛋白形成的相关性,本研究以Bt融合基因工程菌XBU001（1Ac-GFP）为研究对象,利用激光共聚焦扫描显微镜、多克隆抗体和荧光染料偶联的二抗对GroEL和GroES在细胞中的定位进行了连续时间段的观察。结果发现,细胞内GroEL、GroES蛋白的红色荧光信号明显,并且与晶体蛋白的绿色荧光信号出现重叠,在菌株生长的10-25h,红色荧光随着绿色荧光的增强而增强,25-35h绿色荧光继续增强直到达到最高峰,而红色荧光逐渐减弱,35-55h绿色荧光强度保持稳定,此时并未检测到红色荧光,上述结果表明,在Bt菌株体内GroEL、GroES蛋白与伴胞晶体蛋白可能发生了直接或间接的相互作用。采用生物信息学手段对GroEL、GroES蛋白相互作用蛋白进行了预测,发现在Bt细胞内与GroEL蛋白相互作用的蛋白主要有Gros、DnaK、Tuf、BT97272551、BT97274829、HrcA、FtsH、GrpE和SecA1,与GroES直接作用的蛋白主要有Grol、DnaK、FtsH、AcpP、BT97270237、RpsM、GrpE、BT97274313、GuaA 和 NrdR。本文首次利用免疫荧光技术研究Bt细胞内伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白之间的定位关系,为深入研究Bt体内伴胞晶体蛋白的形成过程、各代谢物之间的相互作用积累了有价值的实验资料。
李文萍[5]（2012）在《苏云金杆菌高效杀虫工程菌的构建及其伴胞晶体形成机制研究》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）简称Bt)作为一种环境友好型生物杀虫剂,对靶标害虫具有专一的杀虫活性,因此被广泛使用于农林业虫害以及蚊媒传播疾病的控制。它的杀虫特性主要来源于在芽胞形成期大量产生的杀虫活性蛋白。尽管在生态环境保护方面具有无可比拟的优势,但Bt生物杀虫剂的使用仍然落后于合成的化学农药。对Bt菌株进行遗传改良,可为发展新型Bt生物杀虫剂产品提供更好的技术与菌种资源。为获得毒力更高、杀虫谱更广的Bt菌株,进一步扩展Bt杀虫剂在生物防治上的应用,本研究采用分子手段,利用Bt偏爱密码子优化设计了昆虫特异的钙离子通道阻断剂基因ω-ACTX-Hv1a,并进行化学合成,与杀虫晶体蛋白基因crylAc3’-端融合,在Bt中进行共表达,并研究了融合蛋白的晶体形成情况和生物活性功能。在Bt杀虫蛋白基因crylAc的强表达体系调控下,cry1Ac、ω-ACTX-Hv1a和绿色荧光蛋白基因egfp在Bt无晶体突变株Cry-B中得到了有效的融合表达。通过显微镜观察发现,Bt融合基因工程菌Cry-B （1Ac-ACTX-EGFP）的单个菌体中形成了2-3个较小的类似伴胞晶体的包涵体,在菌体裂解后仍然是稳定的。在对Bt工程菌表达产物进行的免疫杂交分析中,全长166kDa的融合蛋白带被清晰的检测到,说明融合基因可以在Bt中进行完整的表达。通过对工程菌发酵产物进行生物活性测定,发现融合蛋白晶体对甜菜夜蛾幼虫的毒力比CrylAc晶体提高了至少5倍,对棉铃虫幼虫也具有很高的毒力且明显抑制了幼虫的生长。这些结果说明,外源杀虫蛋白可以采取与Cry类内毒素C-端融合的方式在Bt中共表达,共同形成伴胞晶体,并至少保留部分杀虫生物活性。本研究为构建具有不同杀虫特性的融合蛋白以及构建高效广谱的Bt工程菌株奠定了重要基础。目前,研究者们虽然对cry基因的表达调控已经进行了广泛研究,但由于在细菌活体中观察Cry蛋白的聚集过程比较困难,缺乏好的检测手段,因此人们对此类蛋白晶体形成的机制仍然很不清楚。本研究以Bt融合基因工程菌Cry-B（1Ac-ACTX-EGFP）为研究对象,利用激光共聚焦扫描显微镜对芽胞期菌体的蛋白晶体形成过程进行了连续时间段的观察。观察结果显示,融合蛋白开始表达时是散布于母细胞内的,晶体形成是一个由蛋白分子从分散到逐渐聚集的一个过程,并且蛋白的聚集位点存在极性,靠近菌体两端。菌体裂解前,融合蛋白形成的晶体颗粒体积达到最大。本研究构建的Cry蛋白可视化分析系统在细胞水平上为深入研究杀虫蛋白晶体的组装与形成机制提供了非常有用的技术检测手段。通过对Cry-B （1Ac-ACTX-EGFP）和对照菌株Cry-B（1Ac）裂解前的菌体全蛋白做无标记定量的shot-gun质谱鉴定和蛋白表达差异分析,初步探索了可能参与影响杀虫蛋白晶体形成的调控因子。从Cry-B（1Ac-ACTX-EGFP）菌株和Cry-B （1Ac）菌株中分别鉴定到201和138个非冗余蛋白,其中114个为两菌株共同所有。蛋白功能分类发现两个菌株中功能归于氧化还原类（Oxidation-reduction）的蛋白数量所占比例差异很大,说明菌体内的氧化还原环境可能是造成晶体形成差异较大的原因之一。通过蛋白表达差异比较分析,找到了两菌株中丰度差异较大的共有蛋白和丰度较大的独有蛋白,如共同作用参与蛋白折叠与组装的60kDa伴侣蛋白（GroEL）和10kDa伴侣蛋白（GroES）、参与细胞应激反应的Clp类蛋白酶和催化还原过氧化氢的过氧化氢酶等,均有可能是参与Bt杀虫蛋白晶体形成的调控因子。例如同源性较高的GroEL,已经有研究证实参与调控大肠杆菌外源蛋白包涵体的形成。仍然需要进行基因敲除、加倍互补等分子实验,并结合Cryl蛋白可视化分析系统,来进一步验证这些差异蛋白的功能与晶体形成机制的相关性。本研究提供的信息为探索杀虫蛋白晶体的形成机制,以及合理应用基因工程手段对Bt菌进行遗传改良提供了有价值的技术资料和数据。
陈靖[6]（2011）在《苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基于反相液相色谱分离的蛋白质组学研究》文中研究表明目前，苏云金芽孢杆菌（简称BT）是世界上应用最广的微生物农药，占总量的90%，已在60多个国家生产了120多种产品，是生物农药开发与研究的热点。近年来蛋白质组学迅猛发展，其研究的技术手段日趋成熟与多样，尤其是现代分析技术中的高效液相色谱和质谱技术。为了高效，准确地分离分析苏云金芽孢杆菌中的有效杀虫成分，本论文使用高效液相色谱和生物质谱技术，对国内市售的苏云金芽孢杆菌杀虫粉剂进行快速的分离测定。论文共分为四章，主要工作内容：第一章对苏云金芽孢杆菌进行了概述，介绍了杀虫晶体蛋白的种类、结构、杀虫机理和分类，以及对杀虫晶体蛋白的研究现状，同时介绍了蛋白质组学及其研究技术，并对课题的研究工作进行了概述。第二章主要目的是获得苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的冻干粉。首先考察了杀虫晶体蛋白样品溶解与沉淀的条件，进一步优化了透析沉淀法提取杀虫晶体蛋白所需的缓冲液浓度和缓冲沉淀时间，通过将碱溶后BT蛋白的离心上清液置于透析袋中，在含有1mM EDTA、pH值为4.5、100mM的CH3COONaCH3COOH缓冲液里，透析5小时的透析沉淀法，并冷冻干燥制到杀虫晶体蛋白的冻干粉。第三章主要通过RPLC实现了对杀虫晶体蛋白的快速分离。先利用蛋白变性的方法，使杀虫晶体蛋白在溶液中的性质发生改变，以满足反相液相色谱分离的上样条件，再依据中心切割法将色谱分离中的目标蛋白组分进行收集浓缩，并使用SDS-PAGE凝胶电泳对收集浓缩的蛋白组分进一步分离分析。第四章分别利用MALDI-TOF-MS质谱和LTQ ORBITRAP XL质谱串联质谱技术对凝胶上蛋白条带胰酶酶切后的多肽样品进行检测，针对一级质谱图和二级串联质谱图提取的数据信息，分别进行肽质量指纹图谱搜索和MS/MS数据多肽序列蛋白数据库搜索；最终鉴定到24个苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白中Cry1A类蛋白的多肽序列，其中肽段AVNALFTSTNQIGLK氨基酸序列在整个Bacillusthuringiensis蛋白数据库中只匹配上一个蛋白gi169788589-pesticidal crystalprotein cry1Ac [Bacillus thuringiensis serovar kurstaki]，另一个氨基酸序列EIYTNPVLEDFNGSFR在Bacillus thuringiensis蛋白数据库中也只匹配于一个蛋白gi46409861-cry1Atype crystal protein [Bacillus thuringiensis serovar kenyae]，而其余氨基酸序列同时为几十个Cry类杀虫蛋白所共有。
黄少亚[7]（2011）在《2D-LC-MS/MS技术分离和鉴定苏云金芽胞杆菌蛋白质组》文中提出建立了一套以液相系统为基础的方法来分离和鉴定一株新的苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）库斯塔克亚种4.0718菌株蛋白质组,该系统以微量级的二维液相色谱与高分辨率质谱相偶联,采用纳升级电喷雾离子化方式对样品进行串联质谱分析。以强阳离子交换柱为第一相,反相柱为第二相,在两相之间通过十通阀连接两根并联的预柱用来脱盐和富集肽段。本研究以苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种4.0718新菌株营养生长中期（T1）、芽胞形成前期（T2）和芽胞后期（T3）三个时期的菌体总蛋白为材料,经过胰蛋白酶酶解和适当的酸化后通过强离子交换柱进行吸附,采用注射11个不同浓度的氯化铵溶液进行阶梯式洗脱,洗脱物经预柱脱盐和浓缩后进入反相柱进行线性梯度分离,分离后的肽段经过电喷雾离子化后直接进入质谱仪离子阱进行一级和串联二级质谱的分析。质谱仪采得的数据通过Sequest软件进行搜库鉴定。每个时期的样品进行一次重复性试验。初筛结果显示,三个时期分别鉴定到1201（1034）、728（662）、854（851）种蛋白,去除批次间和不同Bt亚种之间蛋白冗余后,最终鉴定到的蛋白数目分别为918、703、778种,三个时期共同鉴定到的蛋白质总数为307种。所鉴定蛋白质的分子量分布范围为4600Da～477400Da, pI值分布范围为4.01～11.84,显示出了该技术相对于双向凝胶电泳在蛋白质分离鉴定方面的优势。功能分类显示,在三个时期共有的蛋白中,绝大多数蛋白为参与物质代谢的功能蛋白,其次是参与是细胞过程的蛋白。同时采用iTRAQ标记的离线式2D-LC-MS/MS技术对三个时期的菌体蛋白进行定量分析,并对Bt4.0718菌株体内初级代谢过程进行了初步的探讨,发现了Bt体内一条重要的氮源代谢途径—GABA旁路。采用2D-LC-MS/MS技术鉴定到了Bt4.0718菌株在芽胞前期和芽胞后期表达的三种Cry类原毒素：Cry2Aa, Cry1Aa和Cry1Ac以及在不同时期表达的一系列胞内活性因子。另外本研究还鉴定到了一系列与芽胞和晶体形成相关的重要蛋白,比如芽胞调控蛋白、帮助蛋白、分子伴侣蛋白等。本文首次利用2D-LC-MS/MS技术研究Bt全细胞生理活性物质不同时期的表达情况,为深入研究Bt体内的初级代谢过程、各生物活性因子的功能、探讨Bt杀虫机制奠定了重要的理论基础。为苏云金芽胞杆菌蛋白质组学研究的新方法以及具有杀虫活力的苏云金芽胞杆菌蛋白数据库的建立积累了有价值的实验资料。
付祖姣[8]（2008）在《苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建》文中进行了进一步梳理苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）4.0718菌株是新筛选的一株高毒力菌株,现已成功用于商业化生产。该菌株在芽胞形成的同时能够产生菱形和方形两种晶体,对棉铃虫（Helicoverpa armigera）等农业害虫表现出高效杀虫活性。为了全面阐述该菌株高效杀虫的背景,更好地利用该菌株进行生物杀虫剂的开发,本研究系统分析了Bt 4.0718菌株的杀虫基因型及表型,包括质粒带型、杀虫基因类型和晶体蛋白类型的研究。结果显示,Bt 4.0718菌株在质粒带型和蛋白带型上是一个独特的Bt新菌株。PCR检测发现该菌株含有5种cry基因,包括cry1Aa、cry1Ac、cry2Aa、cry2Ab和cry1Ia基因,同时含有vip3A和几丁质酶基因。采用SDS-PAGE和液质联用质谱仪（LC-MS/MS）分析Bt 4.0718菌株的晶体蛋白,鉴定到该菌株的130 kD蛋白由Cry1Aa和Cry1Ac原毒素组成,而65 kD的蛋白由Cry2Aa原毒素组成。为了更快地筛选具有新的杀虫特性的Bt菌株或杀虫晶体蛋白,本研究创新性地建立了一种对Bt原毒素表达谱进行鉴定的新方法,即通过包埋Bt菌株产生的晶体蛋白混合物于聚丙烯酰胺凝胶块中,结合LC-MS/MS分析胶内酶解的复合肽段,从而快速鉴定晶体蛋白中原毒素的组成。本研究首先以模式菌株Bt库斯塔克亚种（Bt subsp.kurstaki）HD1菌株为对象,采用该方法检测HD1菌株晶体蛋白的组成。结果显示,采用聚丙烯酰胺凝胶块结合LC-MS/MS技术能准确检测到HD1菌株中表达的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac和Cry2Aa蛋白。同时,本研究以杀虫基因背景很清楚的Bt以色列亚种（Bt subsp.israelensis）4Q2-72和鲇泽亚种（Bt subsp.aizawa）HD133菌株为研究对象,检测到4Q2-72菌株表达了Cry4Aa、Cry4Ba、Cry10Aa、Cry11Aa、cyt1Aa和Cyt2Ba等6种晶体蛋白,而HD133也表达了Cry1Ab、Cry1Cb、Cry1Da、Cry1Ba、Cry1Ad和Cry1Ka 6种原毒素,其中后两种原毒素还未在任何文献中见报道。这些实验结果证实了该种原毒素检测方法是一种新型的鉴定Bt原毒素表达谱的方法,具有直接、快速、准确的特点。该方法将有力推动Bt菌株的筛选工作,对于其它生物组织的蛋白质组学分析也具有重要的参考价值。为了获得毒力更高和杀虫谱更广的Bt菌株,扩展Bt杀虫剂在农林害虫防治上的应用,本研究采用分子生物学手段将Bt cry1Ac基因与来源于虎纹捕鸟蛛的具有蛋白酶抑制剂活性的基因hwtx-11融合,构建了系列工程菌,并成功地在大肠杆菌和Bt无晶体突变株中检测到了Hwtx-11和融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11的表达。通过检测工程菌发酵产物对甜菜夜蛾和棉铃虫初孵幼虫的生物活性,发现Hwtx-11对甜菜夜蛾有明显毒力,且明显减慢了甜菜夜蛾的生长速度,融合蛋白Cry1Ac-Hwtx-11对两种靶标昆虫表现出比Cry1Ac蛋白更高的杀虫毒力。本研究为构建具有不同杀虫特性的融合蛋白以及构建高毒力的工程菌株奠定了重要基础。
李小辉[9]（2008）在《苏云金杆菌4.0718新菌株不同生长时期的蛋白质组研究》文中提出本研究提取了苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）库斯塔克亚种4.0718新菌株营养生长中期（T1）、芽胞形成前期（T2）和芽胞后期（T3）三个时期的细胞总蛋白质,采用1DE-MS/MS,2DE-MS/MS和“shotgun”技术分离和鉴定蛋白质。比较了不同生长时期细胞总蛋白质表达谱之间的差异,并分析了包括杀虫晶体蛋白质（Insecticidal Crystal Proteins,ICPs）在内的功能蛋白质的表达时空特性,获得了与晶体和芽胞形成过程相关的重要蛋白质信息。利用Melanie6.0软件分析2DE图谱,发现在T1、T2和T3时期的蛋白质点数目分别为346±18,299±23和343±11。以T2时期的2DE胶为参照,T1和T3时期的2DE胶与之对比,匹配率分别为70%和60%,反应了蛋白质在不同生长时期的表达差异性。切取蛋白质点并进行MALDI-TOF/TOF MS分析和数据库搜寻,鉴定差异表达的蛋白质点。结果发现,在鉴定到的差异蛋白质点中,T1时期特异性表达的有蛋白酶VCA0223和转酮醇酶等9个蛋白质点;T2时期特异性表达的3个蛋白质点分别为支链氨基酸转氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶和假想蛋白BC1708;T3时期特异性表达20个蛋白质点,包括bacillolysin、ORF1和SpoIVA等。与T2时期比较,T1时期无表达,T3时期表达上调的蛋白质点为Cry1A（c）3;下调的蛋白质点6个,分别为寡肽接合蛋白OppA、肽酶T和有机耐受蛋白等;无显着变化的蛋白质点为NAD（+）合成酶和果糖二磷酸醛缩酶。与T1时期比较,T3时期无表达,T2时期表达上调的2个蛋白质点分别为免疫因子A（Immune Inhibitor A,InhA）和InhA precursor;下调的4个蛋白质点包括氨甲基转移酶和转录抑制因子CodY等;无显着变化的2个蛋白质点为异柠檬酸脱氢酶和3-ketoacyl-酰基载体蛋白还原酶。在三个时期均有表达,但相对T1时期,1-吡咯啉-5-羧酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶等5个蛋白质点在T2时期表达显着下调,苏氨酸脱氢酶在T2时期表达显着上调,腺苷琥珀酸裂解酶在T3时期表达显着下调。采用1DE-MS/MS和shotgun技术分离和鉴定到了2DE-MS/MS未分离得到的重要功能蛋白质Cry2Aa和ORF2,发现Cry2Aa在T2时期开始形成,ORF2只在T3时期表达,这是对2DE数据的一个重要补充。对差异蛋白质的表达特征进行综合分析,发现T1时期表达的蛋白质主要为物质代谢和能量代谢过程中的重要酶类,与其它芽胞杆菌生长期细胞的表达谱相似。T2时期部分柠檬酸循环酶类蛋白质的表达下调,说明细胞代谢速度开始下降,细胞营养受限,为芽胞形成提供了重要条件,芽胞开始形成,ICPs起始高效表达。T3时期代谢相关蛋白质的表达量进一步降低,ICPs表达量最高,并形成晶体结构,有利于细胞逆境生存的有机溶剂耐受蛋白和PspA的表达在维护细胞完整和晶体形成中发挥作用。这是首次利用蛋白质组技术研究Bt细胞生理活性物质的变化情况,为深入研究Bt细胞的生理代谢过程、各生物活性因子的功能及探讨Bt的杀虫机制奠定了重要基础,也为拓宽Bt杀虫谱,增强杀虫效果提供了科学依据。同时通过对CotJC、ORF2和SpoIVh等蛋白质的表达特征和功能的分析,获得了与晶体和芽胞形成过程相关的重要信息,为研究晶体蛋白的稳定表达及如何构建稳定抗降解的晶体蛋白质结构奠定了基础。
曾智[10]（2007）在《苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因与球孢白僵菌CDEP2基因的融合表达及功能研究》文中研究说明为了构建杀虫毒力高和杀虫谱广的苏云金芽胞杆菌（Bacillusthuringiensis,简称Bt）工程菌株,利用本研究室筛选的Bt高毒力菌株Bt4.0718（CCTCC No.200016）中的cry1Ac基因和在球孢白僵菌（Beauveria bassiana）中新发现的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因构建融合基因和表达融合蛋白来提高Bt晶体蛋白的杀虫毒力。根据GenBank上球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因序列设计引物,通过RT-PCR扩增出本研究室保存的球孢白僵菌中的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的cDNA全序列。经过比较后发现该基因是球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶基因家族的新成员（GenBank登录号:EF195164）。该基因中1137bp的开放阅读框编码一个含379个氨基酸、分子量为38.8KDa、pI=8.21的蛋白酶前体。将CDEP2基因的cDNA序列连接到融合表达载体pET28a（+）的多克隆位点,构建重组质粒并转化到大肠杆菌（E.coli）BL21菌株中。将经过IPTG诱导后的重组菌株进行SDS-PAGE检测,结果表达了42KD的（His）6-CDEP2蛋白。将纯化后的CDEP2蛋白来免疫新西兰公兔,制备了该蛋白的多克隆抗体。以本研究室已经成功构建好的重组质粒pHT-cry1Ac-HwtxⅪ作为靶标质粒,通过Red/ET同源重组技术,将其中的蜘蛛蛋白酶抑制剂基因（HwtxⅪ）重组替换成CDEP2基因,构建新的重组质粒pHT-cry1Ac-CDEP2。将该重组质粒电转化到Bt无晶体突变株Cry-B中,构建新的重组工程菌株Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2。SDS-PAGE和Western blot检测证明融合蛋白在重组菌株中得到表达。对Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株和Cry-B-pHT-cry1Ac菌株研究比较发现,前者形成晶体所需时间明显比后者缩短,晶体蛋白表达量明显增加。生测结果表明Cry-B-pHT-cry1Ac-CDEP2菌株发酵液对棉铃虫（Helicoverpa armigera）三龄幼虫有高效杀虫活性,生测72h后的LC50值为8.50μl/ml,比对照菌株Cry-B-pHT-cry1Ac降低了49.1%。本研究首次将杀虫真菌中的类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因与Btcry1Ac基因融合,并使其在Bt中融合表达,为拓宽Bt杀虫谱、提高杀虫毒力和延缓害虫对Bt产生抗性等研究提供了基础。Red/ET同源重组技术为Bt cry基因和其它外源毒素基因的融合以及构建高毒力的Bt工程菌株提供了一个全新的分子生物学技术平台。
二、苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素的质谱分析（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素的质谱分析（论文提纲范文）
（1）对灰飞虱高毒力的新型Bt杀虫蛋白基因克隆及其活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 灰飞虱危害与防治 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2.1 Bt杀虫蛋白 |
| 1.2.2 Cry蛋白与三维结构 |
| 1.2.3 Bt蛋白成孔及杀虫机理 |
| 1.3 Bt蛋白与刺吸式口器害虫 |
| 1.3.1 Bt蛋白对刺吸式害虫的活性 |
| 1.3.2 Bt蛋白对刺吸式害虫的活性低的原因 |
| 1.4 转Bt基因作物Cry蛋白的食用安全性 |
| 1.4.1 Cry蛋白的热稳定性 |
| 1.4.2 Cry蛋白的消化稳定性 |
| 1.4.3 Cry蛋白的过敏原性 |
| 1.4.4 Cry蛋白的动物毒理学实验 |
| 1.5 Bt新基因的鉴定方法 |
| 1.5.1 DNA层面的Bt新基因鉴定 |
| 1.5.2 蛋白层面的Bt新基因鉴定 |
| 1.5.3 高通量测序水平的Bt新基因挖掘 |
| 1.6 本研究的立题依据与目的意义 |
| 1.6.1 立题依据 |
| 1.6.2 目的意义 |
| 第二章 对灰飞虱有活性的Bt菌株筛选与分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 候选菌株 |
| 2.1.2 供试昆虫与饲料 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 酶与生化试剂 |
| 2.1.5 常用仪器与设备 |
| 2.1.6 常用试剂与溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 cry78-like序列的生物信息学分析 |
| 2.2.2 cry64-like序列的生物信息学分析 |
| 2.2.3 候选Bt菌株晶体蛋白的提取 |
| 2.2.4 候选Bt菌株晶体蛋白的生物活性测定 |
| 2.2.5 活性菌株蛋白处理与活性检测 |
| 2.2.6 活性菌株芽胞晶体形态观察 |
| 2.2.7 活性菌株基因组分析与杀虫基因注释 |
| 2.2.8 无活性菌株蛋白胰蛋白酶消化与生测 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 cry78-like序列的生物信息学分析情况 |
| 2.3.2 cry64-like序列的生物信息学分析情况 |
| 2.3.3 候选Bt菌株晶体蛋白的提取与活性测定结果 |
| 2.3.4 活性菌株蛋白处理与活性成分确定结果 |
| 2.3.5 活性菌株芽胞晶体形态观察结果 |
| 2.3.6 活性菌株基因组分析与杀虫基因注释情况 |
| 2.3.7 无活性菌株蛋白胰蛋白酶消化的活性对比结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 新型杀虫蛋白表达与特性研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 供试昆虫与饲料 |
| 3.1.3 培养基与抗生素 |
| 3.1.4 酶与生化试剂 |
| 3.1.5 常用仪器与设备 |
| 3.1.6 常用试剂与溶液 |
| 3.1.7 消化实验相关试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Bt基因组提取 |
| 3.2.2 cry78-like基因的克隆、表达与生测 |
| 3.2.3 新型杀虫基因gene6来源菌株特征分析 |
| 3.2.4 新型杀虫基因gene6分子特征分析 |
| 3.2.5 新型杀虫蛋白Cry78Ba1热稳定性分析 |
| 3.2.6 新型杀虫蛋白Cry78Ba1消化稳定性分析 |
| 3.2.7 新型杀虫蛋白Cry78Ba1过敏原蛋白及结构分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 Bt基因组提取 |
| 3.3.2 cry78-like基因的克隆、表达与纯化 |
| 3.3.3 Cry78-like蛋白的生物活性测定 |
| 3.3.4 新型杀虫基因gene6来源菌株特征分析 |
| 3.3.5 新型杀虫基因gene6分子特征 |
| 3.3.6 新型杀虫蛋白Cry78Ba1热稳定性分析 |
| 3.3.7 新型杀虫蛋白Cry78Ba1消化稳定性分析 |
| 3.3.8 新型杀虫蛋白Cry78Ba1过敏原蛋白及结构分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）源自煤矿的苏云金杆菌的分离及其新基因的筛选鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 生物农药 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌 |
| 1.2.1 研究历史 |
| 1.2.2 Bt菌种资源现状 |
| 1.2.2.1 昆虫 |
| 1.2.2.2 土壤 |
| 1.2.2.3 植物 |
| 1.2.2.4 水环境 |
| 1.2.2.5 其他分离源 |
| 1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白及其鉴定 |
| 1.2.4 Bt转基因作物的应用现状和问题 |
| 1.2.5 Bt新基因挖掘 |
| 1.2.6 Bt基因鉴定技术 |
| 1.3 矿产资源分离微生物研究 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 供试虫源 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 试剂 |
| 2.1.6 试验仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 菌株分离 |
| 2.2.2 分离株初步鉴定 |
| 2.2.2.1 形态学鉴定 |
| 2.2.2.2 生理生化鉴定 |
| 2.2.3 生物测定 |
| 2.2.4 杀虫基因型初步鉴定 |
| 2.2.4.1 PCR鉴定 |
| 2.2.4.2 PCR产物切胶回收 |
| 2.2.4.3 连接体系 |
| 2.2.4.4 转化 |
| 2.2.4.5 测序 |
| 2.2.5 分离株新基因挖掘 |
| 2.2.5.1 Illumina HiSeq高通量测序 |
| 2.2.5.2 目的序列比对分析 |
| 2.2.6 杀虫蛋白质谱验证 |
| 2.2.6.1 晶体蛋白的制备 |
| 2.2.6.2 SDS-PAGE分析 |
| 2.2.6.3 胶内酶解 |
| 2.2.6.4 质谱分析 |
| 2.2.7 新基因生物信息学分析 |
| 2.2.7.1 DNA序列分析及蛋白理化性质预测 |
| 2.2.7.2 蛋白疏水性及Coil区分析 |
| 2.2.7.3 结构域预测 |
| 2.2.7.4 Motif搜索 |
| 2.2.7.5 蛋白二级结构预测 |
| 2.2.7.6 蛋白三维结构预测 |
| 2.2.7.7 毒素蛋白与受体结合位点预测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株筛选分离及初步鉴定 |
| 3.1.1 菌株形态学鉴定 |
| 3.1.2 菌株生理生化鉴定 |
| 3.2 生物测定 |
| 3.3 杀虫基因初步鉴定 |
| 3.4 分离株BRC-LBR2新基因挖掘 |
| 3.4.1 测序数据处理 |
| 3.4.2 目的序列挖掘分析 |
| 3.4.3 杀虫蛋白质谱验证 |
| 3.5 新基因生物信息学分析 |
| 3.5.1 DNA序列分析及蛋白理化性质预测 |
| 3.5.2 蛋白疏水性及Coil区分析 |
| 3.5.3 结构域预测 |
| 3.5.4 Motif搜索 |
| 3.5.5 蛋白二级结构预测 |
| 3.5.6 蛋白三维结构预测 |
| 3.5.7 毒素蛋白与受体结合情况预测 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 6 创新点 |
| 7 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 硕士在读期间发表论文情况 |
（3）苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1 苏云金芽胞杆菌简介 |
| 2 杀虫晶体蛋白 |
| 2.1 杀虫晶体蛋白的分类和命名 |
| 2.2 杀虫晶体蛋白的合成机制 |
| 2.2.1 转录水平调控 |
| 2.2.2 转录后水平调控 |
| 2.2.3 翻译水平调控 |
| 2.3 杀虫晶体蛋白的结构及作用机理 |
| 2.3.1 杀虫晶体蛋白的结构特征 |
| 2.3.2 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 3 芽胞杆菌同类残食行为的发现与研究现状 |
| 4 杀虫晶体蛋白C-半段的功能研究 |
| 5 辅助蛋白基因的功能研究进展 |
| 6 立题依据和意义 |
| 第二章 Bt4.0718菌株同类残食行为及其功能基因初步分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 分子生物学试剂及生化试剂 |
| 1.1.5 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.6 试剂 |
| 1.1.7 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件 |
| 1.2.2 基因模块的生物信息学分析 |
| 1.2.3 活、死细菌的荧光染色及激光共聚焦显微镜观察 |
| 1.2.4 Bt基因组DNA的提取 |
| 1.2.5 PCR扩增 |
| 1.2.6 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 1.2.7 大肠杆菌的DNA转化 |
| 1.2.8 大肠杆菌质粒DNA的提取 |
| 1.2.9 Red/ET同源重组 |
| 1.2.10 pMERⅡ质粒的构建 |
| 1.2.11 XBU001电转 |
| 1.2.12 XBU/pMERⅡ菌落PCR鉴定 |
| 1.2.13 XBU/△spRⅡ::Erm敲除菌株筛选 |
| 1.2.14 pHTsdpRIABC质粒构建 |
| 1.2.15 XBU/pHTsdpRIABC菌株构建 |
| 1.2.16 XBU/pHTsdpRIABC菌株的抑菌活性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bt4.0718菌株同类残食行为基因模块的初步分析 |
| 2.2 Bt4.0718菌株生长曲线测定和显微镜观察 |
| 2.3 Bt4.0718菌株同类残食现象的激光共聚焦显微镜观察 |
| 2.4 XBU/△spRⅡ::Erm敲除菌株的构建 |
| 2.4.1 pMERⅡ质粒的构建 |
| 2.4.2 XBU/pMERⅡ菌落PCR鉴定 |
| 2.4.3 XBU/△sdpRⅡ::Erm缺失突变株的筛选 |
| 2.5 XBU/pHTsdpRIABC表达菌株的构建 |
| 2.5.1 pHTsdpRIABC质粒构建 |
| 2.5.2 XBU/pHTsdpRIABC菌株鉴定 |
| 2.6 XBU/pHTsdpRIABC菌株的抑菌活性分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Cry1Ac原毒素非毒性区域半胱氨酸残基的功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株培养条件 |
| 1.2.2 Bt基因组DNA的提取及PCR扩增 |
| 1.2.3 大肠杆菌质粒DNA的转化及质粒DNA的提取 |
| 1.2.4 pU1Ac19克隆载体的构建 |
| 1.2.5 pHT1Ac35表达载体的构建 |
| 1.2.6 PCR介导靶位点的突变 |
| 1.2.7 突变型pMHT1Ac35表达载体的构建 |
| 1.2.8 pHT1Ac35、pMHT1Ac35在XBU001中的表达 |
| 1.2.9 Bt工程菌株镜检、发酵培养及伴胞晶体的提纯 |
| 1.2.10 Bt工程菌株发酵产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.11 Bt工程菌株杀虫晶体蛋白的溶解性分析 |
| 1.2.12 重组蛋白的生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 pU1Ac19克隆载体的构建 |
| 2.2 pHT1Ac35表达载体的构建 |
| 2.3 pHT1Ac35表达载体电转化XBU001 |
| 2.4 突变型克隆载体pMU1Ac19的构建及突变碱基的确定 |
| 2.5 突变型表达载体pMHT1Ac35的构建 |
| 2.6 突变型表达载体pMHT1Ac35电转化XBU001 |
| 2.7 表达Cry1Ac的野生及C-端单点突变Bt工程菌株的显微镜观察 |
| 2.8 表达Cry1Ac的野生及C-端单点突变Bt工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.9 表达Cry1Ac的C-端叠加突变Bt工程菌株的显微镜观察 |
| 2.10 表达Cry1Ac的C-端叠加突变Bt工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.11 Bt工程菌株杀虫晶体蛋白的溶解性分析 |
| 2.12 N-端突变型克隆载体突变碱基的确定 |
| 2.13 表达Cry1Ac的N-端单点及叠加突变工程菌株的显微镜观察 |
| 2.14 表达Cry1Ac的N-端单点及叠加突变工程菌株的蛋白表达分析 |
| 2.15 Bt重组工程菌的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 辅助蛋白对Cry11A表达的影响研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1菌株及质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 抗生素及其使用终浓度 |
| 1.1.4 DNA引物合成及测序 |
| 1.1.5 试剂 |
| 1.1.6 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 菌株的培养条件 |
| 1.2.2 pS11A、pS11A-p20及pS11A-orf2-30C重组质粒的构建 |
| 1.2.3 Bt工程菌株镜检、发酵培养及伴胞晶体提纯 |
| 1.2.4 Bt工程菌株发酵产物的SDS-PAGE分析 |
| 1.2.5 Bt菌株芽胞晶体蛋白混合物的凝胶包埋 |
| 1.2.6 重组蛋白的胶内酶解 |
| 1.2.7 蛋白酶解肽段的质谱分析及搜库分析 |
| 1.2.8 重组蛋白的生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 重组质粒及Bt重组工程菌株的构建 |
| 2.2 Bt重组工程菌的相差显微镜观察 |
| 2.3 Bt工程菌重组表达产物的SDS-PAGE分析及质谱鉴定 |
| 2.4 Bt重组工程菌的蚊虫生测 |
| 3 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 缩略表(中英文对照) |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 课题受资助的基金项目 |
（4）苏云金芽胞杆菌伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白形成相关性的研究（论文提纲范文）
| 缩写表(中英文对照) |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的研究 |
| 1.1 杀虫晶体蛋白(ICPs)的分类 |
| 1.2 杀虫晶体蛋白(ICPs)的结构 |
| 1.3 杀虫晶体蛋白(ICPs)的形成 |
| 1.3.1 转录水平调控机制 |
| 1.3.2 转录后水平调控机制 |
| 1.3.3 翻译后水平调控机制 |
| 2 分子伴侣蛋白概述 |
| 2.1 分子伴侣的定义 |
| 2.2 分子伴侣蛋白的分类 |
| 2.3 分子伴侣蛋白的功能 |
| 2.4 分子伴侣蛋白GroEL、GroES的结构和功能 |
| 2.4.1 GroEL和GroES的结构 |
| 2.4.2 GroEL和GroES的功能 |
| 2.4.3 GroEL和GroES的作用机制 |
| 3 立题依据和意义 |
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 供试菌株、质粒 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 试剂 |
| 1.3.1 试剂盒 |
| 1.3.2 Maker和酶 |
| 1.3.3 基因组提取试剂 |
| 1.3.4 琼脂糖凝胶电泳试剂 |
| 1.3.5 蛋白质凝胶电泳相关试剂 |
| 1.3.6 蛋白Ni+柱亲和纯化试剂 |
| 1.3.7 免疫印迹试剂 |
| 1.3.8 其他试剂 |
| 2 仪器与设备 |
| 3 反应体系 |
| 4 方法 |
| 4.1 苏云金芽胞杆菌基因组提取 |
| 4.2 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白的异源表达 |
| 4.2.1 groel、groes和30s ribosomal protein基因片段的获得 |
| 4.2.2 重组质粒(pET28a-GroEL、pET28a-GroES和pET28a-30s)构建 |
| 4.2.3 感受态细胞的制备 |
| 4.2.4 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白融合蛋白的表达和纯化 |
| 4.3 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白的免疫印迹检测 |
| 4.3.1 制备Anti-GroEL、Anti-GroES和Anti-30s的抗体 |
| 4.3.2 western blotting检测 |
| 4.4 groel基因的敲除 |
| 4.4.1 敲除重组载体的构建 |
| 4.4.2 groel基因的敲除 |
| 4.4.3 相差显微镜观察敲除菌株△groel和原始菌株KCTF12的差异 |
| 4.5 激光共聚焦观察伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白的相互作用 |
| 4.5.1 显微镜观察菌株的培养 |
| 4.5.2 显微镜观察菌体样品的制备 |
| 4.5.3 菌体样品的激光共聚焦显微镜观察 |
| 4.6 生物信息学分析 |
| 结果与分析 |
| 1 groel、groes和30s ribosomal protein基因的异源表达 |
| 1.1 groel、groes和30s ribosomal protein基因片段的获得 |
| 1.2 重组质粒(pET28a-GroEL、pET28a-GroES、pET28a-30s)的构建 |
| 1.3 GroEL、GroES蛋白的异源表达 |
| 2 GroEL、GroES和30s核糖体蛋白的免疫印迹检测 |
| 2.1 GroEL、GroES蛋白多克隆抗体的制备 |
| 2.2 不同生长时期Bt4.0718菌株细胞形态 |
| 2.3 Bt4.0718菌株不同生长时期GroEL、GroES蛋白的免疫印迹 |
| 3 groel基因的敲除 |
| 3.1 敲除重组载体的构建和鉴定 |
| 3.2 相差显微镜观察敲除菌株△groel与原始菌株KCTF12的差异 |
| 4 GroEL、GroES和晶体蛋白的激光共聚焦显微镜观察 |
| 5 GroEL和GroES蛋白的相互作用网络 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 课题受资助的基金项目 |
| 论文发表情况 |
（5）苏云金杆菌高效杀虫工程菌的构建及其伴胞晶体形成机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 苏云金芽胞杆菌工程菌及其杀虫晶体蛋白的研究进展 |
| 1.1 对BT菌株进行的遗传改良操作技术 |
| 1.1.1 转导 |
| 1.1.2 接合转移 |
| 1.1.3 电穿孔转化 |
| 1.1.4 克隆穿梭载体 |
| 1.1.5 基因重组 |
| 1.2 为增强BT CRY毒素杀虫活力采取的策略 |
| 1.2.1 用添加其他活性蛋白的方式增加Cry毒素的活力 |
| 1.2.2 对Cry毒素基因进行的修饰 |
| 1.3 BT基因组学及蛋白质组学研究 |
| 1.3.1 Bt基因组学研究 |
| 1.3.2 Bt菌体及伴胞晶体蛋白质组学研究 |
| 1.4 BT杀虫蛋白晶体形成机制研究 |
| 1.5 立题依据和目的意义 |
| 第二章 苏云金芽胞杆菌工程菌的构建与功能分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 优化设计合成的ω-ACTX-Hv1a基因片段 |
| 2.3.2 中间重组质粒的构建 |
| 2.3.3 ω-ACTX-Hv1a基因在大肠杆菌里的表达和多克隆抗体的制备 |
| 2.3.4 融合基因在Bt中表达载体的构建 |
| 2.3.5 融合基因工程菌Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)及伴胞晶体的显微镜观察 |
| 2.3.6 融合基因表达产物的SDS-PAGE电泳及免疫杂交分析 |
| 2.3.7 融合基因工程菌的生物活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 苏云金芽胞杆菌伴胞晶体形成机制的初步研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 融合蛋白晶体形成过程的CLSM显微镜观察 |
| 3.3.2 Cry-B(1Ac-ACTX-EGFP)和Cry-B(1Ac)shot-gun全菌体蛋白质谱检测及蛋白差异比较分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 主要研究结论与进一步研究设想 |
| 4.1 主要研究结论 |
| 4.2 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 已发表的文章目录 |
| 致谢 |
| 本论文感谢以下基金项目的资助 |
（6）苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基于反相液相色谱分离的蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 论文综述 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌 |
| 1.1.1 苏云金芽孢杆菌概述 |
| 1.1.2 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白概述 |
| 1.1.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白研究现状 |
| 1.2 蛋白质组学研究内容及主要技术手段 |
| 1.2.1 蛋白质组学的研究背景 |
| 1.2.2 蛋白质组学研究的主要技术手段 |
| 1.3 本论文的研究工作 |
| 第二章 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白透析沉淀法的分离纯化 |
| 摘要 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 样品来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的完全沉淀条件的确定 |
| 2.3.2 透析法提取苏云金杆菌杀虫晶体蛋白的条件优化 |
| 2.3.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体的分离提纯 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白完全沉淀的 pH 值结果 |
| 2.4.2 透析法提取苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的优化结果 |
| 2.4.3 苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的提取方法的讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 BT 杀虫晶体蛋白的反相液相色谱分离 |
| 摘要 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 样品来源 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 主要仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 色谱进样前苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白的多种预处理方法 |
| 3.3.2 用于高效液相色谱分析的杀虫晶体蛋白预处理 |
| 3.3.3 高效液相色谱分离 |
| 3.3.4 垂直平板 SDS-PAGE 凝胶电泳 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 杀虫晶体蛋白色谱进样前预处理方法的优化与讨论 |
| 3.4.2 反相液相色谱流动相的选择 |
| 3.4.3 反相高效液相色谱分离的结果 |
| 3.4.4 反相液相色谱分离蛋白组分的情况 |
| 3.4.5 色谱收集组分 SDS-PAGE 凝胶电泳的结果与分析 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 SDS-PAGE 凝胶中杀虫晶体蛋白的质谱鉴定 |
| 摘要 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 样品来源 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 主要仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 胶内蛋白的酶切 |
| 4.3.2 MALDI-TOF-MS 质谱检测 |
| 4.3.3 MALDI-TOF-MS 质谱数据的数据库检索 |
| 4.3.4 液质联用中液相部分的参数条件： |
| 4.3.5 LTQ ORBITRAP XL 质谱检测 |
| 4.3.6 LTQ ORBITRAP XL 质谱数据的检索 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 蛋白质条带的 MALDI-TOF-MS 肽质量指纹分析 |
| 4.4.2 SDS-PAG 凝胶中蛋白多肽的二级质谱测定与序列查询结果 |
| 4.4.3 差异蛋白质的鉴定分析 |
| 4.4.4 多肽氨基酸序列与其所属蛋白的关系 |
| 4.4.5 ICPS 蛋白 MALDI-TOF-MS 质谱与 LTQ ORBIRAP XL 质谱检测数据结果的比较 |
| 4.5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 已发表论文目录 |
（7）2D-LC-MS/MS技术分离和鉴定苏云金芽胞杆菌蛋白质组（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 1.苏云金芽胞杆菌生物活性成分的研究 |
| 2.多维液相色谱一质谱联用技术及其在微生物研究中的应用 |
| 3.立题依据和意义 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 2.方法 |
| 结果与分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 下一步工作设想 |
| 参考文献 |
| 附录 硕士期间撰写、发表与课题相关的学术论文 |
| 本论文感谢以下基金项目的资助 |
| 致谢 |
（8）苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 苏云金芽胞杆菌研究进展 |
| 1.1 Bt杀虫晶体蛋白基因 |
| 1.1.1 Bt杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 1.1.2 Bt杀虫晶体蛋白基因的表达调控 |
| 1.2 Bt杀虫晶体蛋白的结构及功能 |
| 1.2.1 Bt杀虫晶体蛋白的结构 |
| 1.2.2 晶体蛋白的作用机理 |
| 1.2.3 晶体蛋白结构与功能的关系 |
| 1.3 Bt基因组学研究 |
| 1.4 Bt伴胞晶体的蛋白质组学研究 |
| 1.5 Bt工程菌的研究进展 |
| 1.6 立题依据和目的意义 |
| 第二章 苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 研究方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Bt 4.0718菌株质粒DNA的图谱 |
| 2.3.2 Bt 4.0718菌株内cry基因的检测 |
| 2.3.3 Bt 4.0718菌株伴胞晶体的形态观察 |
| 2.3.4 Bt 4.0718菌株杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 2.3.5 Bt 4.0718菌株杀虫晶体蛋白的质谱分析 |
| 2.3.6 室内生物测定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 苏云金芽胞杆菌原毒素分子鉴定新技术的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 研究方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Bt HD1和4Q2-72菌株杀虫晶体蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 3.3.2 Bt HD1菌株晶体蛋白中原毒素组成的鉴定 |
| 3.3.3 Bt以色列亚种402-72菌株晶体蛋白中原毒素组成的鉴定 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 苏云金芽胞杆菌工程菌的构建与功能分析 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 cry1Ac-hwtx-11融合基因的构建 |
| 4.3.2 hwtx-11在BL21(DE3)中的克隆表达 |
| 4.3.3 cry1Ac-hwtx-11融合基因在Bt Cry~-B中的表达 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 主要研究结论与进一步研究设想 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（9）苏云金杆菌4.0718新菌株不同生长时期的蛋白质组研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.苏云金芽胞杆菌概论 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌的遗传改造 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌生物活性成分的研究 |
| 2.蛋白质组学技术及其应用 |
| 2.1 蛋白质组学概论 |
| 2.2 蛋白质组学技术的研究 |
| 2.3 蛋白质组学技术在杀虫微生物研究中的应用 |
| 3.立题依据和意义 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 供试菌株 |
| 1.2 培养基 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 PCR引物 |
| 2.方法 |
| 2.1 菌体培养与生长曲线的测定 |
| 2.2 细菌生长形态的观察 |
| 2.3 细菌细胞的收集及细胞总蛋白质的提取 |
| 2.4 蛋白质含量的测定 |
| 2.5 SDS-PAGE所需试剂的配置方法 |
| 2.6 SDS-PAGE |
| 2.7 双向电泳 |
| 2.8 Shotgun |
| 2.9 PCR检测 |
| 结果与分析 |
| 1.Bt4.0718菌株菌体生长曲线的测定 |
| 2.Bt4.0718菌株菌体生长形态的观察 |
| 3.样品中的蛋白质含量 |
| 4.两种样品制备方法的比较 |
| 5.细胞总蛋白质的分离和鉴定 |
| 5.1 1DE-MS/MS |
| 5.2 2DE-MS/MS |
| 5.3 细胞总蛋白质的shotgun分离鉴定 |
| 5.4 重要功能蛋白质的肽质量指纹分析或串联质谱分析 |
| 5.5 蛋白质的分类 |
| 6.Bt4.0718菌株中重要差异蛋白质的功能分析 |
| 6.1 杀虫晶体蛋白(ICPs) |
| 6.2 Bt中其它杀虫生物活性因子 |
| 6.3 晶体与芽胞形成相关蛋白质 |
| 6.4 代谢相关蛋白质 |
| 6.5 参与氨基酸或蛋白质合成的酶类或调节因子 |
| 6.6 其他蛋白质 |
| 7.camelysin和bTRX28的基因PCR检测结果 |
| 讨论 |
| 1.蛋白质抽提方法的比较分析 |
| 2.Bt细胞的生理学研究 |
| 3.生物活性因子的表达特征与Bt毒力的关系 |
| 4.晶体和芽胞结构的形成 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 致谢 |
（10）苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因与球孢白僵菌CDEP2基因的融合表达及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 1.微生物杀虫农药研究背景 |
| 2.苏云金芽胞杆菌概述 |
| 3.苏云金芽胞杆菌毒素种类 |
| 4.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白 |
| 4.1 杀虫晶体蛋白基因的命名和分类 |
| 4.2 杀虫晶体蛋白的基本特征 |
| 4.3 杀虫晶体蛋白的结构特征 |
| 5.苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 5.1 杀虫晶体蛋白与昆虫细胞膜上受体的结合 |
| 5.2 杀虫晶体蛋白引起膜穿孔的分子机制 |
| 5.3 杀虫晶体蛋白导致细胞裂解的机制 |
| 6.苏云金芽胞杆菌的研究应用现状 |
| 6.1 寻找苏云金芽胞杆菌新资源和发掘新的杀虫基因 |
| 6.2 苏云金芽胞杆菌工程菌的构建和应用 |
| 6.3 苏云金芽胞杆菌安全性方面的研究 |
| 6.4 苏云金芽胞杆菌融合基因的研究 |
| 7.球孢白僵菌的概述 |
| 8.球孢白僵菌的杀虫机理 |
| 9.球孢白僵菌杀虫毒蛋白 |
| 10.Red/ET同源重组技术 |
| 11.实验目的和意义 |
| 材料与方法 |
| 1.材料 |
| 1.1 菌株和质粒 |
| 1.2 培养基和抗生素 |
| 1.3 试剂和仪器设备 |
| 2.方法 |
| 2.1 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的克隆 |
| 2.2 球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的表达 |
| 2.3 Red/ET同源重组构建表达载体pHT-crylAc-CDEP2 |
| 2.4 重组菌株Cry ~-B-pHT-crylAc-CDEP2的构建 |
| 2.5 多克隆抗体的制备和检测 |
| 2.6 融合蛋白的Western blot检测 |
| 2.7 重组菌株的杀虫毒力生测 |
| 结果与分析 |
| 1.球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的克隆 |
| 1.1 球孢白僵菌总RNA的提取 |
| 1.2 RT-PCR合成CDEP2基因的cDNA双链 |
| 1.3 重组质粒pMD-CDEP2的筛选和鉴定 |
| 1.4 重组质粒pMD-CDEP2测序结果和同源性分析 |
| 1.5 重组质粒pET-CDEP2的筛选和鉴定 |
| 2.球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因的表达 |
| 2.1 SDS-PAGE检测诱导表达的目的蛋白 |
| 2.2 目的蛋白的分离纯化 |
| 3.表达载体pHT-crylAc-CDEP2的构建 |
| 3.1 Red/ET同源重组材料的制备 |
| 3.2 表达载体pHT-crylAc-CDEP2的酶切鉴定 |
| 3.3 融合基因片段上下游序列分析 |
| 4.重组菌株Cry ~-B-pHT-crylAc-CDEP2的构建 |
| 4.1 重组菌株Cry~-B-pHT-crylAc-CDEP2的菌落PCR鉴定 |
| 4.2 重组菌株Cry~-B-pHT-crylAc-CDEP2的SDS-PAGE检测 |
| 5.融合蛋白的Western blot检测 |
| 6.重组菌株的杀虫毒力生测 |
| 讨论 |
| 1.以crylAc基因为基础构建杀虫融合基因的研究 |
| 2.RT-PCR扩增CDEP2基因cDNA序列的方法 |
| 3.CDEP2蛋白在大肠杆菌中的表达和多克隆抗体的制备 |
| 4.关于两种制备抗原方法的比较 |
| 5.融合基因表达系统的构建策略 |
| 6.融合蛋白形成晶体的研究 |
| 7.Red/ET同源重组技术的应用 |
| 8.融合蛋白的毒理研究 |
| 9.总结 |
| 结论 |
| 1.球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶新基因CDEP2的克隆和表达 |
| 2.CDEP2多克隆抗体的制备 |
| 3.Red/ET同源重组技术 |
| 4.融合基因的克隆和表达 |
| 5.苏云金芽胞杆菌工程菌株的毒力生测 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 本人在硕士研究生期间撰写、发表和参与课题相关的科研成果和学术论文 |
| 致谢 |
四、苏云金杆菌4.0718菌株杀虫晶体65kD原毒素的质谱分析（论文参考文献）
- [1]对灰飞虱高毒力的新型Bt杀虫蛋白基因克隆及其活性研究[D]. 曹蓓蓓. 中国农业科学院, 2020
- [2]源自煤矿的苏云金杆菌的分离及其新基因的筛选鉴定[D]. 林白容. 福建农林大学, 2016(04)
- [3]苏云金芽胞杆菌杀虫晶体形成的分子机制研究[D]. 胡泉芳. 湖南师范大学, 2014
- [4]苏云金芽胞杆菌伴侣蛋白与伴胞晶体蛋白形成相关性的研究[D]. 刘霜. 湖南师范大学, 2014
- [5]苏云金杆菌高效杀虫工程菌的构建及其伴胞晶体形成机制研究[D]. 李文萍. 湖南师范大学, 2012(11)
- [6]苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白基于反相液相色谱分离的蛋白质组学研究[D]. 陈靖. 福州大学, 2011(06)
- [7]2D-LC-MS/MS技术分离和鉴定苏云金芽胞杆菌蛋白质组[D]. 黄少亚. 湖南师范大学, 2011(08)
- [8]苏云金芽胞杆菌4.0718新菌株功能基因组的研究和高效杀虫工程菌的构建[D]. 付祖姣. 湖南师范大学, 2008(11)
- [9]苏云金杆菌4.0718新菌株不同生长时期的蛋白质组研究[D]. 李小辉. 湖南师范大学, 2008(S1)
- [10]苏云金芽胞杆菌cry1Ac基因与球孢白僵菌CDEP2基因的融合表达及功能研究[D]. 曾智. 湖南师范大学, 2007(S1)