一、死亡受体及线粒体途径与激活诱导T细胞凋亡（论文文献综述）
莫灿龙[1]（2020）在《毛兰素对角质细胞增殖和凋亡的影响及树状介孔硅透皮给药系统的研究》文中研究指明银屑病作为一种慢性的,反复发作的,难以根治的皮肤疾病,它的病理特征主要表现为角质细胞的过度增殖以及异常的分化。毛兰素作为一种提取自鼓槌石斛的联卞类小分子量天然化合物,在肿瘤方面显示了强大的增殖抑制和抗血管生成的功能。然而,关于毛兰素在对于银屑病致病当中具有重要地位的角质细胞的相关作用,目前仍然没有相关的报道。于此同时,越来越多的纳米药物载体应用于皮肤局部给药方面,大大增加了药物在皮肤疾病上的治疗效果和减少了药物进入到系统循环而引起的不必要毒性。而无机材料中的介孔硅纳米载体,由于其具有比表面积大,易于修饰,高度的生物相容性和良好的生物降解性等特点,在近几年尤其是皮肤递送方面,出现了不少的报道。因此,本文一方面探讨毛兰素对人永生化角质细胞HaCaT细胞的增殖功能和凋亡方面的作用,以及探讨其潜在的药理机制,另一方面为了增强毛兰素的抑制细胞增殖能力,以及解决毛兰素水溶性差,难以到达皮肤组织发挥作用的缺点,我们构建了树状介孔硅透皮递送纳米载体。本文使用MTT试验评价毛兰素对HaCaT细胞的细胞活力影响,利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡分析法分析毛兰素对HaCaT细胞的凋亡影响,使用DCFH-DA荧光探针检测了HaCaT细胞的细胞内活性氧ROS的水平变化,使用western blot法测定毛兰素对HaCaT细胞的凋亡相关蛋白cleaved PARP与cleaved caspase-3的生成水平影响,以及检测了JNK/c-Jun信号通路和AKT/m TOR信号通路的蛋白表达水平变化。我们通过一步双相方法合成两种具有相似粒径但不同孔径的中心放射性中空通道的树状介孔硅,并对其理化性质进行表征,包括平均粒径、zeta电位、高分辨率透射电子显微镜TEM下的外观形貌、氮气吸附脱附曲线等。我们利用旋转蒸发方法将毛兰素载入到树状介孔硅里,并对其进行上述表征,通过傅里叶变换红外光谱FTIR和固定X射线衍射光谱XRD,以探讨毛兰素与树状介孔硅的结合方式,通过热重分析TGA和超高效液相色谱UPLC测量毛兰素的含量,利用透析袋法测定树状介孔硅载毛兰素的体外释放行为,并利用垂直式Franz扩散池法测定载药树状介孔硅卡波姆胶的透过猪皮的性能。我们通过合成FITC荧光标记的树状介孔硅,利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析其细胞摄取的行为,并探讨其可能的细胞摄取途径。然后通过MTT法、Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡分析法、JC-1染色法和fluo-4 AM染色法比较负载毛兰素的树状介孔硅和单纯的毛兰素对HaCaT细胞的存活率、细胞凋亡率、线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度的影响。并通过western blot法继续比较两者对线粒体介导的凋亡信号通路（Bcl-2、Bax、cytochrome c,cleaved caspase-3和cleaved PARP）和内质网应激信号通路（PERK、ATF6、IRE1α和CHOP）的影响。最终我们发现,毛兰素对HaCaT细胞的增殖能力具有抑制作用,并且能够促进HaCaT细胞的凋亡,增加凋亡相关蛋白cleaved PARP和cleaved caspase-3的生成,上调HaCaT细胞内的活性氧ROS水平,可能通过活性氧ROS介导的JNK/c-Jun信号通路和AKT/m TOR信号通路来发挥抑制增殖和促进凋亡的作用。合成出来的两种树状介孔硅的平均粒径均在160nm左右,孔径分别为3.5nm和4.6nm,载药率大约都在50%左右,并且通过表征分析得知毛兰素不仅分布在树状介孔硅的孔道里面,也有部分处于树状介孔硅的表面。和纯毛兰素组相比,树状介孔硅组能够很好地增加毛兰素的皮肤滞留量,并且树状介孔硅组能够降低毛兰素的皮肤透过量。体外药物释放实验表明毛兰素从树状介孔硅里释放出来主要分为两个阶段,爆发释放和缓慢释放阶段,最终药物累积释放量均达到70%以上。在细胞摄取行为方面,大孔径树状介孔硅的细胞摄取量比小孔径树状介孔硅的细胞摄取量大概高出3倍左右。小孔径树状介孔硅能够分别通过网格蛋白介导的细胞内吞途径,细胞膜陷穴蛋白介导的细胞内吞途径和Na+/H+离子交换受体介导的大胞饮三条途径进入到HaCaT细胞里,而大孔径树状介孔硅则通过网格蛋白介导的细胞内吞途径进入到HaCaT细胞里。和毛兰素组比较,载药树状介孔硅能够增强毛兰素的抗增殖和促凋亡作用,并且大孔径的效果相对明显。毛兰素能够影响HaCaT细胞里线粒体膜电位变化和胞内钙离子浓度,可能通过调控线粒体信号通路和内质网应激信号通路来发挥促进HaCaT细胞的凋亡作用,并且树状介孔硅作为药物载体,能够增强此过程。
孟鑫[2]（2020）在《Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究》文中研究说明肠道菌群在人类健康和疾病中起着重要的作用。肠黏膜表面的黏膜层是肠细胞与肠道菌群相互作用的场所,对维持肠道健康和肠道微生态平衡至关重要。黏蛋白2（Muc2）是肠黏膜层的主要成分。黏蛋白基因家族中有17个人类黏蛋白基因,根据其不同的结构主要分为分泌型黏蛋白和膜结合型黏蛋白两大类,其中Muc2是第一个被克隆并完全测序的人类分泌型黏蛋白基因,它主要由人结肠和小肠的杯状细胞表达,是小肠和大肠黏液的主要成分。Muc2已被证明是对抗外部病原体的重要保护屏障,与多种癌症疾病相关,如结直肠癌（CRC）、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、卵巢癌。在CRC中Muc2过表达有助于肿瘤细胞逃避抗肿瘤免疫效应分子的识别从而促进CRC的发展。Akkermansia muciniphila是肠道菌群的重要组成部分,具有多种生物学功能,如通过自身的蛋白水解酶调节Muc2的水平。Akkermansia muciniphila利用黏蛋白作为其生长唯一的碳源和氮源,还能产生多种降解黏蛋白的蛋白,但目前尚不清楚哪些蛋白可以降解黏蛋白。本论文工作主要包括三个部分:第一部分,从Akkermansia muciniphila基因库中选择一个编码假定蛋白的基因Amuc-1434,通过原核表达系统纯化重组蛋白Amuc-1434,探究其活性和基本的酶学性质。第二部分,主要制备和评估重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,研究重组蛋白Amuc-1434与结直肠癌细胞系LS174T细胞表达的Muc2之间的相互作用和其降解Muc2的能力,并研究蛋白Amuc-1434在小鼠肠道中的表达位置。第三部分,主要探究重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞增殖、周期、凋亡、ROS水平和线粒体膜电位的影响及其发挥作用的机制。第一部分:重组蛋白Amuc-1434的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究首先委托华大基因（公司）全基因合成了含有组氨酸标签的Amuc-1434重组质粒,重组的Amuc-1434以pET25b（+）为载体,酶切位点为BamH?和Xho?。将重组的Amuc-1434转到表达菌E.coli Rosetta感受态细胞中,经氨苄和氯霉素抗性筛选得到E.coli Rosetta-pET25b（+）-Amuc-1434转化子,通过对诱导条件的优化,确定在诱导时间为4 h、诱导剂IPTG浓度为1.0 mM、诱导温度为37℃条件下可以实现重组蛋白Amuc-1434的可溶表达。采用Ni2+-NTA亲和层析纯化了重组蛋白Amuc-1434,并通过Western blot鉴定了纯化结果。在接下来的测活实验中,通过紫外分光光度法发现重组蛋白Amuc-1434能够水解血红蛋白,活性为17.21 U/μg。通过动力学分析发现重组蛋白Amuc-1434对血红蛋白的Km值为0.22μM,Vmax值为0.26μM/min,Kcat值为0.18 min-1,催化效率(Kcat/Km)为0.82/min/μM。我们还发现重组蛋白Amuc-1434的浓度与水解血红蛋白的酶促反应速率呈正相关。重组蛋白Amuc-1434于pH 8.0和40℃条件下具有最佳水解活性,并且在40℃下具有良好的热稳定性,半衰期大于4 h。通过抑制剂Pepstatin A预处理,我们鉴定出重组蛋白Amuc-1434属于天冬氨酸蛋白酶家族的一员。通过不同金属离子预处理,我们发现Ca2+和Mn2+的存在能够显着提高重组蛋白Amuc-1434的活性。随后,我们发现将重组蛋白Amuc-1434含有的天冬氨酸蛋白酶保守位点“DTG”和“LLG”突变为“AAA”后,得到的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG仍然具有活性,为此,我们得出结论蛋白Amuc-1434的活性中心与“DTG”和“LLG”无关,可能涉及其序列中的其他天冬氨酸。第二部分:重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体的制备、对Muc2的降解及其在小鼠肠道中表达位置的研究本研究制备了重组蛋白Amuc-1434多克隆抗体,通过ELISA检测其效价为1:4000,通过Western blot验证其特异性良好,通过HPLC鉴定其纯度可达89.72%。Dot-blot实验和细胞黏附实验表明,重组蛋白Amuc-1434与LS174T细胞表达的Muc2之间存在相互作用,并且重组蛋白Amuc-1434浓度越高,它们之间相关作用越强。ELISA实验发现这两个蛋白间的作用表现为重组蛋白Amuc-1434对Muc2的降解作用。此外,Western blot和免疫荧光实验也发现重组蛋白Amuc-1434可以降解Muc2。随后,通过免疫组化实验发现蛋白Amuc-1434主要表达在BALB/c小鼠的结肠中。第三部分:重组蛋白Amuc-1434对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究本研究通过MTT法发现重组蛋白Amuc-1434可以抑制LS174T细胞增殖,并且和其降解Muc2的能力有关。流式细胞术分析显示重组蛋白Amuc-1434会使LS174T细胞周期阻滞在G1期,并且上调细胞周期相关蛋白p53的表达。流式细胞术分析还表明重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡,也能升高LS174T细胞内和线粒体相关的ROS水平。荧光显微镜观察表明重组蛋白Amuc-1434下调LS174T细胞线粒体膜电位。本研究通过Western blot发现重组蛋白Amuc-1434通过上调死亡配体TRAIL和与之结合的死亡受体DR4和DR5的表达激活了外源性死亡受体途径,活化形式的Caspase 8和Caspase 3被检测到表达上调,这可能是重组蛋白Amuc-1434促进LS174T细胞凋亡和抑制LS174T细胞增殖的原因。我们还发现由于Caspase 8的激活,重组蛋白Amuc-1434又间接激活线粒体途径,引起线粒体途径中凋亡相关蛋白表达的变化。研究结果显示,重组蛋白Amuc-1434诱导促凋亡蛋白Bid和Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,线粒体释放因子CytC、EndoG以及活化形式的Caspase 9表达上调,从而促进LS174T细胞凋亡。本篇论文首次表达纯化了来源于Akkermansia muciniphila的假定蛋白Amuc-1434,并发现其基本的酶学性质和天冬氨酸蛋白酶的属性,同时发现重组蛋白Amuc-1434具有降解Muc2的能力和通过上调TRAIL的表达激活细胞凋亡途径进而抑制LS174T细胞增殖的功能特性。
路璐[3]（2020）在《潞党参对UV所致小鼠背部皮肤光老化模型Fas/FasL表达影响的研究》文中研究表明背景及目的:由于日光或人造光源中的紫外线（UV）长期照射,会使得许多暴露在其中的患者皮肤出现干燥、褶皱以及色素沉着并最终导致皮肤衰老的症状,称为“皮肤光老化”。在皮肤细胞水平的研究中,皮肤光老化的发生发展是个极其复杂的过程,细胞的凋亡就是其中主要影响因素。Fas及Fas L均属于肿瘤坏死因子家族,细胞膜表面高表达的Fas L受体能够与靶细胞Fas相互识别并结合,之后启动细胞内部的凋亡程序,使靶细胞程序性的死亡。因此本实验在动物体内进行,用UV照射诱发小鼠背部皮肤光老化并服用潞党参中药液治疗,观察潞党参对小鼠皮肤光老化的拮抗作用,测定Fas和Fas L在各组小鼠皮肤组织中含量的表达情况,检测各组小鼠的细胞凋亡量,以探究潞党参在防御和治疗皮肤光老化过程中的作用及机制。材料与方法:将36只昆明小鼠随机分为六组,分别为正常对照组（NC）、UV模型组（UV）、潞党参高剂量组（L-H）、潞党参中剂量组（L-M）、潞党参低剂量组（L-L）以及VE阳性对照组（VE）,每组6只。各组小鼠常规饮水喂食饲养以适应环境,一周后每组均小鼠背部剃毛约3×3CM2面积,之后每两天一次剃毛以保证暴露小鼠背部皮肤。对除NC组外的各组小鼠照射UVA+UVB光源,照射频率为每周6次,共照射12周。造模成功小鼠给予不同剂量的药物治疗,UV模型组每日经口灌胃生理盐水,VE组每日经口灌胃维生素E,L-H组、L-M组、以及L-L组分别每日经口灌胃高剂量潞党参、中剂量潞党参和低剂量潞党参,共给药两周,给药期间除NC组外均紫外线光照至十四周。第十四周处死各组小鼠,观察并取小鼠背部剃毛部位的皮肤组织,在-70℃冰箱内保存。应用HE染色进行皮肤形态变化的观察,应用免疫组化法检测每组小鼠皮肤组织中Fas和Fas L含量的表达情况,应用TUNEL法检测凋亡细胞含量及分布。结果:1、小鼠背部皮肤的肉眼观察NC组在整个实验期间没有UV照射,背部皮肤光滑湿润无静态皱纹,皮肤弹性好,没有色素沉着、红斑、溃烂等不良表现。UV组在实验期间接受UV照射且无药物干预,皮肤表现为干燥起皮、粗糙脱屑,皮肤增厚,有明显的沟壑,凹凸不平呈皮革样改变,皮肤发红有色素沉着。L-H组、L-M组、L-L组小鼠背部皮肤状态均优于UV组,其中L-H组的小鼠背部皮肤好转最为明显,但背部仍有明显皮肤红斑,干燥并伴有少量色素沉着;L-M组小鼠皮肤仍见少量皱纹,背部红斑及色素沉着明显;L-L组小鼠背部皮肤仍见大量瘀斑暗沉,起皮结痂等。2、小鼠背部皮肤组织HE染色结果NC组小鼠皮肤组织学表现无明显异常变化,表皮层结构较为完整,真皮层内含有丰富的胶原纤维,其形态正常有序且排列有规则。UV组小鼠皮肤的表皮层厚度明显增加且厚度变化不一,表皮层有部分不完整结构,出现分层甚至模糊;真皮层明显变薄,且胶原纤维出现断裂,出现排列混乱不规则等现象,偶见炎性细胞分布。L-H剂量组皮肤结构较UV组明显改善,表皮层结构完整且增厚现象明显恢复,与真皮层的连接处较为清晰,真皮胶原纤维束显着增多,排列有序,未见炎性细胞。L-M组和L-L组的小鼠皮肤组织表现优于UV组,但表皮层仍有增厚,真皮层虽可见胶原纤维断裂但排列较为有序,提示胶原纤维束有一定程度的修复,但不如L-H组效果好。3、免疫组化法检测Fas、Fas L在各组小鼠皮肤组织的表达3.1小鼠皮肤组织中Fas的表达结果NC组中Fas含量的表达较低,与之相比,暴露于紫外线辐射的UV组中Fas表达明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。与UV模型组相比,经潞党参干预后的L-H组、L-M组、L-L组的Fas表达降低,具有统计学意义（P<0.05）。而L-H组、L-M组、L-L组与NC组相比Fas的表达仍较高,差异具有统计学意义（P<0.05）。与L-H组相比,L-M组、L-L组以及VE组的Fas表达略有增加,差异具有统计学意义（P<0.05）;与LM组比较,L-L组的Fas含量增加,具有统计学意义（P<0.05）;与L-L组相比,VE组的Fas含量降低,具有统计学意义（P<0.05）。3.2小鼠皮肤组织中Fas L的表达结果NC组小鼠皮肤组织中Fas L含量较少;与NC组比较,UV模型组皮肤组织中Fas L表达显着升高,具有统计学意义（P<0.05）,且经潞党参干预的各组与NC组相比,Fas L的含量增加,具有统计学意义（P<0.05）。与UV模型组相比,L-H组、L-M组以及VE组小鼠皮肤组织中Fas L表达降低,有统计学意义（P<0.05）。与L-H组相比,L-M组、LL组小鼠皮肤组织中Fas L的含量较高,具有统计学意义（P<0.05）;与L-M组相比,LL组小鼠皮肤中Fas L含量增高,具有统计学意义（P<0.05）;与L-L组相比,VE组小鼠皮肤中Fas L含量略有降低,具有统计学意义（P<0.05）。4、小鼠皮肤组织中Fas、Fas L表达相关性分析对资料的关联性分析结果显示:小鼠皮肤组织中Fas和Fas L表达呈正相关（相关系数:0.876,P=0.000）。5、TUNEL法检测各组小鼠皮肤细胞凋亡结果NC组小鼠皮肤组织中细胞凋亡数量极少,与NC组相比,UV模型组以及潞党参干预组的细胞凋亡数均增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。与UV模型组相比,潞党参干预各组以及VE组均可使小鼠皮肤细胞凋亡数明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。与L-H组比,L-M组、L-L组以及VE组的凋亡细胞数均增加,具有统计学差异（P<0.05）。与L-M组相比,L-L组凋亡数明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）,而VE组与之相近无明显差异,不具有统计学意义（P>0.05）。与L-L组相比,VE组细胞凋亡数明显减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1、潞党参能够保护小鼠皮肤组织免受UV照射引起的光老化损伤,且在不同剂量实验中,高剂量的保护作用最为明显。2、UV照射可以促使小鼠背部皮肤组织中Fas、Fas L过度表达,并提高皮肤组织中细胞凋亡的数量,提示光老化发病机制可能与激活Fas/Fas L信号转导通路,促进细胞凋亡有关。3、潞党参治疗的各组小鼠皮肤组织中Fas、Fas L含量以及细胞凋亡量均较UV模型组降低,提示潞党参可能通过抑制细胞中Fas/Fas L信号转导通路,减少细胞凋亡而实现抗光老化的作用。
姜博文[4]（2019）在《杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷在银屑病治疗中的作用及机制研究》文中指出银屑病是一种增生性、炎症性、慢性皮肤疾病,此病发生率高且极易复发,目前该疾病的发病机制仍不完全明确。银屑病存在发病周期长、治愈难度高等特征,使患者精神及身体皆承受压力和痛苦,明显干扰到患者的日常生活与工作,故此病被视为当前皮肤科领域内重点研究的疾病之一。目前,银屑病治疗药物主要包括甲氨蝶呤、地塞米松、维A酸类、维生素（Vit）D3类似物与糖皮质激素等,还有部分生物制剂,如依那西普等也用于此病的治疗,但这些药物及治疗手段均存在一些治疗局限性及不同程度的毒副作用,因此迫切需要开发更有效、更安全的银屑病治疗药物。1.抑制HaCaT细胞活力的化合物的筛选在本研究中,我们首先利用银屑病相关的细胞模型-人角质形成细胞HaCaT,对250余种传统中药化合物进行筛选,发现杠柳苷元能够显着抑制HaCaT细胞的活力,但在所用的剂量范围内对人成纤维细胞Hs-68的活力几乎无影响,提示杠柳苷元可能具有作为银屑病治疗候选药物的潜力。为了获得抑制HaCaT细胞活力的高效低毒的化合物,我们检测了6种杠柳苷元结构类似物对HaCaT细胞活力的影响,最后选取了对HaCaT细胞抑制作用较强,但对正常Hs-68细胞低毒的杠柳苷元结构类似物铃兰毒苷作为后续研究的化合物,并将其与杠柳苷元的活性进行了对比研究。2.杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制研究根据已有文献报道,银屑病皮损部位可观察到角质形成细胞（keratinocytes,KC）具有很强的生长、增殖和分化能力,并且凋亡受到抑制。因此,在探究杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制时,我们首先检测了杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞增殖的影响。研究结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷可通过抑制DNA合成,降低Ki67、cyclin D1和cyclin E蛋白表达水平以及增加p21蛋白表达,诱导HaCaT细胞G1/S期细胞周期阻滞,从而抑制其增殖。随后,我们通过检测杠柳苷元或铃兰毒苷处理后HaCaT细胞的形态学变化、凋亡相关蛋白casapase-3的激活情况、细胞凋亡率及凋亡抑制剂z-VAD-fmk的抑制效果,分析杠柳苷元及铃兰毒苷对HaCaT细胞凋亡的影响。结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷处理后的HaCaT细胞并未表现出明显的凋亡特征。但在通过DAPI染色观察HaCaT细胞形态时发现,经杠柳苷元或铃兰毒苷处理后的HaCaT细胞其细胞核稀疏成网状,染色质向边缘聚集、细胞肿胀最终破裂。这一形态学变化与细胞坏死的特征相似,暗示杠柳苷元或铃兰毒苷可能诱导HaCaT细胞发生坏死。随后,PI染色及细胞培养液中LDH释放检测结果表明,杠柳苷元或铃兰毒苷的作用使得HaCaT细胞的细胞膜失去完整性。此外,杠柳苷元或铃兰毒苷还可使HaCaT细胞的ATP水平下降,促进细胞坏死。透射电镜也可清楚地观察到两种化合物处理后的细胞出现细胞坏死的典型特征。同时,程序性坏死抑制剂Nec-1能够有效阻断杠柳苷元或铃兰毒苷对细胞活力的抑制作用,证实了杠柳苷元或铃兰毒苷确实是通过诱导HaCaT细胞发生程序性坏死从而抑制细胞活力的。进一步探索发生细胞程序性坏死的机制,发现在杠柳苷元或铃兰毒苷作用后的HaCaT细胞中ROS表达水平升高,而活性氧清除剂NAC、NADPH氧化酶抑制剂apocynin和程序性坏死抑制剂Nec-1均能抑制ROS的产生,并且NAC和apocynin还能够阻断杠柳苷元或铃兰毒苷诱导的程序性坏死。以上结果表明,杠柳苷元或铃兰毒苷对HaCaT细胞活力的抑制作用是通过抑制HaCaT细胞增殖及诱导细胞发生ROS介导的细胞程序性坏死来实现的。3.杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷对银屑病模型鼠的治疗作用研究前面的结果显示,杠柳苷元和铃兰毒苷在细胞水平表现出明显的抗银屑病作用,为进一步研究两种化合物对银屑病的治疗效果,我们构建了两种诱发性银屑病小鼠模型,诱导剂分别为咪喹莫特（IMQ）和佛波酯（TPA）,并探讨了两种化合物对模型鼠银屑病样病变的治疗作用。结果显示,杠柳苷元或铃兰毒苷涂抹治疗可明显缓解由咪喹莫特和佛波酯所诱导的小鼠银屑病样皮肤损伤,并显着减少新生血管的生成、血管周围炎症细胞,如CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD11b+/CD11c+树突状细胞、皮肤淋巴细胞相关抗原CLA+T细胞和Vγ4+T细胞的浸润,同时杠柳苷元和铃兰毒苷也下调了相关炎症因子IL-17A、IL-17F、IL-22、TNF-α、IFN-γ的表达水平。综上所述,我们的研究发现,杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷可通过抑制皮肤角质形成细胞的增殖和诱导其发生细胞程序性坏死、抑制免疫细胞浸润和炎症因子的异常表达来改善银屑病小鼠的皮肤损伤,从而缓解银屑病的症状。本研究从细胞和动物模型的水平揭示了两种高效低毒天然化合物的抗银屑病效果,为研发新一代银屑病治疗药物提供了新的先导化合物。
孙凯[5]（2019）在《ZEA、DON及其联合染毒对小鼠体外T淋巴细胞免疫功能及凋亡的影响》文中进行了进一步梳理玉米赤霉烯酮（ZEA）和脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是我国谷物及饲料中常见的霉菌毒素。ZEA的主要毒性为生殖毒性,DON的主要毒性为肠毒性,另外,两种毒素均具有不同程度的免疫毒性。目前,对ZEA和DON联合免疫毒性方面的报道不多,鉴于两者自然共存的现实,有必要搞清两者的联合免疫毒性效应。本试验以小鼠原代脾脏T淋巴细胞为材料,刀豆蛋白A（Con A）为T细胞活化刺激剂,研究了 ZEA、DON及其联合染毒对体外培养T淋巴细胞免疫功能及凋亡的影响。1.ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞活力及超微结构的影响采用免疫磁珠阴性分选技术从4-5周龄的BALB/c小鼠脾脏中分离获得原代T淋巴细胞。设立对照组（不含 Con A）、Con A（5mg/L）组、Con A（5mg/L）+ZEA（10、20 及 40 μM）组、Con A（5 mg/L）+DON（0.5、1 及 2 μM）组、Con A（5 mg/L）+（ZEA+DON组）（10μM ZEA+0.5μM DON、20 μM ZEA+1 μM DON、40μM ZEA+2 μM DON）,染毒24 h后,CCK-8法检测T细胞相对活力;染毒48 h后,透射电镜、扫描电镜观察T细胞超微结构损伤。结果显示,染毒24h后,与对照组相比,ConA组T细胞相对活力极显着升高（p<0.01）;与ConA组相比,不同浓度ZEA、DON处理组T淋巴细胞活力均显着或极显着降低（p<0.05或p<0.01）,并呈剂量-效应关系;与Con A组相比,不同浓度ZEA和DON联合处理组细胞活力均极显着降低（p<0.01）;与不同浓度ZEA组相比,其对应浓度联合处理组T细胞相对活力均显着或极显着降低（p<0.05或p<0.01）;与不同浓度DON组相比,10 μM ZEA+0.5μM DON联合处理组T细胞相对活力显着降低（p<0.05）,其余联合处理组未发生显着变化（p>0.05）。透射电镜观察显示,Con A刺激48 h后,T细胞细胞膜表面的微绒毛增多,线粒体的数量增多;加入20 μM ZEA、1 μM DON后,膜表面微绒毛消失,细胞核异染色质增多,线粒体肿胀;加入20 μMZEA+1μM DON后,细胞膜不再完整,空泡化增多,线粒体及细胞形态结构损伤加剧。扫描电镜观察显示,ConA刺激48 h后,T细胞体积增大,细胞膜表面微绒毛增多;加入20 μM ZEA、1μMDON后,细胞膜受到破坏不再完整;加入20μMZEA+1μMDON后,细胞膜损伤加剧。结果说明,ZEA、DON可抑制T细胞细胞活力和破坏细胞超微结构,毒素联合作用具有协同效应。2.ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞活化及其细胞毒性功能的影响以原代小鼠T淋巴细胞为材料,设立对照组（不含Con A）、ConA（5 mg/L）组、ConA（5mg/L）+ZEA（10、20 及 40μM）组、ConA（5mg/L）+DON（0.5、1 及2μM）组、ConA（5mg/L）+（ZEA+DON）组（10μMZEA+0.5μMDON、20μMZEA+1 μM DON、40μM ZEA+2μM DON）,染毒24 h后,流式细胞术检测CD25、ICOS表达情况;染毒48 h后,CBA检测细胞因子IL-2、TNF-α分泌情况,ELISA检测穿孔素（PFP）、颗粒酶A（GZMA）合成总量。结果显示,染毒24 h或48 h后,与对照组相比,Con A组CD25和ICOS表达率,IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均极显着升高（p<0.01）;与ConA组相比,不同浓度ZEA、DON处理T淋巴细胞后,CD25和ICOS表达率、IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均显着或极显着降低（p<0.05 or p<0.01）,并呈剂量-效应关系;与Con A组相比,不同浓度ZEA和DON联合处理组CD25和ICOS表达率、IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均显着或极显着降低;与不同浓度ZEA、DON组相比,其对应浓度联合处理组CD25和ICOS表达率、IL-2和TNF-α分泌、PFP和GZMA合成总量均显着或极显着降低（p<0.05 orp<0.01）。结果说明,ZEA、DON 可抑制 T 淋巴细胞 CD25、ICOS、PFP、GZMA 的表达,IL-2、TNF-α的分泌,从而影响T淋巴细胞IL-2的自分泌作用、共刺激作用及穿孔素颗粒酶途径的细胞毒性功能,毒素联合作用具有不同程度的协同或拮抗效应。3.ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞凋亡率、Fas/FasL通路、线粒体通路、MAPK通路相关蛋白的影响以原代小鼠T淋巴细胞为材料,设立对照组（不含Con A）、ConA（5 mg/L）组、ConA（5 mg/L）+ZEA（10、20 及 40 μM）组、ConA（5 mg/L）+DON（0.5、1 及 2 μM）组、Con A+ZEA+DON 组（5 mg/L ConA+10μM ZEA+0.5μM DON、5 mg/L ConA+20μM ZEA+1μMDON、5mg/LConA+40μMZEA+2μMDON）,染毒 24h后,流式细胞术检测T细胞凋亡率;设立对照组（不含Con A）、Con A组、Con A+ZEA共处理组（Con A+10、20 或 40 μM ZEA）、Con A+DON 共处理组（ConA+0.5、1或2μM DON）、Con A+ZEA+DON共处理组（ConA+20μM ZEA+1 μ DON）,染毒 24 h 后,Western Blot 检测 Fas/FasL 通路相关蛋白（Fas、FasL、Cleved Caspase-8）、线粒体通路相关蛋白（Cleved Caspase-9、Cleved Caspase-3）表达量、Bax/Bc1-2 比值和 MAPK 通路相关蛋白（ERK1/2、JNK1/2、p38）磷酸化水平。结果显示,染毒24 h后,与对照组相比,Con A组凋亡率上升但差异不显着;与ConA组相比,不同浓度ZEA、DON组凋亡率显着或极显着上升（p<0.05或p<0.01）,并呈剂量-效应关系;与Con A组相比,不同浓度ZEA和DON联合处理组凋亡率极显着上升（p<0.01）;与不同浓度ZEA组相比,其对应联合处理组细胞凋亡率极显着上升（p<0.01）;与不同浓度DON组相比,其对应联合处理组细胞凋亡率均上升但差异不显着（p>0.05）。与ConA组相比,Fas/FasL通路相关蛋白Fas、FasL、Cleved Caspase-8表达量显着或极显着上升（p<0.05或p<0.01）,线粒体通路Bax/Bc1-2比值、Cleved Caspase-9,-3蛋白表达量显着或极显着上升（p<0.05或p<0.01）,MAPK通路相关蛋白MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2磷酸化水平显着或极显着上升（p<0.05或p<0.01）。结果表明,ZEA、DON能诱导T细胞凋亡,毒素联合作用具有协同效应;ZEA、DON单独或联合暴露会激活T细胞Fas/FasL通路、线粒体通路、MAPK通路。为研究JNK在线粒体通路中的调控作用,20 μM ZEA、1μM DON分别与10μM SP600125单独或联合作用于Con A刺激的T淋巴细胞24 h,Western Blot检测JNK1/2磷酸化水平,Bax、Cleved Caspase-9,-3的蛋白表达量。结果显示,与ZEA组相比,ZEA与 SP600125 联合处理组 JNK1/2 磷酸化水平,Bax、Cleved Caspase-9、Cleved Caspase-3蛋白表达量显着降低（p<0.05）;与DON组相比,DON与SP600125联合处理组JNK1/2磷酸化水平,Bax、Cleved Caspase-9蛋白表达量显着降低（p<0.05）。结果表明,JNK参与调控线粒体通路。结论,ZEA、DON可以造成T淋巴细胞活力的下降和超微结构的损伤,同时抑制T细胞共刺激分子、细胞因子的表达,抑制T细胞的活化及杀伤效力;ZEA、DON可诱导T细胞的凋亡,ZEA、DON可通过Fas/FasL通路、线粒体通路参与调控T淋巴细胞凋亡;JNK参与调控细胞凋亡的线粒体通路。ZEA与DON联合暴露具有协同效应。
陆明敏[6]（2018）在《捻转血矛线虫排泄分泌蛋白T细胞、单核细胞结合蛋白的鉴定及其对相应细胞功能的影响》文中进行了进一步梳理捻转血矛线虫是寄生于小反刍动物皱胃,以吸食宿主血液为生的寄生性胃肠道线虫。感染捻转血矛线虫可引起严重贫血、腹泻、脱水甚至是宿主的死亡。近期的研究表明寄生性胃肠道线虫可通过产生排泄分泌物（ESP）释放免疫抑制因子与宿主免疫细胞或免疫调节分子相互作用,抑制或逃避宿主的免疫应答从而保证其存活。T细胞和单核细胞均为参与宿主机体免疫应答的核心细胞,因此针对捻转血矛线虫ESP中一些对T细胞和单核细胞功能抑制分子的研究有助于揭示其调节宿主免疫反应及产生免疫逃避的具体机制。同时鉴定出的抑制分子可作为候选疫苗抗原,用于临床治疗与研究,为控制捻转血矛线虫病提供新的方法。为此,我们进行了以下研究:1捻转血矛线虫半乳糖凝集素C端与N端糖结合域与山羊PBMC结合位点的鉴定及其功能研究在之前的研究中,我们发现捻转血矛线虫半乳糖凝集素（Hco-gal-m/f）的C端和N端糖结合域（CRD）具有不同的糖结合能力。然而,在宿主与寄生虫相互作用中,Hco-gal-m/f的不同CRD是否具有不同的免疫调节功能依然未知。在本章研究中,我们发现Hco-gal-m/f的N端CRD（MNh）和C端CRD（MCh）可通过不同的受体与山羊外周血单个核细胞（PBMC）结合:跨膜蛋白63A（TMEM63A）是MNh的结合受体,而跨膜蛋白147（TMEM147）是MCh的结合受体。此外,重组C端CRD（rMCh）具有更强抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,而重组N端CRD（rMNh）在抑制PBMC分泌一氧化氮方面具有更强的生物学效应。另外,rMNh可以抑制干扰素-γ（IFN-y）的转录,但rMCh不能。以上结果有助于增强我们对寄生性线虫半乳糖凝集素及半乳糖凝集素家族生物学多样性的了解,并有助于阐明寄生虫的免疫逃避机制。2捻转血矛线虫ESP中与山羊T细胞结合蛋白的鉴定及其对T细胞功能的影响通过免疫共沉淀及质谱分析,共筛选出114种捻转血矛线虫排泄分泌蛋白及15种T细胞受体蛋白。结合GO注释及KEGG分析,对ESP参与的T细胞的调节功能进行进一步研究,发现在体外ESP能显着抑制T淋巴细胞的活力与增殖,诱导了 FasL介导的、Caspase 8及Caspase 9参与的T细胞内源性以及外源性细胞凋亡,并且通过下调细胞周期蛋白E和D及细胞周期蛋白激酶CDK4/6和CDK2的转录阻滞T细胞G1期向S期的转化。此外,ELISA检测结果显示ESP能够抑制T细胞分泌IL-2、IL-4及IFN-y,促进T细胞分泌IL-10、IL-17以及TGF-β1。以上发现为我们寻找捻转血矛线虫ESP中T细胞功能抑制分子提供了线索,同时进一步揭示了捻转血矛线虫调节宿主T细胞免疫应答的机制。3捻转血矛线虫ESP中与山羊单核细胞结合蛋白的鉴定及其对单核细胞功能的影响通过免疫共沉淀及质谱分析,共鉴定出108种能与单核细胞结合的捻转血矛线虫排泄分泌蛋白及33种单核细胞受体蛋白。为了进一步研究ESP对山羊单核细胞调节功能,在体外使用ESP刺激单核细胞,我们发现捻转血矛线虫ESP对单核细胞的凋亡及MHC-I类分子的表达没有显着影响,但是却能抑制单核细胞分泌一氧化氮,降低其吞噬能力,并减少其MHC-II分子的表达。此外,ELISA检测结果显示ESP能够抑制单核细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-12及-TNF-a,促进其分泌IL-10,但对IL-8的分泌没有显着影响。以上发现为我们寻找捻转血矛线虫ESP中单核细胞功能抑制分子提供了线索,同时进一步阐明了捻转血矛线虫调节宿主单核细胞免疫应答的机制。4捻转血矛线虫Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM基因的克隆表达及其对T细胞功能的影响我们选取了与T细胞结合的捻转血矛线虫排泄分泌蛋白:水解酶结构包含蛋白（Hc-ABHD）、糖苷水解酶蛋白（Hc-GHD）及粘附调节因子（Hc-ADRM）。分别对捻转血矛线虫Hc-ABHD基因、Hc-GHD基因及Hc-ADRM基因进行克隆表达,并获取了重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM。Western Blot分析显示3个重组蛋白均能被感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。荧光定量检测显示Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM在捻转血矛线虫的不同发育时期均有表达,Hc-ABHD以及Hc-ADRM在雄虫中表达水平最高,而Hc-GHD在三期幼虫中表达水平最高。同时,免疫共定位结果显示天然Hc-ABHD蛋白、Hc-GHD蛋白及Hc-ADRM蛋白在捻转血矛线虫成虫内均有分布。间接免疫荧测定显示rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM均能在体外与山羊T淋巴细胞结合。通过细胞功能实验,我们发现重组蛋白rHc-ABHD及rHc-ADRM均能降低T淋巴细胞的活力,可通过提高Caspase 8、Caspase 9及Caspase 3的转录诱导T淋巴细胞内源性及外源性凋亡。与此同时,重组蛋白rHc-ABHD及rHc-ADRM均能抑制T细胞增殖,rHc-ABHD可通过下调CCNE1、CCND1及CDK4/6基因的转录阻滞T细胞G1期向S期转换,而rHc-ADRM可通过下调CCNE1和CDK2基因的转录引起T细胞G1期向S期转换的阻滞。此外,重组蛋白rHc-GHD可上调T细胞的活力,促进T细胞增殖,并可通过上调CDK4/6和CDK2基因的转录促进T细胞G1期向S期转换。ELISA测定结果显示,重组蛋白rHc-ABHD刺激可抑制T细胞分泌IL-4、TGF-β1及IFN-γ,并促进IL-10的分泌;重组蛋白rHc-GHD可促进细胞因子IL-2、IL-4以及IFN-γ的分泌;重组蛋白rHc-ADRM可抑制细胞因子IL-4、IL-10及IFN-γ的分泌。结果表明,三个捻转血矛线虫重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM在不同程度上参与了宿主T细胞的免疫调节,并且T细胞功能抑制分子Hc-ABHD和Hc-ADRM可作为候选疫苗抗原,用于进一步的临床研究。5捻转血矛线虫Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD基因的克隆表达及其对单核细胞功能的影响我们选取了与单核细胞结合的捻转血矛线虫排泄分泌蛋白:Ras结构域包含蛋白（Hc-Rab33）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶结构域包含蛋白（Hc-Mak1）以及液泡ATP酶（Hc-ATPD）。分别对捻转血矛线虫Hc-Rab33基因、Hc-Mak1基因及Hc-ATPD基因进行克隆表达,并获取了重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD。Western Blot结果显示rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD均能被感染捻转血矛线虫山羊的血清所识别。荧光定量分析显示Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD在捻转血矛线虫的不同发育时期均有表达,Hc-Rab33和Hc-ATPD在雌性成虫中表达水平最高,而Hc-Mak1在虫卵中表达水平最高。另外,免疫共定位结果显示天然Hc-Rab33、Hc-Mak 1及Hc-ATPD蛋白在捻转血矛线虫成虫内均有分布。间接免疫荧测定显示rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD均能在体外与山羊单核细胞结合。此外,我们发现rHc-Rab33能显着降低单核细胞分泌一氧化氮（NO）的水平,抑制其吞噬能力,并减少其MHC-Ⅱ类分子的表达;重组蛋白rHc-Mak1能够诱导单核细胞的凋亡;而rHc-ATPD可抑制单核细胞内NO的产生。ELISA测定结果显示,重组蛋白rHc-Rab33可抑制单核细胞分泌IL-12和TNF-α,并促进IL-10和TGF-β1分泌;重组蛋白Hc-Mak1可抑制细胞因子IL-6、IL-10以及TGF-β1分泌;而重组蛋白rHc-ATPD可促进单核细胞分泌IL-6,并抑制IL-10的分泌。以上研究结果表明,三个捻转血矛线虫重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD参与了宿主单核细胞的免疫调节,并且作为单核细胞功能抑制分子的Hc-Rab33可作为候选疫苗抗原,用于下一步研究。6捻转血矛线虫水解酶蛋白（Hc-ABHD）、粘附调节因子（Hc-ADRM）及Ras结构域包含蛋白（Hc-Rab33）抗血清免疫保护性研究我们制备了重组蛋白rHc-ABHD、rHc-ADRM及rHc-Rab33的高免山羊血清,进行免疫保护性研究。共设置5组试验组,每组5只山羊,分别为不感染并注射健康山羊血清的空白对照组、感染并注射健康山羊血清的攻虫对照组、感染并注射抗rHc-ABHD血清的实验A组、感染并注射抗rHc-ADRM血清的实验B组、感染并注射抗rHc-Rab33血清的实验C组。在攻虫前第6天和第3天分别对各试验组注射相应血清,于第0天时各攻虫试验组内山羊经口感染8000条捻转血矛线虫三期幼虫（L3）。于攻虫后的第22、24、26、28、30、32、34天采集粪便,虫卵计数。于攻虫后的第0、7、14、21、28、35天采集试验羊抗凝血与非抗凝血,抗凝血用于山羊血常规指标测定,非抗凝血用于分离血清,并检测血清中IgG1、IgA、IgE抗体及细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β1、IFN-γ、TNF-α的含量。攻虫后第35天剖杀试验羊,挑取皱胃成虫,统计荷虫数。结果显示,与攻虫对照组相比,抗rHc-ABHD血清试验组虫卵排出量减少了 50.1%,荷虫数减少66.7%;抗rHc-ADRM血清试验组虫卵排出量减少了 3 7.2%,荷虫数减少44.4%;抗rHc-Rab33血清试验组虫卵排出量减少32.1%。同时,在攻虫第35天,注射抗rHc-ABHD血清试验组及抗rHc-ADRM血清试验组与攻虫对照组相比,嗜酸性粒细胞、单核细胞、中性粒细胞比例显着下降,更趋向空白对照组,嗜碱性粒细胞、红细胞、血红蛋白、红细胞压积未见显着性变化。在攻虫第35天,与攻虫对照组相比,抗rHc-ABHD血清试验组、抗rHc-ADRM血清试验组及抗rHc-Rab33血清试验组血清内IgG1、IgA、IgE抗体含量未见显着性变化。此外,在攻虫第35天,抗rHc-ABHD血清试验组内IL-2、IL-4分泌水平显着高于攻虫对照组,抗rHc-ADRM血清试验组内IL-4分泌水平显着高于攻虫对照组,抗rHc-Rab33血清试验组与攻虫对照组相比未见显着性变化。以上结果显示注射抗rHc-ABHD山羊血清及抗rHc-ADRM山羊血清具有一定的抗捻转血矛线虫感染效果。
伊文芳[7]（2016）在《化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞影响的实验研究》文中研究表明第一部分 化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞的体外抑制作用研究背景及目的血液肿瘤治疗一直被认为是人类不可攻克的难题。由最初的放化疗到随之兴起的造血干细胞移植,医疗技术的进步为肿瘤的治疗带来了希望。但即使是这样,仍有很多的血液肿瘤治疗效果并不理想。目前常用的治疗方法就是造血干细胞移植。但是移植前长期的化疗和放疗所带来的副作用大大的降低了患者的生存质量,移植后的复发和并发症更是使得存活率明显降低。随着移植技术的不断完善和提高,移植存活率明显升高,但仍有一部分患者移植后复发,标危患者复发率为25%～30%,高危者复发可达40%以上,复发者再移植的成功率将会明显降低。近几年以嵌合抗原受体T细胞为首的细胞免疫疗法在临床上表现出良好的治疗效果,使得广大难治性恶性血液病患者看到了希望。根据肿瘤的特异性抗原,通过制作成具有特异性的嵌合抗原受体来转入T细胞以特异性攻击那些带有与嵌合抗原受体表面标记相同分子的肿瘤细胞,如用带有CD19标记分子的嵌合抗原受体T细胞治疗急性B淋巴细胞白血病,取得了很好的治疗效果。但是因为CD19抗原的限制性导致一些相关的并发症随之出现,常见的有B细胞缺乏导致的低丙种球蛋白血症,细胞因子风暴,脱靶效应,基因克隆,肿瘤溶解综合征等等,给临床带了难题,不少患者因为并发症的出现导致治疗失败乃至引起生命危险。嵌合抗原受体T细胞输注入体内后如果作用太强就会引起细胞因子风暴,攻击患者的心脏或者肺部引起死亡。在体内作用的时间太长就会引起低丙种球蛋白血症。为了避免或者减少出现这种并发症,常常采取输注丙种球蛋白来减轻低丙种球蛋白血症,IL-6托珠单抗治疗细胞因子风暴,小剂量激素减轻发热,控制炎症反应等等,虽然取得了较好的临床效果,但是仍然有许多严重的病例得不到很好的控制,这为我们在现有的治疗方法上探讨出更新更有效的治疗方式提出了要求。虽然已经有研究者实验在第四代嵌合抗原受体T细胞上安装自杀基因以在必要时启动自杀程序清除掉自身以减轻并发症,但是目前尚处于研究阶段。而化疗药物因为其临床使用经验丰富,效果确切,似乎更容易被用来作为清除嵌合抗原受体T细胞的手段,这就是我们这个实验的出发点。临床中急性B淋巴细胞白血病最为常见,研究也最为成熟,也是目前治疗效果最好的一类疾病,所以在本实验中我们以CD19嵌合抗原受体T细胞作为我们研究的实验细胞。在移植前采取输注少量的CD19嵌合抗原受体T细胞以清除肿瘤细胞减轻肿瘤负荷,还可以发挥CD19嵌合抗原受体T细胞治疗的靶向优势从而提高移植成功率,或者在采用单纯输注CD19嵌合抗原受体T细胞治疗后给予适量的化疗药物以降低CD 19嵌合抗原受体T细胞在体内的存活时间,中止CD 19嵌合抗原受体T细胞的作用,这些都不失为解决复发和改善患者生存质量的良好方法。那么化疗药物在什么时间点给予既能够杀灭肿瘤细胞又不会对后续输注的CD19嵌合抗原受体T细胞活性产生影响?或者化疗药物在什么时间点和浓度给予下,才能达到完全清除CD19嵌合抗原受体T细胞,防止CD19嵌合抗原受体T细胞相关并发症产生的目的?这就是我们这个课题需要阐明的科学问题--探讨化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞的影响,并且明确作用的最佳时间点以及作用浓度,为制定临床治疗方案奠定理论基础。研究方法1.从正常成人外周血提取T细胞,分离后经慢病毒转染制作成带有CD19靶标的T细胞,机械分离制成单细胞悬液,以免疫细胞无血清培养基重悬细胞2.在细胞培养过程中加入含有IL-2细胞因子的培养基进行扩增,每天观察细胞增长情况,行细胞计数,然后调整细胞密度接种于96孔培养板,每孔90ul,使活细胞数量约2x105个/孔,置培养箱内培养,检测细胞表面的嵌合抗原受体率达30%以上即可使用3.加入抗肿瘤药物1Oul/孔,其浓度参照血浆峰浓度值,按不同浓度依次添加。每个浓度设3个重复孔（A加药组）,同时设不加药,只加细胞和培养基的对照孔（A0加药组）及只有培养基的空白（A空白组）对照孔,继续培养24h,48h,72h和（或）96h后,每孔加入10ul的CCK8试剂,再培养适当时间,在吸光度450nm处用酶标仪检测吸光度4.计算抑制率=（A0加药组OD值-A加药组OD值）/（A0加药组OD值-A空白组OD值）*100%5.数据采用SPSS 15.0软件对实验结果进行单因素方差分析及析因设计的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果1.氟达拉滨在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞的抑制率随着时间的延长及浓度的增加而升高（P<0.05）。在高浓度时,作用96h后,抑制率均可达90%以上。2.白舒非在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞无抑制作用（P>0.05）。3.环磷酰胺在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞无抑制作用（P>0.05）。4.地塞米松在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞的抑制率随时间延长而升高（P<0.05）。在作用48h后抑制率达到最高峰,随后出现下降。5.马磷酰胺在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞的抑制作用随时间延长而加强,随浓度增大,抑制率增加（P<0.05）。在1Oug/ml时,72h抑制率在90%以上,从96h后开始抑制率降低。结论马磷酰胺为环磷酰胺的代谢产物,在体外对CD19嵌合抗原受体T细胞有抑制作用。同时也验证了环磷酰胺进入体内,首先在肝脏进行代谢,通过代谢产物在体内发挥作用,在体外没有活性。氟达拉滨、地塞米松均对CD19嵌合抗原受体T细胞有抑制作用,且随着时间的延长,抑制率增加,作用一定时间后出现抑制率下降。本实验创新点:在体外实验中,氟达拉滨,马磷酰胺及地塞米松对CD19嵌合抗原受体T细胞具有抑制作用。第二部分化疗药物诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的信号通路研究背景和目的细胞的死亡有两种方式,分为细胞凋亡和细胞坏死。细胞凋亡是细胞的基本特征之一,是指细胞为了清除自身不需要的和失去功能的细胞的一种高级调控过程。根据起始途径不同,分为死亡受体途径、线粒体途径和内质网途径。它不同于细胞坏死,不是一种被动的过程,而是一个主动的过程,涉及一系列基因的表达,调控和激活,是机体为了更好的适应外界环境变化而主动采取的一种死亡过程。可以发生在细胞生长、衰老、当细胞受到疾病和毒害因素的破坏时,例如受到放射性药物或者化学药物化疗刺激等的过程中。凋亡细胞在发生凋亡时会产生诸多重要改变,包括细胞收缩,体积变小,连接消失,与周围的细胞脱离,然后细胞质密度增加,线粒体膜电位消失,通透性改变,释放细胞色素C到胞浆,核质浓缩,核膜核仁破裂,DNA降解,细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面,导致细胞内主要物质的分离以形成凋亡小体,被巨噬细胞或者薄壁组织细胞所吞噬的现象发生。而细胞坏死是细胞受到强烈的理化或者生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大,胞膜破裂,细胞内容物外溢,核变化较慢,DNA降解不充分,引起局部严重的炎症反应。虽然随着生物技术的进步,使得我们对凋亡的认识越来越深入,但是对于它的确切机制仍然有许多需要我们去进行深究的地方。细胞的凋亡在机体的胚胎发育、组织修复、维持体内正常代谢等方面起着十分重要的作用,很多细胞生物学研究均需要检测细胞的凋亡。不同的外界因素引起凋亡的途径也不一致,在三大途径中,我们常以线粒体途径为最常见,也最为重要。我们的前阶段实验结果提示,在体外氟达拉滨,马磷酰胺及地塞米松对CD19嵌合抗原受体T细胞有不同程度的抑制作用。那么这些药物到底通过什么样的途径去发挥作用,它的作用机制是什么,这就是本实验的主要研究目的。我们通过采用Annexin V/PI凋亡试剂盒以流式方法检测CD19嵌合抗原受体T细胞表面细胞膜的磷脂酰丝氨酸是否外翻来观察CD19嵌合抗原受体T细胞的早期凋亡,以JC-1探针检测CD19嵌合抗原受体T细胞线粒体膜电位的变化再次验证凋亡的发生,并同时检测CD19嵌合抗原受体T细胞胞浆中Caspase3/7酶浓度的变化来观察凋亡发生的动态过程,探讨化疗药物诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的信号通路。方法1.氟达拉滨浓度为12.50ug/ml,马磷酰胺浓度为1Oug/ml,地塞米松浓度为5ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用24h后采用Annexin V/PI双染法检测细胞的早期凋亡率2.氟达拉滨浓度12.5ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用24h,马磷酰胺浓度为10ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用12h,利用JC-1荧光探针检测细胞膜电位的变化3.氟达拉滨浓度为12.5ug/ml,与CD19嵌合抗原受体T细胞相互作用24h,马磷酰胺浓度为1Oug/ml与CD19嵌合抗原受体T细胞共孵育6h,用流式细胞仪检测Caspase-3/7酶的浓度。采用SPSS15.0统计软件对实验结果进行析因设计资料的方差分析,配对样本T检验及单向方差分析,P<0.05为有统计学意义。结果1.经过氟达拉滨及马磷酰胺处理过的CD19嵌合抗原受体T细胞相对于未经处理过的细胞,凋亡率明显增加（P<0.05）。2.经过氟达拉滨及马磷酰胺药物处理的CD19嵌合抗原受体T细胞线粒体膜电位明显下降（P<0.05）。3.经过氟达拉滨及马磷酰胺处理后的CD19嵌合抗原受体T细胞胞内Caspase-3/7酶浓度明显增加（P<0.05）。结论通过细胞膜的翻转机线粒体膜电位的变化可以判断氟达拉滨及马磷酰胺对CD19嵌合抗原受体T细胞具有诱导早期凋亡的作用。本阶段实验的创新点:氟达拉滨及马磷酰胺有诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的作用。第三部分化疗药物对Raji细胞及Jurkat细胞的体外抑制作用研究背景和目的2015年数据报道显示,中美的实体瘤和血液肿瘤数出现明显的增长,针对血液肿瘤不同靶点的嵌合抗原受体T细胞的临床试验也是与日俱增。为了更好的研究在不同血液肿瘤疾病中化疗药物对嵌合抗原受体T细胞的作用情况,我们选取Raji细胞及Jurkat细胞作为常见疾病模型的代表,探讨化疗药物对这两种肿瘤模型作用的最佳浓度和时间,为后续进行体内验证化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞抑制作用的实验奠定理论基础。方法1.利用CCK8法检测不同数量的Raji细胞1,2,3,4,8*10E4/孔（Jurkat细胞浓度为1,2,3,4,5,6,7*10E4/孔）,在1h,2h,3h,4h各时间点的OD值,绘制标准曲线,取OD值为1的细胞数作为后续实验的基本细胞数。并以此细胞数检测在24h,48h,72h,96h时,各时间点（1h,2h,3h,4h）对应的OD值,以OD值为1-2之间的时间点作为后续实验的测定时间。2.根据每种药物的血药峰浓度值,按不同浓度依次添加。每个浓度设3个重复孔（A加药组）,同时设不加药,只加细胞和培养基的对照孔（A0加药组）及只有培养基的空白对照孔（A空白组）,继续培养24h,48h,72h或者96h后,每孔加入10ul的CCK8试剂,按照上述实验确定的时间点,在吸光度450nm处用酶标仪检测吸光度。每组重复三次,计算抑制率=（A0加药组OD值-A加药组OD值）/（A0加药组OD值-A空白组OD值）*100%。采用SPSS15.0统计软件对实验结果进行单因素方差分析,P<0.05为有统计学意义。结果1.氟达拉滨对Raji细胞及Jurkat细胞的抑制率均随时间的延长及浓度的增加而升高（P<0.05）,均在浓度为1.5625ug/ml作用72h后抑制率开始下降。2.白舒非在体外对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。3.环磷酰胺在体外对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。4.地塞米松在体外对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。5.马磷酰胺对Raji细胞及Jurkat细胞的抑制作用随时间延长而加强,随浓度增大,抑制率增加（P<0.05）。作用于Raji细胞时,在浓度为5ug/ml时,从72h开始抑制率降低。作用于Jurkat细胞时,在浓度为1.25ug/ml时,从48h开始抑制率下降。结论马磷酰胺为环磷酰胺的体外代谢产物,在体外对Raji细胞及Jurkat细胞有抑制作用。验证了环磷酰胺进入体内,首先在肝脏进行代谢,通过代谢产物在体内发挥作用,在体外没有活性。氟达拉滨对Raji细胞及Jurkat细胞有抑制作用,且随着时间延长,抑制率增加。在体外白舒非及地塞米松对Raji细胞及Jurkat细胞无抑制作用。
王健辉[8]（2015）在《Galectin-1和MGL对Jurkat细胞凋亡的协同作用及其机制研究》文中研究表明诱导T细胞凋亡、降低机体的细胞免疫能力是肿瘤细胞免疫逃逸的重要机制之一。有研究表明,某些肿瘤细胞分泌的半乳凝素-1（Galectin-1,Gal-1）,可以诱导T细胞凋亡。另外,表达于肿瘤微环境中的未成熟树突细胞（immature dentritic cells,i DC）以及耐受性树突细胞（tolerogenic dentritic cell,t DC）表面的巨噬细胞半乳糖型凝集素（macrophage galactose-type lectin,MGL）亦可诱导T细胞凋亡。但Gal-1和MGL是通过何种信号途径诱导T细胞凋亡以及Gal-1和MGL是否能够协同诱导T细胞凋亡并不清楚。在本研究中,我们首先构建了Gal-1原核表达载体,并在体外诱导表达纯化得到Gal-1蛋白,其次分别对Gal-1和MGL诱导T细胞凋亡的信号途径进行了初步探究,最后研究了二者是否能够协同诱导T细胞的凋亡。在本研究中,Jurkat细胞系被作为体外测试的T细胞模型。为获得实验所需的Gal-1蛋白,我们构建了Gal-1原核表达载体,通过PCR验证、双酶切验证和测序验证结果表明,原核表达载体构建成功。通过对大肠杆菌BL21原核表达条件的优化,我们最终成功获得了可用于后续实验的能与Jurkat细胞结合的可溶性Gal-1蛋白。在Gal-1诱导T细胞凋亡的实验中,我们首先验证了四种白血病细胞系THP-1、U937、KG1、K562均可分泌Gal-1蛋白。其次,我们将Gal-1蛋白与T细胞共孵育,并通过FACS检测表明,Gal-1可以有效诱导T细胞凋亡。在随后的Western blot和免疫荧光实验中我们发现,Gal-1是通过caspase非依赖且AIF非依赖的途径诱导T细胞凋亡。在MGL诱导T细胞凋亡的实验中,我们首先验证了i DC可以特异性地表达MGL。其次,我们将MGL蛋白与T细胞共孵育,并通过FACS检测表明,MGL亦可有效诱导T细胞凋亡。接下来的Western blot和免疫荧光实验表明,MGL是通过caspase非依赖的AIF入核的途径诱导T细胞凋亡。上述研究表明,Gal-1和MGL是通过不同的途径诱导T细胞凋亡。因此我们推测,Gal-1和MGL应该具有协同诱导T细胞凋亡的作用。我们将Gal-1和MGL蛋白与T细胞共孵育,经FACS检测证实,二者确实可以协同诱导T细胞的凋亡。对Gal-1和MGL协同诱导T细胞凋亡的作用及机制研究,不仅有助于揭示白血病细胞免疫逃逸的分子机制,同时也将为研发阻断白血病细胞诱导T细胞凋亡的药物前体提供重要的前期实验基础。
潘云,王俐,李向培[9]（2012）在《T淋巴细胞凋亡信号途径与系统性红斑狼疮》文中研究表明T淋巴细胞来源于骨髓中的淋巴样前祖细胞,在胸腺中发育成熟,具有介导细胞免疫应答并辅助机体产生体液免疫应答的功能。细胞凋亡（apoptosis）是程序性细胞死亡,机体通过凋亡机制清除衰老及异常细胞,在维持细胞数量平衡及正常功能方面有重要作用。T淋巴细胞功能异常和凋亡紊乱
杨洁,邓子鲲,朱彤阳,张臻,甘子仪[10]（2012）在《肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体临床治疗应用前景》文中进行了进一步梳理肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）具有选择性细胞毒性,不仅诱导肿瘤细胞凋亡,还诱导肝和脑细胞凋亡,也诱导病毒感染的细胞凋亡,但对机体正常组织无毒性。TRAIL已成为全球新药研究的热点。本文从TRAIL的凋亡通路及其调控、肿瘤细胞对TRAIL抵抗的原因综述TRAIL在难治性疾病治疗中的应用。
二、死亡受体及线粒体途径与激活诱导T细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、死亡受体及线粒体途径与激活诱导T细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）毛兰素对角质细胞增殖和凋亡的影响及树状介孔硅透皮给药系统的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 银屑病 |
| 1.1.1 发病机制 |
| 1.1.2 角质细胞扮演的角色 |
| 1.1.3 治疗策略 |
| 1.2 毛兰素 |
| 1.2.1 来源 |
| 1.2.2 药理作用 |
| 1.3 细胞凋亡的分子机制 |
| 1.3.1 死亡受体介导的细胞凋亡途径 |
| 1.3.2 线粒体介导的细胞凋亡途径 |
| 1.3.3 内质网应激(ER srtress,ERS)介导的细胞凋亡途径 |
| 1.4 纳米透皮给药系统 |
| 1.5 本课题的研究意义及主要内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 第二章 毛兰素对角质细胞的增殖、凋亡及其机制的初步研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞增殖实验 |
| 2.3.3 细胞凋亡实验 |
| 2.3.4 细胞内活性氧ROS含量检测 |
| 2.3.5 Western blot实验 |
| 2.3.6 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 毛兰素抑制HaCaT细胞的增殖 |
| 2.4.2 毛兰素诱导HaCaT细胞的凋亡 |
| 2.4.3 毛兰素诱导HaCaT细胞的活性氧ROS生成 |
| 2.4.4 毛兰素通过活性氧ROS抑制HaCaT细胞的增殖和促进其凋亡 |
| 2.4.5 毛兰素影响JNK/c-Jun和 AKT/mTOR信号通路 |
| 2.4.6 毛兰素可能通过活性氧ROS调控JNK/c-Jun和 AKT/m TOR信号通路 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 树状介孔硅透皮给药系统的构建与评价 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 树状介孔硅纳米粒的合成 |
| 3.3.2 载药 |
| 3.3.3 药物定量 |
| 3.3.4 表征 |
| 3.3.5 体外透皮试验 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 装载毛兰素的树状介孔硅的表征 |
| 3.4.2 体外透皮试验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 树状介孔硅纳米给药载体对角质细胞的影响及其机制的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 树状介孔硅纳米粒的合成 |
| 4.3.2 载药 |
| 4.3.3 药物定量 |
| 4.3.4 表征 |
| 4.3.5 体外药物释放 |
| 4.3.6 细胞培养 |
| 4.3.7 细胞摄取实验 |
| 4.3.8 细胞增殖实验 |
| 4.3.9 细胞凋亡实验 |
| 4.3.10 线粒体膜电位检测 |
| 4.3.11 胞内钙离子浓度检测 |
| 4.3.12 Western blot实验 |
| 4.3.13 统计分析 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 体外药物释放和细胞摄取 |
| 4.4.2 载药树状介孔硅抑制HaCaT细胞的增殖和促进其凋亡 |
| 4.4.3 载药树状介孔硅可能通过线粒体信号通路促进HaCaT细胞的凋亡 |
| 4.4.4 载药树状介孔硅可能通过调控内质网应激来促进HaCaT细胞的凋亡 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附表 |
（2）Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 AKKERMANSIA MUCINIPHILA的基本特性和生物学功能 |
| 1.1.1 Akkermansia muciniphila在肠道中的分布及特征 |
| 1.1.2 Akkermansia muciniphila在宿主健康中的作用 |
| 1.1.3 Akkermansia muciniphila与免疫系统 |
| 1.2 分泌型黏蛋白MUC2 |
| 1.2.1 Muc2 结构、功能与肠道内稳态 |
| 1.2.2 Muc2 与肠道相关疾病 |
| 1.3 结直肠癌(CRC) |
| 1.3.1 CRC简介 |
| 1.3.2 CRC与 TRAIL相关的凋亡途径 |
| 1.3.3 ROS与 CRC |
| 1.4 立题依据和研究内容 |
| 1.4.1 立题依据 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 重组蛋白AMUC-1434 的纯化、活性鉴定、酶学性质及其活性位点的初步探究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验用品 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验材料 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验溶液 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 重组质粒的转化 |
| 2.3.2 重组蛋白的诱导表达及表达条件优化 |
| 2.3.3 重组蛋白的纯化 |
| 2.3.4 纯化蛋白浓度的测定 |
| 2.3.5 Western blot鉴定纯化蛋白 |
| 2.3.6 纯化蛋白活性的测定 |
| 2.3.7 重组蛋白Amuc-1434 动力学反应的测定 |
| 2.3.8 重组蛋白Amuc-1434 浓度对酶促反应速率影响的研究 |
| 2.3.9 重组蛋白Amuc-1434 最适反应pH和温度的测定 |
| 2.3.10 重组蛋白Amuc-1434 温度稳定性的测定 |
| 2.3.11 抑制剂对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.3.12 金属离子对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.3.13 点突变对重组蛋白Amuc-1434 活性影响的研究 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 重组蛋白Amuc-1434 诱导条件的优化 |
| 2.4.2 重组蛋白Amuc-1434 的纯化及Western blot鉴定 |
| 2.4.3 重组蛋白Amuc-1434 的活性测定 |
| 2.4.4 重组蛋白Amuc-1434 动力学检测 |
| 2.4.5 重组蛋白Amuc-1434 浓度与酶促反应速率的关系 |
| 2.4.6 重组蛋白Amuc-1434 的最适pH值 |
| 2.4.7 重组蛋白Amuc-1434 的最适反应温度和热稳定性 |
| 2.4.8 几种蛋白酶抑制剂对重组蛋白Amuc-1434 活性的影响 |
| 2.4.9 金属离子对重组蛋白Amuc-1434 活性的影响 |
| 2.4.10 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG的纯化 |
| 2.4.11 突变的重组蛋白Amuc-1434mut-DTG-LLG活性测定 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 重组蛋白AMUC-1434 多克隆抗体的制备、对 MUC2 的降解及其在肠道中表达位置的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验用品 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验材料 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 实验溶液 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 抗原的处理 |
| 3.3.2 抗血清的制备 |
| 3.3.3 抗血清效价检测 |
| 3.3.4 抗血清特异性检测 |
| 3.3.5 HPLC检测抗血清纯度 |
| 3.3.6 细胞培养 |
| 3.3.7 贴壁细胞总蛋白的提取 |
| 3.3.8 Dot-blot检测蛋白间相互作用 |
| 3.3.9 Sandwich ELISA免疫分析 |
| 3.3.10 Western blot实验 |
| 3.3.11 细胞黏附实验 |
| 3.3.12 Muc2 降解实验 |
| 3.3.13 免疫荧光实验 |
| 3.3.14 组织切片的制作 |
| 3.3.15 免疫组化实验 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 重组蛋白Amuc-1434 抗体效价的评估 |
| 3.4.2 重组蛋白Amuc-1434 抗体特异性和纯度的检测 |
| 3.4.3 重组蛋白Amuc-1434与Muc2 的相互作用 |
| 3.4.4 重组蛋白Amuc-1434对Muc2 表达细胞的黏附作用 |
| 3.4.5 重组蛋白Amuc-1434 降解Muc2 |
| 3.4.6 蛋白Amuc-1434在BALB/c小鼠肠道中的表达位置 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 重组蛋白AMUC-1434 对结直肠癌细胞LS174T增殖的抑制作用及机制的研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验用品 |
| 4.2.1 实验仪器 |
| 4.2.2 实验材料 |
| 4.2.3 实验试剂 |
| 4.2.4 实验溶液 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 MTT |
| 4.3.3 细胞周期实验 |
| 4.3.4 细胞凋亡实验 |
| 4.3.5 ROS水平检测 |
| 4.3.6 线粒体膜电位检测 |
| 4.3.7 细胞凋亡相关蛋白表达水平的检测 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 重组蛋白Amuc-1434 抑制LS174T细胞增殖 |
| 4.4.2 重组蛋白Amuc-1434对LS174T细胞周期的影响 |
| 4.4.3 重组蛋白Amuc-1434 诱导LS174T细胞凋亡 |
| 4.4.4 重组蛋白Amuc-1434 增加LS174T细胞内ROS含量 |
| 4.4.5 重组蛋白Amuc-1434 引起LS174T细胞线粒体膜电位下降 |
| 4.4.6 重组蛋白Amuc-1434 影响LS174T细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（3）潞党参对UV所致小鼠背部皮肤光老化模型Fas/FasL表达影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器及设备 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 小鼠皮肤光老化模型制备 |
| 2.1.1 实验动物分组 |
| 2.1.2 实验动物造模 |
| 2.2 动物给药干预 |
| 2.2.1 给药剂量的计算 |
| 2.2.2 各组小鼠给药情况 |
| 2.3 取材 |
| 2.4 制备实验标本 |
| 2.5 实验方法和步骤 |
| 2.5.1 试剂配制 |
| 2.5.2 各组小鼠皮肤组织HE染色 |
| 2.5.3 各组小鼠皮肤组织免疫组化检测 |
| 2.5.4 细胞凋亡检测原理和步骤 |
| 2.6 结果判定 |
| 2.6.1 HE染色结果判定 |
| 2.6.2 免疫组化结果判定 |
| 2.6.3 凋亡细胞阳性结果判定 |
| 2.7 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1.小鼠背部皮肤的肉眼观察 |
| 2.小鼠皮肤组织HE染色结果 |
| 3.免疫组化法检测各组小鼠皮肤组织中Fas的表达结果 |
| 4.免疫组化法检测各组小鼠皮肤组织中FasL的表达结果 |
| 5.Fas与 Fas L表达相关性 |
| 6.TUNEL法检测各组小鼠皮肤细胞凋亡结果 |
| 讨论 |
| 1.皮肤光老化的发病机制 |
| 1.1 皮肤光老化现代医学的发病机制 |
| 1.1.1 光老化西医病因 |
| 1.1.2 光老化西医病机 |
| 1.2 光老化的中医病因病机 |
| 1.2.1 光老化中医病因 |
| 1.2.2 光老化中医病机 |
| 2.皮肤光老化的防治 |
| 2.1 西医防治 |
| 2.2 中医防治 |
| 3.潞党参相关的药理作用及实验研究 |
| 3.1 从中医认识潞党参治疗光老化 |
| 3.1.1 从潞党参性味论治光老化 |
| 3.1.2 从潞党参归经论治光老化 |
| 3.2 从西医认识潞党参治疗光老化 |
| 3.2.1 党参多糖治疗光老化 |
| 3.2.2 党参水提取物治疗光老化 |
| 4.实验动物的选择 |
| 5.实验指标选择:Fas/Fas L凋亡因子与皮肤光老化的关系 |
| 5.1 细胞凋亡与皮肤光老化 |
| 5.2 细胞凋亡与Fas/Fas L |
| 5.3 Fas/Fas L与皮肤光老化 |
| 6.潞党参对光老化模型的影响 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞凋亡及其相关疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（4）杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷在银屑病治疗中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 一、银屑病 |
| (一)银屑病的概述 |
| (二)银屑病的发病机制 |
| (三)银屑病的治疗 |
| (四)银屑病样模型 |
| 二、细胞程序性坏死 |
| (一)细胞程序性坏死的信号通路 |
| (二)细胞程序性坏死与活性氧ROS |
| (三)细胞程序性坏死的特征 |
| (四)细胞程序性坏死的检测方法 |
| 三、杠柳苷元及其衍生物的研究进展 |
| (一)杠柳苷元的简介 |
| (二)杠柳苷元的生物学活性 |
| (三)铃兰毒苷的简介 |
| (四)铃兰毒苷的生物学活性 |
| 四、本研究的目的和意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| (一)化合物 |
| (二)细胞株 |
| (三)实验动物 |
| (四)实验试剂 |
| 二、实验仪器 |
| 三、实验方法 |
| (一)细胞的培养 |
| (二)抑制HaCaT细胞活力的中药单体化合物的筛选 |
| (三)杠柳苷元及其结构类似物对HaCaT细胞及Hs-68 细胞IC_(50)和IC_(10)的检测 |
| (四)免疫荧光染色 |
| (五)BrdU掺入检测 |
| (六)流式细胞术检测细胞周期 |
| (七)免疫印迹分析 |
| (八)DAPI染色 |
| (九)TUNEL染色 |
| (十)抑制剂作用的检测 |
| (十一)细胞形态观察和PI染色 |
| (十二)乳酸脱氢酶(LDH)释放检测 |
| (十三)ATP检测 |
| (十四)流式细胞术检测细胞凋亡率和坏死率 |
| (十五)透射电镜实验观察细胞结构 |
| (十六)流式细胞术检测细胞中的ROS水平 |
| (十七)IMQ诱导的银屑病样小鼠模型的制备 |
| (十八)TPA诱导的银屑病样小鼠模型的制备 |
| (十九)HE染色 |
| (二十)ELISA检测组织中炎症因子表达量 |
| (二十一)流式细胞术检测组织中炎症细胞数量 |
| (二十二)免疫组织化学染色 |
| (二十三)统计学分析 |
| 第三章 实验结果 |
| 一、抑制HaCaT细胞活力的中药化合物的筛选 |
| (一)抑制HaCaT细胞活力的中药化合物筛选 |
| (二)杠柳苷元及其结构类似物对HaCaT细胞活力的影响 |
| 二、杠柳苷元和铃兰毒苷抑制HaCaT细胞活力的机制研究 |
| (一)杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞增殖的影响 |
| (二)杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞凋亡的影响 |
| (三)杠柳苷元和铃兰毒苷对HaCaT细胞坏死的影响 |
| (四)杠柳苷元和铃兰毒苷诱导HaCaT细胞发生程序性坏死的机制研究 |
| 三、杠柳苷元和铃兰毒苷对银屑病样模型小鼠的治疗作用 |
| (一)杠柳苷元和铃兰毒苷对IMQ诱导的银屑病样模型小鼠的治疗作用 |
| (二)杠柳苷元和铃兰毒苷对TPA诱导的银屑病样模型小鼠的治疗作用 |
| 第四章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间公开发表论文及着作情况 |
（5）ZEA、DON及其联合染毒对小鼠体外T淋巴细胞免疫功能及凋亡的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 玉米赤霉烯酮毒性研究进展 |
| 1 玉米赤霉烯酮简介 |
| 2 ZEA的污染状况 |
| 3 ZEA的吸收和代谢 |
| 4 ZEA的毒性作用 |
| 4.1 ZEA的遗传毒性 |
| 4.2 ZEA的生殖和发育毒性 |
| 4.3 ZEA的免疫毒性 |
| 第二章 脱氧雪腐镰刀菌烯醇毒性研究进展 |
| 1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇简介 |
| 2 DON的污染状况 |
| 3 DON的毒性作用 |
| 3.1 DON的肠毒性 |
| 3.2 DON的免疫毒性 |
| 第三章 DON、ZEA的自然共存及其联合毒理效应 |
| 1 霉菌毒素的自然共存 |
| 2 ZEA、DON的联合毒性效应 |
| 3 联合作用指数法对研究霉菌毒素相互作用的应用 |
| 第四章 细胞免疫应答与T淋巴细胞的功能 |
| 1 T细胞介导的免疫应答 |
| 2 T细胞的活化与双信号学说 |
| 3 T细胞介导的细胞毒性 |
| 4 本研究的目的与意义 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞活力及超微结构的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 脾脏淋巴细胞原代培养 |
| 2.3 免疫磁珠阴性分选T淋巴细胞及T细胞纯度的鉴定 |
| 2.4 CCK-8比色法检测ZEA、DON及其联合染毒对T淋巴细胞细胞活力的影响 |
| 2.5 透射电镜观测 |
| 2.6 扫描电镜观测 |
| 2.7 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 细胞提取分选后的纯度鉴定 |
| 3.2 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞相对活力的影响 |
| 3.3 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞超微结构损伤的观测 |
| 4 讨论 |
| 第二章 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞活化及其细胞毒性功能的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 小鼠脾脏淋巴细胞分离培养 |
| 2.2 流式细胞术检测ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞CD25表达的影响 |
| 2.3 流式细胞术检测ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞ICOS表达的影响 |
| 2.4 流式液相多重蛋白定量技术 |
| 2.5 ELISA检测ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞胞内蛋白PFP、GZMA表达的影响 |
| 2.6 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞CD25表达的影响 |
| 3.2 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞协同刺激分子ICOS表达的影响 |
| 3.3 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞IL-2、TNF-α分泌的影响 |
| 3.4 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞胞内PFP、GZMA表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞凋亡的影响 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 小鼠脾脏淋巴细胞分离培养及T淋巴细胞的磁珠分选提纯 |
| 2.3 流式细胞术检测T淋巴细胞的凋亡 |
| 2.4 蛋白免疫印迹 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 流式细胞术检测ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞凋亡的影响 |
| 3.2 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞Fas/FasL信号通路相关蛋白的影响 |
| 3.3 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞线粒体信号通路相关蛋白的影响 |
| 3.4 ZEA、DON及其联合染毒对小鼠T淋巴细胞MAPK信号通路相关蛋白的影响 |
| 3.5 ZEA与SP600125联合使用检测ZEA对小鼠T淋巴细胞线粒体信号通路相关蛋白的影响 |
| 3.6 DON与SP600125联合使用检测DON对小鼠T淋巴细胞线粒体信号通路相关蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）捻转血矛线虫排泄分泌蛋白T细胞、单核细胞结合蛋白的鉴定及其对相应细胞功能的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫及捻转血矛线虫病 |
| 1 捻转血矛线虫病概述 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 生活史 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 致病作用、病理变化及临床症状 |
| 2.2 捻转血矛线虫病的诊断 |
| 2.3 捻转血矛线虫病的防治 |
| 2.4 捻转血矛线虫的抗药性 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 寄生性胃肠道线虫感染与免疫研究 |
| 1 寄生性胃肠道线虫病概述 |
| 2 寄生性胃肠道线虫感染与宿主免疫应答 |
| 2.1 机体检测 |
| 2.2 信号转导 |
| 2.3 机体免疫诱导 |
| 2.4 免疫排斥 |
| 2.5 机体修复 |
| 3 捻转血矛线虫感染与宿主免疫应答 |
| 3.1 三期幼虫、四期幼虫与宿主免疫应答 |
| 3.2 捻转血矛线虫成虫与宿主免疫应答 |
| 4 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 反刍动物胃肠道线虫免疫调节分子研究进展 |
| 1 反刍动物胃肠道线虫概述 |
| 2 胃肠道线虫调节分子 |
| 2.1 半乳糖凝集素 |
| 2.2 蛋白酶抑制剂 |
| 2.3 补体系统抑制分子 |
| 2.4 巨噬细胞迁移抑制因子 |
| 2.5 其他免疫调节性分子 |
| 3 免疫调节分子用于疫苗研究 |
| 3.1 捻转血矛线虫 |
| 3.2 背带线虫 |
| 4 总结 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第四章 捻转血矛线虫半乳糖凝集素C端与N端糖结合域与山羊PBMC结合位点的鉴定及功能研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组表达质粒pET-32a-MNh及pET-32a-MCh双酶切鉴定 |
| 2.2 重组蛋白rMNh及rMCh的纯化 |
| 2.3 rMNh及rMCh与山羊PBMC结合 |
| 2.4 MNh及MCh在山羊PBMC上受体鉴定 |
| 2.5 rMCh与rMNh对细胞增殖的作用 |
| 2.6 rMCh与rMNh对山羊PBMC一氧化氮分泌的影响 |
| 2.7 rMCh与rMNh对山羊PBMC凋亡作用 |
| 2.8 rMCh与rMNh对山羊PBMC细胞因子转录的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 捻转血矛线虫ESP中与山羊T细胞结合蛋白的鉴定及其对T细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 捻转血矛线虫ESP的获取与多克隆抗体的制备 |
| 2.2 山羊T细胞的磁珠分选 |
| 2.3 捻转血矛线虫ESP与山羊T细胞的结合 |
| 2.4 捻转血矛线虫ESP与山羊T细胞体外免疫共沉淀的SDS-PAGE和Western Blot分析 |
| 2.5 LC-MS/MS鉴定与分析 |
| 2.6 GO注释与KEGG分析 |
| 2.7 ESP对T细胞活力影响 |
| 2.8 ESP对T细胞凋亡的影响 |
| 2.9 ESP对T细胞增殖的影响 |
| 2.10 ESP对T细胞周期的影响 |
| 2.11 ESP对T细胞主要分型的影响 |
| 2.12 ESP对T细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 捻转血矛线虫ESP中与山羊单核细胞结合蛋白的鉴定及其对单核细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 山羊单核细胞磁珠分选 |
| 2.2 捻转血矛线虫ESP与山羊单核细胞的结合 |
| 2.3 捻转血矛线虫ESP与山羊单核细胞体外免疫共沉淀的SDS-PAGE和Western Blot分析 |
| 2.4 LC-MS/MS鉴定与分析 |
| 2.5 GO注释与KEGG分析 |
| 2.6 ESP对单核细胞分泌一氧化氮水平影响 |
| 2.7 ESP对单核细胞吞噬能力影响 |
| 2.8 ESP对单核细胞MHC分子表达影响 |
| 2.9 ESP对单核细胞凋亡影响 |
| 2.10 ESP对单核细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 捻转血矛线虫Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM基因的克隆表达及其对T细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒pET28a-HcABHD、pET-32a-HcGHD及pET-32a-HcADRM的双酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM的纯化 |
| 2.4 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM的Western blot分析 |
| 2.5 捻转血矛线虫不同发育阶段Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM转录水平的变化 |
| 2.6 Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM的组织定位 |
| 2.7 重组蛋白Hc-ABHD、Hc-GHD及Hc-ADRM与山羊T细胞结合 |
| 2.8 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞活力影响 |
| 2.9 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞凋亡及相关信号通路的影响 |
| 2.10 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞增殖的影响 |
| 2.11 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T细胞周期及相关通路的影响 |
| 2.12 重组蛋白rHc-ABHD、rHc-GHD及rHc-ADRM对T淋巴细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 捻转血矛线虫Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD基因的克隆表达及其对单核细胞功能的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD的PCR扩增 |
| 2.2 重组质粒pET28a-HcRab33、pET28a-HcMak1及pET28a-HcATPD的双酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白rHc-Rb33、rHc-Mak1及rHc-ATPD的纯化 |
| 2.4 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD的Western blot分析 |
| 2.5 捻转血矛线虫不同发育阶段Hc-Rb33、Hc-Mak1及Hc-ATPD转录水平的变化 |
| 2.6 Hc-Rab33、Hc-Mak1及Hc-ATPD的组织定位 |
| 2.7 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD与山羊单核细胞结合 |
| 2.8 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞NO分泌水平的影响 |
| 2.9 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞吞噬能力的影响 |
| 2.10 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞内MHC-11分子表达水平的影响 |
| 2.11 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对单核细胞凋亡的影响 |
| 2.12 重组蛋白rHc-Rab33、rHc-Mak1及rHc-ATPD对细胞因子分泌水平的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 捻转血矛线虫水解酶包含蛋白(Hc-ABHD)、粘附调节因子(Hc-ADRM)和Ras结构域包含蛋白(Hc-Rab33)抗血清免疫保护性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 虫卵排出情况 |
| 2.2 成虫减少率 |
| 2.3 血常规检测 |
| 2.4 血清抗体检测 |
| 2.5 细胞因子检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 博士期间论文发表情况 |
（7）化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞的体外抑制作用 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 统计分析 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 化疗药物诱导CD19嵌合抗原受体T细胞凋亡的信号通路 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 统计分析 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 化疗药物对Raji细胞及Jurkat细胞的体外抑制作用 |
| 一. 材料与方法 |
| 二. 统计分析 |
| 三. 结果 |
| 四. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩略词表 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（8）Galectin-1和MGL对Jurkat细胞凋亡的协同作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文对照及英文缩写词表 |
| 1 引言 |
| 1.1 Gal-1 |
| 1.1.1 Gal-1 的结构、配体和分布 |
| 1.1.2 Gal-1 生理功能 |
| 1.2 MGL |
| 1.2.1 MGL的发现、配体及分布 |
| 1.2.2 MGL生理功能 |
| 1.3 细胞凋亡 |
| 1.3.1 细胞凋亡的定义和特征 |
| 1.3.2 细胞凋亡信号通路 |
| 1.4 立题依据和研究思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要实验材料和试剂 |
| 2.1.1 质粒和细菌菌株 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 抗体及主要试剂 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 RT-PCR |
| 2.3.3 Real-time PCR |
| 2.3.4 Western blot |
| 2.3.5 人外周血单核细胞提取以及DC的诱导分化 |
| 2.3.6 T淋巴细胞分选 |
| 2.3.7 流式细胞术 |
| 2.3.8 PCR产物回收 |
| 2.3.9 小提质粒 |
| 2.3.10 双酶切、连接、转化 |
| 2.3.11 蛋白诱导表达、纯化及浓缩 |
| 2.3.12 Gal-1 结合 |
| 2.3.13 凋亡实验 |
| 2.3.14 免疫荧光 |
| 2.3.15 图片采集及数据分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 人重组Gal-1 蛋白体外表达与纯化 |
| 3.1.1 PCR获得Gal-1 全长基因片段 |
| 3.1.2 pET-22b-Gal-1 原核表达载体的鉴定 |
| 3.1.3 人重组Gal-1 蛋白的表达与纯化 |
| 3.1.4 成功获得有活性的Gal-1 蛋白 |
| 3.2 Gal-1 通过caspase非依赖的方式诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 3.2.1 恶性白血病细胞分泌Gal-1 |
| 3.2.2 Gal-1 诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 3.2.3 Gal-1 通过caspase非依赖的方式诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 3.3 MGL通过caspase非依赖的AIF入核的方式诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 3.3.1 iDC表面表达MGL，mDC不表达 |
| 3.3.2 MGL诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 3.3.3 MGL通过caspase非依赖的AIF入核的方式诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 3.4 Gal-1 和MGL协同诱导Jurkat细胞凋亡 |
| 4 讨论 |
| 4.1 恶性白血病细胞利用微环境中的Gal-1 和MGL实现免疫逃逸 |
| 4.2 Gal-1 和MGL通过caspase非依赖的线粒体途径协同诱导T细胞凋亡 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（9）T淋巴细胞凋亡信号途径与系统性红斑狼疮（论文提纲范文）
| 1 外源性通路 (死亡受体途径) |
| 1.1 Fas/FasL蛋白, Fas又称CD95或凋亡蛋白-1 (Apo-1) |
| 1.2 TRAIL肿瘤坏死因子相关凋亡配体 |
| 2 内源性通路 (线粒体途径) |
| 3 Caspase |
| 4 T淋巴细胞凋亡与SLE |
| 5 结语 |
（10）肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体临床治疗应用前景（论文提纲范文）
| 1 TRAIL诱导细胞凋亡的可能途径 |
| 2 肿瘤细胞对TRAIL的耐受 |
| 3 在几种难治性疾病治疗中的应用 |
| 3.1 肿瘤 |
| 3.2 神经退行性疾病 |
| 3.3 艾滋病 (AIDS) |
| 4 总结 |
四、死亡受体及线粒体途径与激活诱导T细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]毛兰素对角质细胞增殖和凋亡的影响及树状介孔硅透皮给药系统的研究[D]. 莫灿龙. 华南理工大学, 2020(01)
- [2]Akkermansia muciniphila源蛋白酶Amuc-1434对Muc2的降解及其抑制结直肠癌LS174T细胞增殖的研究[D]. 孟鑫. 吉林大学, 2020(08)
- [3]潞党参对UV所致小鼠背部皮肤光老化模型Fas/FasL表达影响的研究[D]. 路璐. 辽宁中医药大学, 2020(02)
- [4]杠柳苷元及其结构类似物铃兰毒苷在银屑病治疗中的作用及机制研究[D]. 姜博文. 东北师范大学, 2019(04)
- [5]ZEA、DON及其联合染毒对小鼠体外T淋巴细胞免疫功能及凋亡的影响[D]. 孙凯. 扬州大学, 2019(02)
- [6]捻转血矛线虫排泄分泌蛋白T细胞、单核细胞结合蛋白的鉴定及其对相应细胞功能的影响[D]. 陆明敏. 南京农业大学, 2018(07)
- [7]化疗药物对CD19嵌合抗原受体T细胞影响的实验研究[D]. 伊文芳. 南方医科大学, 2016(04)
- [8]Galectin-1和MGL对Jurkat细胞凋亡的协同作用及其机制研究[D]. 王健辉. 东北师范大学, 2015(12)
- [9]T淋巴细胞凋亡信号途径与系统性红斑狼疮[J]. 潘云,王俐,李向培. 安徽医药, 2012(06)
- [10]肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体临床治疗应用前景[J]. 杨洁,邓子鲲,朱彤阳,张臻,甘子仪. 世界临床药物, 2012(02)