一、马立克氏病病毒648株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究（论文文献综述）
刘潇,宋佳玲,张金城,马德青,韦平,黄腾[1]（2021）在《马立克氏病病毒多次跨膜蛋白pUL43多克隆抗体的制备及其体外表达分析》文中提出为了研究马立克氏病病毒（MDV）pUL43蛋白的表达特征,首先通过同源重组反应构建了表达MDV pUL43蛋白的真核载体,利用生物信息学软件分析MDV pUL43蛋白的跨膜结构、亲水性、疏水性和抗原性,选择抗原性最佳的N端第259～276位合成抗原肽,5次免疫兔后采集血清并通过亲和层析纯化浓缩多克隆抗体,利用斑点杂交对多克隆抗体效价进行检测,利用实时荧光定量（RT-qPCR）检测感染细胞UL43基因m RNA转录本水平,利用间接免疫荧光试验和蛋白免疫印迹对转染或被MDV感染细胞的pUL43蛋白进行检测。结果显示:多克隆抗体与抗原肽的反应效价为1∶100 000;转染细胞内pUL43蛋白呈斑块聚集;814疫苗株或GX20NNM1野毒株感染后UL43基因在mRNA、蛋白水平上具有相似的表达动力学。在感染后12 h检出特异性的pUL43蛋白,其表达量随感染时间延长而增加;特异条带的表观分子量在45～50 ku。研究成功制备了特异性MDV pUL43蛋白多克隆抗体,并分析了MDV pUL43蛋白的体外表达特征,为后续研究其生物学功能奠定了基础。
李露媛[2]（2021）在《J亚群禽白血病共感染检测、病毒分离鉴定及其抗性细胞系构建》文中研究表明J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）感染可以引起鸡群的免疫抑制,诱发髓细胞型白血病和血管瘤。自从1989年首次分离于英国肉鸡,ALV-J随后在世界范围内广为流行。我国于1999年报道了首例ALV-J肉鸡感染病例。与其他亚群相比,ALV-J具有更强的致病性与传播能力以及更广泛的宿主范围,且常与其它亚群ALV以及肿瘤性病毒混合感染,给养殖业带来了严重危害。目前尚无有效的药物及疫苗可用于防控ALV-J,故当前主要防控策略是鸡群的检测和净化。因此,定期对鸡群展开ALV-J流行病学调查,分析其分子特征及演化规律,将为ALV-J防控提供流行病学依据。为了解江苏和安徽地区部分鸡群ALV以及其他肿瘤性病毒感染情况,从庐江、六安、长丰等地的养殖场鸡群中收集了疑似肿瘤的组织样品,并应用PCR方法对鸡的肿瘤性病毒ALV-A、ALV-B、ALV-K、ALV-J以及MDV和REV进行检测。结果表明,所检测的鸡群存在单一感染及多重情况的混合感染,其中被检病料的总阳性率为60.23%,而混合感染占了其中的52.83%。说明这些地区的肿瘤性病毒感染以混合感染为主。为分离出该鸡群感染的ALV,用DF-1细胞对病鸡的组织病料进行ALV的病毒分离鉴定。IFA和ALV亚群特异性PCR证明,成功分离出3株ALV-J,并命名为AH200627、AH200801与CF190512。对3个分离株的病毒全基因组进行PCR扩增、测序及序列分析,进一步发现AH200627和AH200801毒株与国内ALV-J毒株的序列同源性较高,遗传距离近;而OF190512株各个主要基因均与国内ALV-J具有一定的差异性。值得注意是,在比对CF190512的Gp85序列时发现,其第214和第215位存在两个丝氨酸的缺失。这种缺失是Genbank所有毒株均不存在的缺失类型,且该部位为Env蛋白与受体结合区域,可能会影响病毒本身的生物学特性。以上鸡群肿瘤性病毒诊断结果以及对分离的ALV-J进行序列分析为该地区的ALV-J以及其他肿瘤性病毒的防控提供了重要流行病学数据。为了研究3个ALV-J分离株的体外复制动力学,在DF-1细胞中建立了这三株病毒的复制生长曲线。结果表明,三株病毒具有相似的生长特性,但CF190512复制速率和峰值滴度均高于AH200801和AH200627。为进一步探究CF190512株Gp85第124和125位丝氨酸缺失对病毒生长特性的影响,以J1传染性克隆为骨架,构建并拯救出与CF190512具有相同缺失的重组病毒J1-delSS。病毒复制动力学分析表明,J1和J1-delSS病毒的复制曲线没有明显差异。在超感染抗性试验中,J1和J1-delSS的Env蛋白均能有效抑制J1和J1-delSS病毒的感染。该研究结果为进一步探究Gp85蛋白受体结合区域缺失对其与受体亲和力的影响打下了基础。ALV-J感染宿主细胞依赖于Env蛋白与受体结合,而此过程取决于一种功能性细胞受体chNHE1。其中,W38位色氨酸又是ALV-J侵入宿主细胞的关键。本研究中,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术成功获得敲除chNHE1的W38的抗ALV-J DF-1细胞系delW38-NHE1。Western blot结果表明,delW38-NHE1细胞系能够有效抵抗5个MOI ALV-J的感染。delW38-NHE1细胞系的成功创制为ALV-J的抗病毒研究以及通过NHE-1 W38位点与Env蛋白的互作研究提供了工具,并且该位点可作为编辑抗ALV-J转基因鸡以及作为抗病毒药物的潜在靶点。
吴咪[3]（2021）在《鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究》文中认为鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV）属疱疹病毒科α疱疹病毒亚科,可引起鸡的传染性喉气管炎。早在1925年美国首次报道鸡传染性喉气管炎以来,在上世纪六十年代我国也发现了该病,相继在我国各省均有发生,该病是目前危害养禽业的重要疫病之一。国内外主要使用弱毒疫苗预防该病,但因疫苗株毒力普遍偏强,因此存在潜伏感染的危害以及无法鉴别疫苗株与野毒株的缺点。目前对ILTV基础研究较少,制约了鸡传染性喉气管炎防控技术的发展。本研究针对影响ILTV复制的关键宿主蛋白为切入点,首次鉴定到信号肽酶复合物亚基3（SPCS3）是影响ILTV在细胞中复制的关键宿主蛋白之一,发现SPCS3蛋白可以切割ILTV的gL蛋白。本研究内容及主要试验结果如下:1.分别对三株ILTV:SH2016、SH2017、GD2018的生长特性及致病性进行研究。三株ILTV均可在鸡肝癌细胞（LMH）增殖,感染ILTV后120h,SH2016滴度可达到103.08TCID50,SH2017和GD2018分别可达到103.42TCID50和105.08TCID50,其中GD2018较其它两株更适应LMH细胞生长;经绒毛尿囊膜方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达到103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.67TCID50和104.33TCID50,GD2018更适应在尿囊膜上生长;收取尿囊液,SH2016滴度可达102.67TCID50,SH2017和GD2018分别可达到100.33TCID50和100.5TCID50,SH2017和GD2018不生长,SH2016可以在尿囊腔中复制。以尿囊腔方式接种9～11日龄SPF鸡胚,接种后168h,收取尿囊膜,SH2016滴度可达103.25TCID50,SH2017和GD2018分别可达到102.58TCID50和101.83TCID50;收取尿囊液,SH2016滴度可达104.58TCID50,SH2017和GD2018分别可达到101.25TCID50和100.67TCID50,即SH2017和GD2018几乎不生长,而SH2016更适应在尿囊腔中增殖。此外,分别用三株ILTV感染8周龄SPF鸡,SH2016临床症状最明显,是唯一引起鸡死亡的毒株,且三株ILTV只能在鸡喉气管组织中复制,其他脏器并未检测到;GD2018在攻毒后第14d,抗体效价最高,SH2016在攻毒后第21d抗体效价最高。2.分别对三株ILTV基因组进行高通量测序,拼接出全基因组序列,根据基因组结构,预测各蛋白序列。三株ILTV基因组长度分别为:SH2016为153.805kb、SH2017为153.024kb、GD2018为153.855kb;GC含量分别为:SH2016为48.16%、SH2017为48.06%、GD2018为48.10%。三株ILTV基因组结构均由UL、US、IRs及TRs四个区域组成。对病毒基因组核酸序列及10个编码蛋白氨基酸序列进行系统进化分析,基因组DNA进化树上,SH2016与俄罗斯分离株Rus/Ck/Tatarstan/1009/1643株亲缘关系最近,而与SH2017、GD2018关系较远;SH2017与美国分离株LT Blen亲缘关系最近;GD2018与俄罗斯分离株Rus/Ck/Penza/2013/2701及意大利分离株4784/80亲缘关系较近。g C及gL蛋白进化树中,三株ILTV在同一分支,该蛋白具有较高的保守性;gD、gE及gG蛋白进化树中,SH2016与GD2018在同一分支,同源性较高,而与SH2017同源性较低;gB、gH、gM、gI及TK蛋白进化树中,SH2017与GD2018同源性较高,而与SH2016同源性较低。对三株ILTV病毒10个蛋白氨基酸突变位点进行比较,发现除三株ILTV的gC蛋白序列完全一致外,其它9个病毒蛋白都有不同程度的氨基酸位点差异,这些蛋白差异疑与三株ILTV复制能力及致病性的差异相关。3.构建鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库,对LMH细胞全基因组范围进行逐一扫描式敲除,构建基因敲除细胞文库,然后用ILTV感染细胞文库,对存活的细胞进行高通量测序,确定存活细胞中敲除的宿主基因。第一次测序结果发现3个非编码RNA（ncRNA）基因和SPCS3（信号肽酶复合物亚基-3）基因可能与病毒复制相关,随后的三次重复实验结果均显示,SPCS3基因是存活细胞中敲除率最高的基因,因此推测宿主蛋白SPCS3可能是影响ILTV复制的关键蛋白之一。4.比较ILTV在LMH细胞和SPCS3蛋白截短的LMH细胞系（分别命名为1-6和1-14）中的生长,在1-6细胞系中,ILTV的病毒滴度降低102.625倍,在1-14细胞系中,ILTV的病毒滴度降低103.75倍,表明SPCS3蛋白截短确实可以对ILTV的复制起到抑制作用。通过在线生物软件对ILTV中具有信号肽及多个跨膜结构的病毒蛋白进行预测,成功构建9个含有单一信号肽的病毒蛋白及4个含有多个跨膜结构的病毒蛋白真核表达质粒,转染细胞后,其中8个病毒蛋白成功表达,比较各病毒蛋白在LMH细胞及1-14细胞系中表达差异,结果显示,ILTV的衣壳糖蛋白L（gL）蛋白在两种细胞中的蛋白分子量差异明显,表明SPCS3蛋白截短影响了其切割gL蛋白的功能,这可能是影响ILTV复制的主要原因。5.为了解SPCS3蛋白截短对其它α疱疹病毒的影响,分别将鸭肠炎病毒（DEV）和人单纯疱疹病毒1型（HSV-1）两种α疱疹病毒感染LMH细胞和1-14细胞系,比较其生长差异。结果显示,与在LMH细胞上相比,DEV在1-14细胞系中病毒滴度降低102倍,而HSV-1在两种细胞上的生长无差异。进一步构建DEV和HSV-1两种病毒的gL蛋白真核表达质粒,分别转染LMH细胞和1-14细胞系后,两种病毒的gL蛋白在LMH细胞与1-14细胞系中,分子量大小无明显变化,但是DEV的gL蛋白在1-14细胞系中表达量明显低于LMH中的表达量,而HSV-1的gL蛋白在1-14细胞系种表达量没有明显变化,进一步表明截短的SPCS3可能影响gL蛋白的稳定性,从而影响DEV复制。本研究丰富了我国ILTV毒株全基因组序列生物学信息,明确了三株ILTV流行株的生物学特性。通过CRISPR/Cas9高通量筛选技术,筛选到一种与禽疱疹病毒复制相关的宿主蛋白分子,完善了ILTV复制中发挥关键作用的宿主蛋白作用机制,为ILTV致病分子机制研究尝试了新的思路。
闫彩虹[4]（2020）在《江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中认为免疫抑制病病原既可引起家禽发生原发性感染甚至死亡,也可损伤其免疫系统,导致机体抵抗力下降,并发或继发感染其他病原,造成家禽生产能力下降和较高的病死率。鸡传染性贫血病毒（CIAV）、马立克病病毒（MDV）、网状内皮组织增生症病毒（REV）和禽白血病病毒（ALV）是4种常见的可导致家禽免疫抑制的病毒,在我国养鸡场中检出率较高,且常以亚临床感染的形式出现。目前关于这几种免疫抑制病的流行病学调查研究主要集中在广西、安徽、山东、河南等地区,而关于江苏地区家禽这方面的流行病学研究资料较少。由MDV、REV和J亚群禽白血病病毒（ALV-J）感染引起的肿瘤疾病在临床诊断过程中因症状相似而较难确诊,而且这3种病原的实验室检测还是以常规PCR为主,因此建立一种特异、灵敏、快速的检测方法,用于病原检测和临床诊断,同时为疾病的防控和净化提供帮助是非常有必要的。本研究应用PCR方法对来自江苏地区的病禽进行4种免疫抑制病病原的检测,建立了同时检测3种致瘤病毒MDV、REV和ALV-J的三重TaqMan荧光定量PCR方法,并应用于临床检测中,以期了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的感染情况,并为临床上家禽肿瘤疾病的诊断提供一种快速、特异、敏感的新型技术手段。1 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测为了解江苏地区家禽免疫抑制病病原的流行情况及其感染间相互作用的关系,应用PCR方法对2016-2019年来自江苏地区不同养殖群体的507只病鸡、80只病鸭、129只病鹅和42只病鸽进行CIAV、MDV、REV和ALV的核酸检测,结果显示病鸡样品总阳性检出率为66.07%,CIAV、MDV、REV和ALV的检出率分别为36.09%、25.84%、10.85%和32.94%,CIAV、MDV、REV和ALV的单一感染检出率分别为13.61%、8.88%、1.18%和12.03%,二重感染以CIAV+ALV最为常见,检出率为7.69%,三重感染以CIAV+MDV+ALV最为常见,检出率为3.94%,四重感染检出率为0.99%。不同日龄鸡检测结果显示,6月龄以上鸡CIAV的检出率显着降低,3～6月龄鸡MDV和ALV的检出率较高;不同品种鸡检测结果显示,蛋鸡MDV、REV检出率显着高于肉鸡、草鸡和三黄鸡;2016-2019年检测结果显示,江苏地区鸡群中免疫抑制病病毒仍呈现不同程度的流行,且部分病原的每年检出率存在差异性。4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较经统计学分析表明,CIAV和REV、CIAV和ALV感染间存在相互促进的趋势（P<0.01）。209份水禽样品均未检测出CIAV核酸,MDV、REV和ALV的检出率分别为0.96%、1.44%和3.35%,个别样品还存在REV和ALV的混合感染。病鸽样品中均未检测出这四种免疫抑制病病原。结果表明,鸡群中免疫抑制病病原的感染非常普遍,且存在多种病原的混合感染;水禽中免疫抑制病病原的检出率显着低于鸡群;鸽子感染这4种免疫抑制病病原的机率较低。2鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立为建立同时检测MDV、REV和ALV-J的方法,本研究根据MDV meq基因、REV gp90基因和ALV-J env基因,合成特异性引物和TaqMan探针,建立和优化反应体系和条件,建立了鸡3种致瘤病毒的单个和三重TaqMan荧光定量PCR方法。结果显示,本研究建立的3种病毒的单个荧光定量PCR方法具有相同的反应体系和条件,操作方便,检测快速;单个和多重荧光定量PCR方法均仅特异性扩增MDV、REV和ALV-J,与鸡其它主要病毒无交叉反应,特异性较强;3种病毒的单个荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×101拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,敏感性较高,三重荧光定量PCR方法对MDV、REV和ALV-J的质粒标准品最低检出限分别为3.23×100拷贝/μL、3.23×100拷贝/μL和3.23×101拷贝/μL,与单个敏感性相似;三重荧光定量PCR方法组内与组间重复性试验的Ct值变异系数均小于5%,重复性良好。应用三重荧光定量PCR方法和普通PCR方法分别对来自江苏各地具有免疫抑制病表现的120份临床病鸡样品同时进行MDV、REV和ALV-J核酸的检测,两者的符合率为94.17%。本研究建立的鸡致瘤病毒三重TaqMan荧光定量PCR方法为临床样品中MDV、REV和ALV-J核酸的检测及流行病学调查提供了一种快速、特异、敏感的新型技术手段。3两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究为进一步检验三重荧光定量PCR方法的临床应用性,应用建立的三重荧光定量PCR方法对江苏两个鸡场送检的疑似感染肿瘤性病毒的病鸡组织样品进行了检测,并同时进行病毒分离,然后对分离出的MDV野毒株进行meq和pp38两个主要致病基因的序列分析。三重荧光定量PCR结果显示送检病鸡样品MDV核酸均呈阳性,REV和ALV-J核酸均呈阴性,病毒分离鉴定结果显示从两个鸡场的病鸡抗凝全血中各分离到了 1株MDV Ⅰ型毒株,未分离到REV和ALV毒株。核苷酸同源性和遗传进化分析结果显示,JS0316毒株与江苏分离株Js201801关系最近,而JS0424毒株则与近年国内流行毒株亲缘相近。meq基因编码的氨基酸序列结果显示,2个MDV分离株缺乏弱毒疫苗株的特征（A71S,P194-）,具有MDV强毒分离株的分子特征（D80Y,V115A,T139A,P176R）,JS0316分离株meq基因除了具有以上强毒分离株的分子特征外,还与Js201801存在相同的突变（Q93R）,该突变其余参考毒株均未发生,这可能是MDV江苏分离株新的分子生物学特征。除此之外,JS0316和JS0424分离株meq基因分别出现了其他参考毒株均未发生的氨基酸突变（V123A）和（A/P217T）,JS0316和JS0424分离株pp38基因推导的氨基酸序列也分别出现了特有的氨基酸突变（L981,F240S）和（W67G,V210A）。结果表明三重荧光定量PCR检测结果和病毒分离结果一致,发病鸡均感染了马立克病毒,且分离毒株均具有强毒的分子特征。因此,所建三重荧光定量PCR方法可用于临床检测。
杨帆[5]（2020）在《黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究》文中研究表明国内外一系列研究表明黄酮类化合物对诸多病毒有抗病毒活性,如疱疹病毒（herpes virus,HSV）、登革热病毒（dengue virus,DENV）、寨卡病毒（Zika virus,ZIKV）等。但是在兽医领域尤其是抗马立克氏病的研究还鲜有报道。近年来随着马立克氏病病毒（marek’s disease virus,MDV）的毒力不断净化,在免疫后的鸡群也零星有MDV发病的报道。目前使用的MDV疫苗能防止肿瘤的发生和免疫抑制,但病毒仍然能在体内复制并向外排毒。因此筛选和研究MDV的抗病毒药物,尤其是中成药对于预防和控制临床中马立克氏病病毒传播有重要意义。本研究根据发表的研究结果,以及不同黄酮类化合物的化学结构选择了两大类黄酮类化合物进行单独和联合用药抗MDV复制的研究,以期为临床抗MDV药物研发与应用提供理论依据。1.黄酮类化合物白杨素（Chrysin）和染料木素（Genistein）对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。以往报道表明黄酮类化合物白杨素和染料木素具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗过敏等作用。为探索这两者对马立克氏病病毒复制的影响,从以下几个方面设计实验:药物是否对CEF细胞有毒性及其最大安全浓度;药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用;药物是否在病毒进入细胞前、病毒吸附细胞的过程、病毒吸附进入细胞后有抑制作用;药物是否能直接影响病毒的感染性甚至直接杀灭病毒。以上试验利用Real-time PCR、Western Blot及噬斑计数等方法分析马立克病毒在CEF细胞中的复制情况。结果表明染料木素能较好的抑制马立克病毒在CEF细胞中的复制,抑制作用具有时间和剂量依赖性,噬斑计数试验的结果表明病毒抑制率为87.5%,并且还能够直接影响病毒的感染性。另外,对MDV感染CEF细胞因子的表达进行了检测,结果显示与未加染料木素药物处理组相比,染料木素诱导病毒感染细胞中IRF-7显着,同时IFN-β表达也上调明显,两者呈现正相关关系。这表明染料木素可能通过诱导细胞产生IFN-β从而抑制MDV在CEF细胞中的复制。此外,染料木素药物处理显着增加炎症因子IL-6和IL-1β的表达,提示细胞的炎症反应也与MDV感染相关。与染料木素相比,白杨素几乎没有抑制MDV复制的作用,甚至还能促进MDV在CEF中的复制。2.黄芩苷（baicalin,BA）、表儿茶素没食子酸酯（（-）-Epicatechin gallate,ECG）和柚皮素（（±）-Naringenin）对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。首先检测了不同的药物对CEF细胞的毒性,接着探究药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用,以及具体在病毒复制哪个阶段发挥作用。同时也检测了这三种药物是否能直接影响MDV的感染性。另外对病毒感染CEF细胞中的细胞因子变化也进行了检测分析。实验结果表明黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯对MDV的复制有较强抑制作用,抑制率为90%和91.6%,而柚皮素效果一般,抑制率为41.6%。细胞因子检测结果表明,尽管BA和ECG处理细胞组IRF-7表达明显减少,但抗病毒因子IFN-β的表达没有影响,这一结果表明由MDV感染引起的IFN-β表达增加可能受到其他转录因子的调节。此外,MDV感染的CEF细胞中BA处理后,促炎因子IL-1β和IL-6的表达略有下降,但差异不显着,这可能与BA在不同细胞中具有不同的抗病毒机制相关。而ECG处理组IL-6的表达显着降低,表明ECG可以抑制炎性因子的表达。3.染料木素、黄岑苷和表儿茶素没食子酸酯联合应用对马立克氏病病毒在CEF细胞中复制的影响。与单味中药相比,复方中药可能具有更好的抗病毒作用。将单一黄酮类化合物抑制MDV复制效果较好的黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和染料木素进行两两配伍,分成黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯,黄芩苷和染料木素,表儿茶素没食子酸酯和染料木素以及黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和染料木素三者配伍的这四个组。首先检测了这四组药物对CEF细胞的毒性,接着探究药物是否在病毒感染细胞的全过程有抑制作用。结果表明:这几组复合药物的抑制效率不如单一药物的高。
倪小舒[6]（2020）在《鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗的研制》文中提出新城疫、传染性支气管炎和H9亚型禽流感是养禽业必须预防和控制的三种重要疫病。新城疫是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起,近年来在我国主要流行的是基因Ⅶ型强毒株;鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）引起的急性、高度接触性传染病;H9亚型禽流感在我国家禽中广泛存在,传播效力高,传播速度快,是目前最难控制的禽流感之一。为了抵御这三种疾病的侵害,降低单价苗频繁免疫接种带来的副反应,研制免疫效力优、交叉保护性好的鸡新城疫、传染性支气管炎和禽流感（H9亚型）三联灭活苗是必要的。本研究通过反向遗传技术构建了 4株重组H9亚型禽流感病毒（AIV）,分别制成单价灭活苗,比较免疫后抗体水平及攻毒保护情况;选取免疫原性较好的AH515-PR8株与NDV（A-Ⅶ株）、IBV（QXL87株）制成三联灭活疫苗,并将该疫苗与市售同类产品进行免疫效力的比较。1.重组H9亚型AIV的构建利用反向遗传技术,以H1N1流感病毒A/Texas/05/2009×Puerto Rico/8/1934的六个内部基因为骨架,构建了含4株H9N2亚型AIV流行株的囊膜糖蛋白（HA、NA）基因的重组病毒A3-PR8、AH515-PR8、TM343-PR8与XZ349-PR8。将4株重组病毒在鸡胚上进行连续传代,其中A3-PR8株、AH515-PR8株与TM343-PR8株均能在鸡胚中稳定生长,红细胞凝集价达到29及以上。分别对4株重组病毒E6代次的病毒含量进行测定,与对应的原始毒株进行比较,发现重组毒株的病毒含量提升0.5～0.8个滴度。2.重组H9亚型AIV疫苗候选株的免疫原性评价试验分为A3-PR8组、AH515-PR8组、TM343-PR8组、疫苗株WJ57-PR8组和攻毒对照组,各免疫组采用21日龄SPF鸡10只,攻毒对照组采用21日龄SPF鸡5只。各免疫组分别以颈部皮下注射的方式免疫,每只鸡0.2mL（含2×108.5EID50病毒）;攻毒对照组接种等量PBS。免疫后第7、14、21、28天采血,测定血清中H9亚型AIV的血凝抑制（HI）抗体效价。结果表明,AH515-PR8组在免疫后抗体水平不断上升,且一直高于其它免疫组;免疫后28d,抗体效价最高,为28.9,高出其余组0.4～0.7个滴度。在攻毒后,AH515-PR8组、TM343-PR8组与疫苗株WJ57-PR8相比,排毒量有明显下降。其中AH515-PR8组排毒量最低,5d时病毒分离率为0%。3.新支流三联灭活疫苗免疫效力评价将50只SPF鸡随机分为免疫组A1组、B1组、A2组与B2组,每组各10只;攻毒对照A3组与B3组,每组各5只。A1、B1两组于21日龄免疫新支流三联灭活疫苗,含3.5×108EID50 NDV、4×106EID50 IBV、5.8×108EID50AIV;A2、B2 两组免疫市场同类产品。免疫后7d、14d、21d、28d采血分离血清,使用HI试验测定NDV与AIV的抗体效价,使用ELISA试验测定IBV的抗体水平。结果显示,免疫后28d,NDV抗体均值达到29.3,比同类产品高出1个滴度;AIV抗体均值为210.2,比同类产品组高出0.7个滴度;IBV抗体免疫后7d时均为阴性;14d时A1组抗体阳性率为80%,比B1组高出10%;21d、28d时两组抗体阳性率均为100%。使用NDV JS02/06株对A1、A2、A3组通过滴鼻点眼的途径攻毒,使用H9亚型AIV WJ57株对B1、B2、B3组通过翅静脉注射的途径攻毒。攻毒后于3、5、7d采集喉头与泄殖腔拭子测定排毒。在NDV部分,A1组临床保护率为100%,比A2组高出10%,同时大幅降低NDV的排毒,在攻毒后7d病毒分离率为10%。在AIV部分,B1组3d时排毒率为20%,5d时排毒率为0%,均低于B2组。综上所述,本研究构建了 4株重组H9亚型AIV A3-PR8、AH515-PR8、TM343-PR8与 XZ349-PR8,其中 AH515-PR8 株免疫原性最佳。AH515-PR8 株与 NDV（A-Ⅶ株）、IBV（QXL87株）制成三联灭活疫苗后均展现了良好的免疫保护效果,为研制商品化的新支流三联灭活疫苗奠定基础。
石梦雅[7]（2020）在《2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究》文中认为马立克氏病（Marek’s diseases,MD）由马立克氏病病毒（Marek’s diseases virus,MDV）引起的一种传染性T淋巴细胞增生性疾病。在过去的六十年,随着MD疫苗的成功研制及广泛应用,有效控制了疾病的发生。但近年来,特超强毒株的出现和野毒株毒力的增强成为疫苗免疫失败的主要原因,给养禽业带来新的威胁以及更大的经济损失。因此,有必要对鸡群中自然流行的MDV进行流行病学监控,对了解病毒的进化趋势以及现有MD疫苗保护力都具有重要意义。广西是我国优质鸡的生产大省,具有品种繁多和饲养周期长等特点,在生产中更容易发生MDV的感染。本课题对2017-2019年广西及其周边地区MDV进行分子流行病学调查,通过细胞培养进行病毒分离、IFA鉴定和致瘤基因meq的序列测定,共分离到23株MDV分离株。序列分析结果显示,23株分离株相似性较高,与中国广西早期分离株GX0101亲缘性较近;根据其氨基酸位点及系统进化树分析,均有中国超强或特超强毒株的特点;对分离株病例背景进行分析发现,均从免疫过MD疫苗的鸡群中所分离,且多以与其他两个肿瘤病病毒（禽白血病病毒和网状内皮组织增殖病病毒）混合感染（73.9%,17/23）。结合本课题所分离的23株MDV的meq基因和Gen Bank数据库里过去55年（1964-2019）已发表的149株MDV meq基因序列,分别构建三个数据集,通过贝叶斯系统动力学方法进行分析。系统发育树显示,全球172株MDV被分为2个clusters,Cluster 1有71株,包括温和型毒株、疫苗毒株和国外强毒株;Cluster 2有101株,主要以中国强毒分离株为主,本课题的23株分离株构成一个相对独立的进化簇;地理系统分析显示,揭示中国早期的MDV源自国外（美国、日本）,并呈现由北方到南方蔓延扩散的趋势;种群动态分析发现,自2005年起,中国分离株meq基因的遗传多样性呈现持续增长趋势,并分别在2007-2012和2015-2019呈现强的上升趋势。本课题对从免疫了MD疫苗的种鸡群中临床暴发MD病鸡中分离到的GX18NNM4分离株进行了致病性研究,内容包括人工感染试验和商品疫苗免疫保护试验,从临床肿瘤发生及其病理组织学观察、MDV病毒载量的动态检测、细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平检测、免疫保护指数（protection index,PI）等方面进行评价,探究分离株的致病性以及现有商品疫苗的保护效果。未免疫攻毒组鸡只出现垂翅、羽毛粗乱、消瘦、精神沉郁等临床症状,最早于攻毒后16天出现死亡,剖检发现在心脏、肝脏、脾脏和胰腺等器官有肿瘤;免疫CVI988和814疫苗攻毒组的鸡只最早出现死亡分别在攻毒后22天和18天,剖检发现部分鸡只心脏、胰腺等器官有肿瘤;未免疫攻毒组外周血淋巴细胞的病毒载量在攻毒后28天达到峰值103.7copies/106个细胞,而两个疫苗免疫攻毒组的病毒载量在各个检测时间点均低于未免疫攻毒组的;对MDV感染鸡的脾脏和盲肠扁桃体进行PD-1和PD-L1 m RNA表达水平检测,发现PD-1或PD-L1 m RNA脾脏的表达明显高于盲扁（P<0.05）,但总体趋势基本相同,值得注意的是,在未免疫攻毒组中表达水平显着高于免疫攻毒组（P<0.05）。未免疫攻毒组肿瘤发生率为70.7%（41/58）,CV1988疫苗攻毒组的肿瘤发生率为42.5%（17/40）,保护指数39.9%。免疫814疫苗攻毒组的肿瘤发生率为27.5%（11/40）,保护指数61.1%。本课题研究揭示了早期中国MDV的来源及其传入我国后的传播扩散方向以及中国分离株meq基因遗传多样性的变化规律,同时证明目前MD在南方优质鸡中仍呈地方性的流行并严重危害养鸡业,出现了目前的商品疫苗已不能提供完全保护的vv或vv+MDV的分离株。
马奎[8]（2019）在《安徽省部分地区蛋鸡肿瘤病的临床诊断与病理组织学观察》文中进行了进一步梳理禽白血病（Avian Leukosis,AL）、马立克氏病（Marek’s Disease,MD）和禽网状内皮增生症（Reticuloendotheliosis,RE）是家禽养殖中最常见的三种病毒性肿瘤病。它们不仅能够引起蛋鸡生产性能及机体免疫机能下降、急性或慢性死亡,而且常与其他疾病协同感染,严重危害养禽业的发展。本研究对来自安徽部分地区52例疑似肿瘤病的蛋鸡,依次通过大体检查、剖检观察和分子鉴定进行临床诊断,并选取ALV-J、MDV两重感染病例3例,从组织病理学特点和抗原定位进行重点剖析。具体研究结果如下:1、52例疑似肿瘤病病例的临床诊断本研究依据临床症状及病理剖检结果初步判定52例疑似为肿瘤病阳性。患病鸡群整体表现消瘦、精神沉郁、鸡冠萎缩或呈紫斑、羽毛蓬松等症状,可观察到部分蛋鸡的鸡冠中心增厚、硬化及褪色,腹围明显增大。剖检可见内脏器官肝脾呈弥散性肿大,肝脏表面分布有密集的米粒大的白色花斑,胸腺及腺胃出血,心脏、肾脏、胃肠等表面和实质中可见孤立、粗大、隆起的肿瘤结节,胸肌肌肉浅层及深层有白色条纹并伴有肿瘤结节,肌纤维失去光泽,呈灰白色。对52例疑似病样进行PCR验证,结果显示44例为肿瘤阳性。其中,ALV-J、MDV、REV、CAV 阳性率依次为84.6%、63.5%、21.2%、7.7%。三重感染、两重感染、单重感染依次占比22.72%、61.36%、15.90%。分别选取ALV-J17例、MDV15例、REV6例做基因测序,并与GenBank上已发表的参考株分析比对。ALV-J-gp85基因分析,结果显示鉴定株之间的同源性为84.7%-100%,与GenBank上标准株同源性为75.6%-97.4%。核苷酸序列分析,发现部分毒株核苷酸序列第695-724碱基存在缺失。MDV-meq基因分析,结果显示鉴定株之间同源性为94.7%-100%。氨基酸序列分析,发现存在多个特征性突变位点,与CVI988、GU2和814弱毒疫苗株相比,所有鉴定株（90 D→T,125V→A、149T→A、186 P→R）发生突变,部分鉴定株与超强毒株pC12/130-10发生突变（98A→T和103 Q→R）,所有鉴定株符合强毒株或超强毒株序列特征。REV-LTR基因分析,结果显示6株鉴定株之间的同源率为99.6-100%,与GenBank上标准株之间同源性为98.4%-100%。2、3例ALV-J、MDV共感染的组织病理学特点和抗原分布选取分子鉴定结果为ALV-J、MDV双重感染3个临床病例为研究对象,对该3个病例的脏器组织进行病理切片制作、HE染色,镜检发现,各组织脏器内肿瘤细胞多呈灶状分布。各组织脏器内多为淋巴瘤和髓细胞瘤,少部分组织为单一淋巴瘤细胞。其次为巨大多形型细胞瘤和不能定性的肿瘤细胞。除灶状分布外,肿瘤细胞还呈浸润式分布于各组织细胞间隙,在感染病例的同一脏器甚至同一切片视野可见2种肿瘤细胞分布。对3个病例的各脏器石蜡切片做连续切片,分别使用针对2种阳性肿瘤病的单克隆抗体进行间接免疫荧光染色,两重感染病例结果显示ALV-J和MDV在肝脏和脾脏阳性信号最强,其次为肾脏,其他组织各抗原阳性信号不等。综上所述,通过对安徽地区蛋鸡肿瘤病的诊断和研究,初步了解了安徽地区蛋鸡感染肿瘤病的流行情况,毒株进化方向和基因变异程度,肿瘤细胞基本类型及抗原的组织分布,为今后安徽省蛋鸡肿瘤病的诊断、预防和控制提供了参考依据。
张峰[9]（2019）在《利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株及其检测方法的建立》文中指出鸡马立克氏病（Marek’s disease,MD）是一种由鸡马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）引起的、鸡的淋巴组织增生性传染病,该病给养禽业造成巨大的经济损失。MD疫苗的使用很好地控制了该病,但其病原MDV呈现持续进化的趋势,给该病的防控带来困难。基因缺失疫苗由于删除了致病基因、同时最大程度保留了免疫原性,是最有发展前景的MD疫苗,这种疫苗具有良好的安全性和更高的免疫效力。由于MD疫苗不能建立免疫屏障,不能阻止野毒感染,为MDV的检测和监控带来困难。对MDV流行毒株的流行病学、病原学研究和新疫苗的开发是控制该病的主要措施。发展更好的病毒基因编辑技术和检测、监测方法是非常有必要的。本实验室分离的一株MDV野毒株BS/15株,基因分析表明其具有中国流行毒株的特有突变,同时其在体内复制能力强,具有更强的溶细胞感染能力和表现“晚毒力”特征。以其为亲本病毒构建基因缺失疫苗,具有成为高效MD疫苗的潜力。本研究利用CRISPR/Cas9技术,以BS/15株为研究模型,对其基因组中的主要致瘤基因meq基因进行了缺失。试验中,依据中国MDV分离株BS/15株的meq基因序列,设计了8条靶向meq基因的小向导RNA（sgRNA）,分别克隆到pX330质粒中,构建了表达靶向meq基因sgRNA的质粒pMeq-sgRNA。通过pMeq-sgRNA转染、测序分析方法初步评价sgRNA切割效果,选择了两条适合的sgRNA。在鸡胚成纤维细胞（CEF）上同时转染上述筛选的2个pMeq-sgRNA质粒,接种MDV分离株BS/15株,通过PCR检测筛选meq基因缺失克隆株,成功克隆到一株meq基因缺失毒株rBS△Meq株。序列分析证明获得的MDV重组毒株已按预期的切割位置缺失掉meq基因序列。体外实验证明缺失毒株与亲本毒株在CEF上具有相似的复制能力。本研究提供了一种简单、快捷的编辑MDV基因的方法,为MDV功能基因、分子进化和新型基因工程疫苗的研究提供了技术支持。为了有效检测和监测MDV基因修饰株和MDV分离株,本研究基于meq基因缺失株rBS△Meq株和另一株rMS△Meq株建立了能分别定量区分MDV分离株与meq基因缺失株的荧光定量PCR方法,体外实验证实这些荧光定量PCR方法能分别准确定量meq基因缺失株和MDV分离株,检测灵敏度高、特异性好、稳定性高。这对于MD的诊断、疫苗的免疫监控等具有重要意义。综上,本研究建立了一种利用CRISPR/Cas9系统编辑MDV分离毒株的方法,并利用该方法构建了一株MDV meq基因缺失毒rBS△Meq株,为新型基因缺失疫苗的研制和基因功能、分子进化研究提供了技术支持。同时,建立了区分MDV分离株和MDV meq基因缺失株的q-PCR方法,对研究MDV的感染进程、疫苗的免疫监控和MD的发生诊断有重要意义和应用价值。
李海娟[10]（2019）在《过去五年10株ALV-J分离株全基因序列分析及接种ALV-J污染的活疫苗对三黄鸡的致病性研究》文中进行了进一步梳理为了解广西地区禽白血病（avian leukosis,AL）的流行情况和及时掌握毒株的变异趋势,本研究对2014-2018过去5年广西地区不同养殖场送检至本实验的临床发病剖检疑似有典型AL症状的鸡只进行禽白血病病毒（avian leukosis virus,ALV）的分离与鉴定。通过将其血浆或病变组织样品的滤过液接种至DF-1进行细胞培养病毒分离,将收集的细胞培养物上清液进行ALV-p27检测,检测结果为阳性的样品进一步进行其它病原的PCR鉴定以及ALV亚群的PCR扩增,并用单克隆抗体进行IFA确定ALV的亚群,从中挑选确定为ALV-J单一感染的10株病毒分离株进行全基因序列测定与分析。结果显示,10株分离毒的基因组全长在7583～7648 bp之间,其核苷酸、氨基酸之间的相似性都较高分别为96.0%～98.8%、96.8%～98.9%,分离株与ALV-J参考株的相似性在91%以上,而与ALV-A、B、C、D、E、K亚群的相似均较低至63.1%～86.3%。遗传进化树分析的结果显示,分离株与ALV-J参考株的亲缘关系近同属于一个大分支,而与ALV-A、B、C、D、E、K亚群的参考株亲缘关系较远且处于不同的分支,确定10株分离毒均属ALV-J;对分离株与ALV-J参考株的3个主要基因gag、pol、env进行比对的结果显示,其gag和pol基因均比较保守,与参考株之间的相似性均在94%以上,而其囊膜蛋白env所表现的差异性则相对较大,相似性在90%～95%之间,进一步对env基因编码的两个结构蛋白gp85和gp37进行分析发现,gp37基因比较保守,分离株与ALV-J参考株之间的相似性较高（92.7%～99.0%）,而分离株与参考株gp85之间的相似性差异较大（85.9%～96.0%）。由于gp85的序列决定着ALV亚群的分型,因此10株分离毒与ALV-J参考株gp85的相似性均比较高,而与其他亚群之间的相似性则低至38.1%～59.7%;对gp85的熵值分析显示,ALV-Jgp85的主要变异区域集中在hr1和hr2;对其LTR的分析显示,分离株与ALV-J参考株的LTR差异性也较大,相似性为87.0%～97.8%;进一步对LTR的U3区序列的分析显示,分离株与ALV-J参考株的相似性在86.3%～98.1%,且分离株GX17YL05、GX17NN06与ALV-J参考株GX14ZS04、GX14HG01及NHH在U3区均出现了 11个碱基的连续缺失,而另外8株分离毒均无11 bp的缺失。本研究对所得分离毒与ALV-J参考株序列比较发现,10株广西ALV-J毒株的基因序列整体变化不大。2014年本课题组从某育种公司使用的商品鸡新城疫-传染性支气管炎二联（新-支二联）商品活疫苗和鸡传染性喉气管炎（传喉）商品活疫苗分别分离鉴定到ALV-J毒株GX14YYA1和GX14YYD2。为探究免疫有外源性ALV污染的活疫苗对鸡群的致病性,本研究模拟疫苗在生产上的常规接种程序,分别进行了滴鼻和点眼1 d龄首免及7 d龄二免有ALV-J污染的新-支二联疫苗,1 d腹腔注射从传喉疫苗中分离纯化出来的ALV-J毒株GX14YYD2以及35 d龄点眼免疫污染有ALV-J的传喉疫苗,同时分别设置了无ALV-J污染的新-支二联疫苗和传喉疫苗的免疫对照组及空白对照组,所有鸡只在7 d龄进行ND、AIV-H5和AIV-H9油乳剂商品疫苗的免疫,分别在1d、1W、3W、4W、5W、8W、11W、15W、21W以及25W进行体重、病毒血症、病毒载量、抗体效价、体外排毒等相关指标的检测。结果显示,1d龄首免、7 d龄二免有ALV-J污染的新-支二联疫苗组和1 d腹腔注射从传喉疫苗中分离纯化出来的GX14YYD2组与两个对照组相比,鸡只受到了ALV的感染,表现体重显着降低（p≤0.05）;免疫器官的正常发育和功能也受到显着影响,脾脏与对照组相比肿大（p≤0.05）、胸腺和法氏囊则都是萎缩的（p≤0.05）,对常规油乳剂疫苗的免疫应答效果也显着降低（p≤0.05）;鸡只的心脏出现了肉眼可见的ALV-J型血管瘤特征的血疱;而35 d龄免疫污染有ALV-J的传喉疫苗组和两个对照组在整个实验期内均没有临床发病,也没有检测到ALV病毒血症的存在。研究的结果证明,1 d龄首免、7 d龄二免有外源性ALV-J污染的新-支二联禽活疫苗,可以引起三黄鸡的感染并导致临床发病。本课题研究的结果说明,过去5年临床获得的10株ALV-J病毒的全基因序列整体变化不大,同时证明了免疫有外源性ALV-J污染的疫苗是其在商业鸡群中的传播途径之一。
二、马立克氏病病毒648株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、马立克氏病病毒648株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究（论文提纲范文）
（1）马立克氏病病毒多次跨膜蛋白pUL43多克隆抗体的制备及其体外表达分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验动物、细胞、毒株及质粒 |
| 1.1.2 试验试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 p UL43真核表达载体的构建 |
| 1.2.2 p UL43蛋白跨膜结构预测及抗原肽段选择 |
| 1.2.3 免疫流程 |
| 1.2.4 抗血清效价检测 |
| 1.2.5 抗血清纯化 |
| 1.2.6 免疫荧光试验（IFA) |
| 1.2.7 UL43 m RNA表达动力学 |
| 1.2.8 p UL43蛋白表达动力学 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 p UL43真核表达载体的构建 |
| 2.2 p UL43蛋白跨膜结构预测及抗原肽段选择 |
| 2.3 抗血清效价检测及纯化 |
| 2.4 IFA检测p UL43蛋白表达 |
| 2.5 UL43 m RNA表达动力学 |
| 2.6 p UL43蛋白表达动力学 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）J亚群禽白血病共感染检测、病毒分离鉴定及其抗性细胞系构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 第一篇 文献综述 禽白血病病毒概述 |
| 1.1 ALV-J的基本结构 |
| 1.2 ALV-J基因组特性 |
| 1.3 ALV的检测与诊断方法 |
| 1.4 ALV的鉴别诊断 |
| 1.5 ALV-J的增殖和培养 |
| 1.6 ALV-J的细胞受体 |
| 1.7 ALV-J亚群抗性细胞系研究进展 |
| 1.8 ALV-J的流行情况 |
| 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第一章 鸡群肿瘤性病毒共感染检测及ALV-J的分离鉴定 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第二章 ALV-J Gp85受体结合区独特氨基酸缺失对病毒生物学特性的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 第三章 抗ALV-J的DF-1细胞系的构建及其抗病毒效果评价 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 试验结果 |
| 1.4 小结与讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学钱间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（3）鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 鸡传染性喉气管炎及鸡传染性喉气管炎病毒概述 |
| 1.1.1 鸡传染性喉气管炎病毒的发现及分类 |
| 1.1.2 鸡传染性喉气管炎流行病学 |
| 1.1.3 鸡传染性喉气管炎病毒的粒子特点及理化特性 |
| 1.1.4 鸡传染性喉气管炎的诊断与防控措施 |
| 1.2 鸡传染性喉气管炎病毒的分子生物学特征及研究进展 |
| 1.2.1 鸡传染性喉气管炎病毒基因组结构及特征 |
| 1.2.2 鸡传染性喉气管炎病毒与致病力及复制相关的主要基因 |
| 1.2.3 鸡传染性喉气管炎病毒的复制机制及细胞间的传播机制 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术概述 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9系统介绍 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9系统的分类及作用机制 |
| 1.3.3 全基因组文库CRISPR/Cas9筛选 |
| 1.4 本研究目的与意义 |
| 2 试验一三株传染性喉气管炎病毒的生长特性及致病性研究 |
| 2.1 主要材料 |
| 2.1.1 毒株、鸡胚、细胞及试验动物来源 |
| 2.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 三株ILTV毒价的测定 |
| 2.2.2 三株ILTV生长趋势的比较 |
| 2.2.3 三株ILTV致病性试验 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 三株ILTV毒价测定 |
| 2.3.2 生长趋势比较 |
| 2.3.3 感染鸡临床症状 |
| 2.3.4 抗体检测 |
| 2.3.5 三株ILTV qPCR组织脏器分布 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 试验二三株传染性喉气管炎病毒基因组序列的测定与分析 |
| 3.1 主要材料 |
| 3.1.1 毒株、鸡胚、细胞及试验动物来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 ILTV的扩增 |
| 3.2.2 ILTV的纯化 |
| 3.2.3 ILTV的基因组DNA提取 |
| 3.2.4 ILTV全基因组高通量测序 |
| 3.2.5 基因组结构注释 |
| 3.2.6 三株ILTV全基因组及蛋白的进化与比较分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 三株ILTV病毒纯化后病毒基因组DNA电泳图 |
| 3.3.2 ILTV全基因组高通量测序 |
| 3.3.3 三株ILTV基因组结构注释 |
| 3.3.4 三株ILTV全基因组及相关蛋白系统进化树分析 |
| 3.3.5 三株ILTV重要蛋白的比较分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 试验三利用CRISPR/Cas9敲除技术筛选对ILTV复制相关的宿主因子 |
| 4.1 主要材料 |
| 4.1.1 毒株、菌株及细胞来源 |
| 4.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库的构建 |
| 4.2.2 鸡全基因组CRISPR/Cas9敲除文库质粒的提取 |
| 4.2.3 鸡全基因组CRISPR/Cas9慢病毒的包装 |
| 4.2.4 鸡全基因组CRISPR/Cas9LMH细胞文库的构建 |
| 4.2.5 ILTV感染阳性细胞 |
| 4.2.6 LMH细胞基因组DNA的提取 |
| 4.2.7 引物设计 |
| 4.2.8 PCR产物胶回收 |
| 4.2.9 高通量测序 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 鸡全基因组CRISPR/Cas9建库结果 |
| 4.3.2 慢病毒感染效率 |
| 4.3.3 嘌呤霉素筛选靶细胞 |
| 4.3.4 ILTV病毒筛选靶细胞 |
| 4.3.5 sgRNA扩增结果 |
| 4.3.6 高通量测序结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 试验四与宿主蛋白SPCS3相互作用的ILTV相关病毒蛋白的分析 |
| 5.1 主要材料 |
| 5.1.1 主要毒株、菌株及细胞来源 |
| 5.1.2 主要试剂与试剂盒 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 SPCS3多克隆抗体的制备 |
| 5.2.2 ILTV在截短细胞系与正常细胞上生长差异的确定 |
| 5.2.3 ILTV蛋白的构建与表达 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SPCS3蛋白截短细胞系验证 |
| 5.3.2 ILTV在1-14细胞和LMH细胞生长差异 |
| 5.3.3 LMH与SPCS3蛋白截短细胞系转染效率比较 |
| 5.3.4 ILTV蛋白表达 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 试验五SPCS3蛋白截短表达对其它α疱疹病毒复制的影响 |
| 6.1 主要材料 |
| 6.1.1 毒株、菌株及细胞来源 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器设备 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 DEV和HSV-1在LMH及1-14细胞上的毒价滴定 |
| 6.2.2 DEV和HSV-1在LMH细胞与1-14细胞上生长差异的确定 |
| 6.2.3 DEV和HSV-1的病毒蛋白gL(UL1)蛋白在LMH细胞与1-14细胞表达差异的确定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 DEV及HSV-1的毒价结果 |
| 6.3.2 DEV及HSV-1在LMH及1-14细胞上生长差异比较结果 |
| 6.3.3 DEV及HSV-1的gL蛋白在LMH及1-14细胞上表达差异比较 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 全文讨论 |
| 8 全文结论 |
| 9 创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（4）江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 家禽免疫抑制病概述 |
| 1.1 鸡传染性贫血 |
| 1.2 马立克病 |
| 1.3 网状内皮组织增生症 |
| 1.4 禽白血病 |
| 1.5 我国家禽免疫抑制病病原感染现状 |
| 2 免疫抑制病病原检测方法的研究概况 |
| 2.1 病毒分离 |
| 2.2 血清学检测技术 |
| 2.3 分子生物学检测技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 毒株来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物设计与合成 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 样品DNA的提取 |
| 2.4 样品RNA的提取和反转录 |
| 2.5 样品PCR检测 |
| 2.6 数据整理与分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 病原的PCR检测结果 |
| 3.2 感染类型分析 |
| 3.3 不同日龄鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.4 不同品种鸡免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.5 江苏地区鸡2016-2019年免疫抑制病病原检测结果分析 |
| 3.6 4种免疫抑制病病原感染间相互作用的比较 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株来源 |
| 1.2 临床样品来源 |
| 1.3 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 引物和探针的设计 |
| 2.2 病毒核酸提取 |
| 2.3 荧光定量PCR质粒标准品的制备与鉴定 |
| 2.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 2.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.6 临床样品的检测和验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.2 重组质粒测序鉴定结果 |
| 3.3 质粒标准品的制备 |
| 3.4 单个荧光定量PCR方法的建立 |
| 3.5 三重荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 3.6 临床样品的检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 两例疑似肿瘤病鸡三重荧光定量PCR检测及马立克病病毒鉴定分析研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 发病鸡背景资料及流行病学调查 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测 |
| 2.2 MDV分离培养 |
| 2.3 REV和ALV分离培养 |
| 2.4 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 2.5 致病相关基因的PCR扩增、测序及序列分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 发病鸡的组织病变 |
| 3.2 鸡致瘤病毒三重荧光定量PCR检测结果 |
| 3.3 REV和ALV分离结果 |
| 3.4 MDV分离结果 |
| 3.5 间接免疫荧光试验 |
| 3.6 致病相关基因的PCR扩增及序列分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 本文第二章120份临床病鸡样品的流行病学背景资料 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（5）黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号缩写 |
| 文献综述 |
| 1.马立克氏病的概述 |
| 1.1 流行病学 |
| 1.2 临床症状 |
| 2.马立克氏病病毒的概述 |
| 2.1 病毒分型 |
| 2.2 病毒形态和理化性质 |
| 2.3 基因组结构 |
| 2.4 基因组编码的蛋白及其功能 |
| 2.5 发病历程 |
| 3.中药抗病毒研究进展 |
| 3.1 抗病毒中药的分类 |
| 3.2 中药抗病毒作用机理 |
| 3.3 筛选抗病毒中药的研究方法 |
| 4.黄酮类化合物的概述 |
| 4.1 黄酮类化合物的结构和分类 |
| 4.2 黄酮类化合物的理化性质 |
| 4.3 黄酮类化合物的生理功能 |
| 5.研究目的和意义 |
| 研究内容一 白杨素和染料木素对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 原代CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 细胞毒性试验 |
| 2.6 白杨素和染料木素抗病毒活性检测试验 |
| 2.7 白杨素和染料木素影响MDV感染性试验 |
| 2.8 白杨素和染料木素抑制病毒复制作用环节的确定 |
| 2.9 细胞总RNA的提取 |
| 2.10 RNA反转录 |
| 2.11 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 |
| 2.13 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 药物成分对CEF的细胞毒性和安全浓度 |
| 3.2 药物对MDV在CEF细胞中复制增殖的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 研究内容二 黄芩苷、表儿茶素没食子酸酯和柚皮素对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 药物最大安全浓度检测 |
| 2.6 药物抗病毒活性检测试验 |
| 2.7 黄酮类化合物影响MDV感染性试验 |
| 2.8 黄酮类化合物抑制病毒复制作用环节的确定 |
| 2.9 细胞总RNA的提取 |
| 2.10 RNA反转录 |
| 2.11 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.12 间接免疫荧光试验 |
| 2.13 细胞蛋白的提取 |
| 2.14 免疫蛋白印迹试验 |
| 2.15 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 药物成分对CEF的安全浓度和生长的影响 |
| 3.2 药物对MDV感染CEF细胞的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 研究内容三 染料木素、黄芩苷和表儿茶素没食子酸酯联合应用对马立克氏病病毒在CEF中复制的影响 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 病毒和细胞 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 CEF的制备 |
| 2.2 病毒的复苏与扩增 |
| 2.3 病毒的PFU计数 |
| 2.4 黄酮类化合物的配制 |
| 2.5 黄酮类复合药物的最大安全浓度检测 |
| 2.6 黄酮类复合药物抗病毒活性检测 |
| 2.7 细胞总RNA的提取 |
| 2.8 RNA反转录 |
| 2.9 实时荧光定量PCR检测 |
| 2.10 数据统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 不同复合药物成分对CEF的安全浓度和生长的影响 |
| 3.2 药物对MDV感染CEF细胞的影响 |
| 3.3 药物对MDV感染CEF细胞中细胞因子表达的影响 |
| 4.讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗的研制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 文献综述 |
| 1 H9N2亚型禽流感流行情况及疫苗研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 H9N2亚型AIV的遗传进化 |
| 1.3 中国H9N2亚型AIV的流行现状 |
| 1.4 H9N2亚型AIV的生物学特性 |
| 1.5 H9N2亚型禽流感的基因重配 |
| 1.6 H9N2亚型AIV疫苗研究进展 |
| 1.6.1 常规全病毒灭活疫苗 |
| 1.6.2 重组病毒疫苗和载体病毒疫苗 |
| 2 新城疫流行情况及疫苗研究进展 |
| 2.1 新城疫的流行情况 |
| 2.2 新城疫疫苗研究进展 |
| 2.2.1 常规疫苗 |
| 2.2.2 新型疫苗 |
| 3 传染性支气管炎流行情况及疫苗研究进展 |
| 3.1 传染性支气管炎的流行情况 |
| 3.2 传染性支气管炎疫苗的研究进展 |
| 3.2.1 常规疫苗 |
| 3.2.2 新型疫苗 |
| 4 研究目的与意义 |
| 第一章 以PR8为骨架的重组H9N2亚型禽流感病毒的构建与筛选 |
| 1 材料 |
| 1.1 毒株,细胞株和实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 2 方法 |
| 2.1 质粒的构建 |
| 2.1.1 病毒RNA提取及cDNA制备 |
| 2.1.2 PCR扩增目的基因 |
| 2.1.3 连接中间载体(Blunt Simple) |
| 2.1.4 连接工作载体(PHW2000) |
| 2.1.5 质粒转化 |
| 2.1.6 酶切鉴定 |
| 2.2 反向遗传病毒的拯救及鉴定 |
| 2.2.1 质粒转染 |
| 2.2.2 病毒的拯救 |
| 2.2.3 病毒的传代培养 |
| 2.2.4 鸡胚半数感染量(EID_(50))测定 |
| 2.3 灭活疫苗的制备 |
| 2.3.1 疫苗制备原料的准备 |
| 2.3.2 抗原稀释与灭活 |
| 2.3.3 水相制备 |
| 2.3.4 油相制备 |
| 2.3.5 疫苗乳化 |
| 2.4 免疫效力的测定与攻毒保护试验 |
| 2.4.1 抗体水平监测 |
| 2.4.2 攻毒保护实验 |
| 2.5 统计学分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 序列进化树分析 |
| 3.2 HA、NA基因的PCR扩增结果 |
| 3.3 构建质粒的酶切鉴定结果 |
| 3.4 转染0H、48H、96H的细胞观察结果 |
| 3.5 重组毒株E6代EID_(50)与原始毒株EID_(50)的比较 |
| 3.6 免疫后抗体水平的监测 |
| 3.7 排毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 新支流三联灭活疫苗的制备及与同类产品免疫效力比较 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 毒株 |
| 1.2 SPF种蛋 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 新支流三联灭活疫苗的制备 |
| 2.1.1 抗原制备 |
| 2.1.2 抗原浓缩 |
| 2.1.3 抗原灭活 |
| 2.1.4 半成品检验 |
| 2.1.5 疫苗制备 |
| 2.1.6 成品检验 |
| 2.2 新支流三联灭活疫苗与同类产品免疫效力对比 |
| 2.2.1 抗体水平检测 |
| 2.2.2 攻毒保护试验 |
| 3 结果 |
| 3.1 病毒浓缩效果检验 |
| 3.2 疫苗半成品检验 |
| 3.3 疫苗成品检验 |
| 3.4 NDV抗体水平的监测 |
| 3.5 IBV抗体水平的监测 |
| 3.6 H9亚型AIV抗体水平的监测 |
| 3.7 攻毒后生存曲线示意图 |
| 3.8 排毒检测结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 本论文所用缩写符号说明表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 MDV的分子生物学特性 |
| 1.1.1 病毒的形态、结构和分类 |
| 1.1.2 病毒的基因组特征 |
| 1.1.3 病毒的主要致瘤基因概述 |
| 1.2 MD的致病机制 |
| 1.2.1 病毒早期的溶细胞感染 |
| 1.2.2 病毒的潜伏感染 |
| 1.2.3 病毒的第二次溶细胞感染 |
| 1.2.4 病毒转化T细胞形成肿瘤阶段 |
| 1.3 MD的流行病学 |
| 1.3.1 病毒的流行情况 |
| 1.3.2 病毒的毒力进化特征及毒株致病型的界定 |
| 1.3.3 病毒的自然感染宿主 |
| 1.3.4 病毒感染的发病日龄 |
| 1.3.5 病毒的传播方式 |
| 1.3.6 病毒与其他肿瘤性疾病病毒的共感染 |
| 1.4 MDV的诊断 |
| 1.4.1 临床诊断 |
| 1.4.2 病毒分离 |
| 1.4.3 病毒抗原检测 |
| 1.4.4 聚合酶链反应(PCR)扩增技术 |
| 1.4.5 DNA探针技术 |
| 1.5 针对MDV的防控措施 |
| 1.5.1 疫苗接种方案 |
| 1.5.2 生物安全 |
| 1.6 开展本课题研究的目的及意义 |
| 第二章 2017-2019广西及其周边地区马立克氏病病毒分子流行病学调查 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 试验所需的主要材料 |
| 2.1.2 试验中所用到的主要仪器设备 |
| 2.1.3 临床样本信息及来源 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备与培养 |
| 2.2.2 病鸡外周血淋巴细胞(PBL)的分离 |
| 2.2.3 组织病料的处理 |
| 2.2.4 病毒的接种与分离 |
| 2.2.5 病毒的间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测 |
| 2.2.6 病料组织或细胞培养物基因组总DNA的抽提 |
| 2.2.7 肿瘤病病原PCR鉴定 |
| 2.2.8 MDV meq基因克隆及序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 送检病鸡的临床症状及剖检病变 |
| 2.3.2 肿瘤病病原鉴定及MDV病毒分离结果 |
| 2.3.3 间接免疫荧光抗体试验(IFA)检测结果 |
| 2.3.4 MDV分离株meq基因序列的分析结果 |
| 2.3.5 基于meq基因的系统进化树分析 |
| 2.3.6 广西地区MDV毒力变化趋势 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 基于meq基因系统动力学分析揭示MDV在中国的起源和演变 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 样本序列及信息来源 |
| 3.1.2 处理数据所用的软件 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 MDV meq基因序列数据集 |
| 3.2.2 最佳核苷酸替代模型分析 |
| 3.2.3 贝叶斯系统发育分析 |
| 3.2.3.1 构建全球最大似然树 |
| 3.2.3.2 构建全球MDV早期地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.3 构建中国MDV强毒分离株地理系统动力学分析 |
| 3.2.3.4 中国MDV强毒分离株种群动态分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 MDV meq基因序列最佳核苷酸替代模型的选择 |
| 3.3.2 MDV系统发育分析 |
| 3.3.3 MDV地理系统分析结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 分离株GX18NNM4的致病性及疫苗免疫保护试验 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 相关试剂 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 毒株 |
| 4.1.4 实验动物和疫苗 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 鸡胚成纤维细胞(CEF)的制备及培养 |
| 4.2.2 GX18NNM4分离株的复苏和病毒增殖 |
| 4.2.3 GX18NNM4分离株纯化 |
| 4.2.4 GX18NNM4 分离株PFU测定 |
| 4.2.5 对试验鸡分组及疫苗免疫方案 |
| 4.2.6 对各试验组鸡生长增重情况的检测 |
| 4.2.7 对试验鸡免疫器官发育情况的检测 |
| 4.2.8 对试验鸡PBLs中病毒载量表达水平的动态检测 |
| 4.2.9 对鸡细胞因子PD-1、PD-L1的标准曲线的构建 |
| 4.2.9.1 PD-1和PD-L1引物合成及标准样品质粒的获得 |
| 4.2.9.2 PD-1、PD-L1 q-PCR标准曲线的建立 |
| 4.2.9.3 敏感性和重复性试验 |
| 4.2.10 对试验鸡组织中细胞因子PD-1和PD-L1的m RNA表达水平的检测 |
| 4.2.11 对试验鸡临床症状、鸡只剖检和病理组织学观察 |
| 4.2.12 对试验鸡发病情况及疫苗保护指数和毒力等级的测定 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 GX18NNM4 分离株PFU的测定结果 |
| 4.3.2 试验鸡生长性能的测定结果 |
| 4.3.3 试验鸡免疫器官指数的测定结果 |
| 4.3.4 MDV感染后PBLs中病毒载量动态检测结果 |
| 4.3.5 鸡细胞因子PD-1和PD-L1的标准曲线 |
| 4.3.5.1 鸡细胞因子PD-1、PD-L1 基因的RT-PCR扩增及克隆结果 |
| 4.3.5.2 质粒浓度及拷贝数结果 |
| 4.3.5.3 实时荧光定量RT-PCR标准曲线的获得 |
| 4.3.5.4 灵敏度和重复性试验 |
| 4.3.6 MDV感染后试验鸡组织中PD-1、PD-L1 m RNA表达水平的影响 |
| 4.3.7 试验鸡的临床症状、剖检病变及组织学观察结果 |
| 4.3.8 试验鸡发病情况及疫苗保护指数结果 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
（8）安徽省部分地区蛋鸡肿瘤病的临床诊断与病理组织学观察（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 病样来源 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 试验仪器设备 |
| 1.1.4 参考株及登录号表 |
| 1.1.5 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.2.2 临床病样采集 |
| 1.2.3 病毒的PCR鉴定 |
| 1.2.4 瑞氏-吉姆萨染色检查 |
| 1.2.5 病理组织切片检查 |
| 1.2.6 间接免疫荧光检测骤 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PCR检测结果 |
| 2.2 基因测序结果 |
| 2.3 组织病理学观察结果 |
| 2.4 免疫学结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 多重感染分析 |
| 3.2 基因序列分析 |
| 3.3 组织病理学观察结果分析 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（9）利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株及其检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 鸡马立克氏病(MD) |
| 1.2 鸡马立克氏病病毒(MDV)及其基因组结构 |
| 1.3 MDV的主要功能基因 |
| 1.4 MDV的毒力演化 |
| 1.5 MDV的分子变异 |
| 1.6 MDV功能基因研究 |
| 1.7 本研究的目的意义 |
| 第二章 利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株的研究 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病毒和SPF鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 sgRNA的设计 |
| 2.2.2 pX330质粒酶切和胶回收 |
| 2.2.3 pMeq-sgRNA质粒构建 |
| 2.2.4 PCR检测引物设计及分布 |
| 2.2.5 pMeq-sgRNA初步筛选 |
| 2.2.6 pMD-18T-GFP质粒构建 |
| 2.2.7 pCAGGS-GFP质粒构建 |
| 2.2.8 MDV△Meq重组毒拯救及体外生物学特性分析 |
| 2.2.9 MDV荧光重组毒拯救 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 pX330质粒酶切结果 |
| 2.3.2 pMeq-sgRNA初步筛选 |
| 2.3.3 pMD-18T-GFP质粒构建结果 |
| 2.3.4 pCAGGS-GFP质粒构建结果 |
| 2.3.5 MDV△Meq重组毒拯救结果 |
| 2.3.6 MDV荧光重组毒拯救结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 区分中国MDV野毒株与meq基因缺失株方法的建立 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 病毒、SPF鸡胚和SPF鸡 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 区分中国MDV野毒株与rBS△Meq株荧光定量PCR方法建立 |
| 3.2.2 区分中国MDV野毒株与rMS△Meq株荧光定量PCR方法建立 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 区分中国MDV野毒株与rBS△Meq株荧光定量PCR方法建立 |
| 3.3.2 区分中国MDV野毒株与rMS△Meq株荧光定量PCR方法建立 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 项目资助 |
| 作者简历 |
（10）过去五年10株ALV-J分离株全基因序列分析及接种ALV-J污染的活疫苗对三黄鸡的致病性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 禽白血病研究进展 |
| 1.1.1 禽白血病的简史 |
| 1.1.2 ALV的亚群分类 |
| 1.1.3 ALV的形态学和理化特性 |
| 1.1.4 ALV基因组结构和功能 |
| 1.1.5 ALV的主要蛋白组成 |
| 1.1.6 ALV的复制 |
| 1.1.7 外源性与内源性ALV |
| 1.2 ALV的致病性 |
| 1.2.1 ALV致肿瘤作用 |
| 1.2.2 ALV致肿瘤机制 |
| 1.3 ALV的传播 |
| 1.3.1 水平传播 |
| 1.3.2 垂直传播 |
| 1.3.3 人为传播 |
| 1.4 ALV的临床表现及病理变化 |
| 1.5 A LV感染特征 |
| 1.6 ALV的检测方法 |
| 1.6.1 细胞培养病毒分离 |
| 1.6.2 酶联免疫吸附实验 |
| 1.6.3 病毒核酸检测 |
| 1.6.4 病理组织学检测 |
| 1.6.5 间接免疫荧光试验 |
| 1.6.6 免疫组织化学技术 |
| 1.7 ALV的预防及防控 |
| 1.8 开展本研究的目的和意义 |
| 第二章 过去5年10株ALV-J分离株的鉴定及其全基因序列测定与分析 |
| 2.1 实验所需材料 |
| 2.1.1 病料来源与处理 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 所需试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 DF-1细胞培养病毒分离 |
| 2.2.2 样品DNA的提取 |
| 2.2.3 分离病毒的PCR反应及病原鉴定 |
| 2.2.4 分离株的IFA鉴定 |
| 2.2.5 ALV-J全基因组序列扩增、克隆及测定 |
| 2.2.6 胶回收纯化产物与载体的连接 |
| 2.2.7 连接产物转化入感受态细胞 |
| 2.2.8 阳性菌落的筛选和鉴定 |
| 2.2.9 ALV-J全基因组序列分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 ALV-J分离株的背景信息 |
| 2.3.2 细胞培养物上清ALV-p27抗原ELISA检测结果 |
| 2.3.3 分离病毒后病原PCR鉴定结果 |
| 2.3.4 分离株IFA鉴定的结果 |
| 2.3.5 ALV-J分离株全基因序列相似性及遗传进化树分析 |
| 2.3.6 ALV-J分离株各段的相似性分析的分析结果 |
| 2.3.7 ALV-J gp85和gp37基因序列分析结果 |
| 2.3.8 ALV-J gp85氨基酸熵值分析的结果 |
| 2.3.9 ALV-J LTR区序列分析的结果 |
| 2.3.10 ALV-J U3区序列分析的结果 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 第三章 免疫有外源性ALV-J污染的禽活疫苗对三黄鸡致病性的研究 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 毒株与细胞 |
| 3.1.2 实验动物及疫苗 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 从污染的疫苗中检测出外源性ALV的方法 |
| 3.2.2 TCID_(50)的测定方法 |
| 3.2.3 动物实验设计 |
| 3.2.4 试验鸡生长性能的检测 |
| 3.2.5 试验鸡免疫器官指数的检测 |
| 3.2.6 试验鸡抗体滴度的检测 |
| 3.2.7 试验鸡病毒血症动态监测 |
| 3.2.8 试验鸡排毒情况动态检测 |
| 3.2.9 试验鸡体内病毒载量的动态监测 |
| 3.2.10 试验鸡临床症状、病理解剖和病理组织学观察 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 试验鸡只生长性能的变化 |
| 3.3.2 试验鸡只免疫器官比重的变化 |
| 3.3.3 试验鸡只免疫疫苗抗体应答的检测结果 |
| 3.3.4 试验鸡只病毒血症的动态变化 |
| 3.3.5 试验鸡只泄殖腔排毒的动态变化 |
| 3.3.6 试验鸡只体内病毒载量的动态变化 |
| 3.3.7 试验鸡临床症状、病理解剖和病理组织学观察结果 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表论文情况 |
四、马立克氏病病毒648株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究（论文参考文献）
- [1]马立克氏病病毒多次跨膜蛋白pUL43多克隆抗体的制备及其体外表达分析[J]. 刘潇,宋佳玲,张金城,马德青,韦平,黄腾. 中国家禽, 2021(07)
- [2]J亚群禽白血病共感染检测、病毒分离鉴定及其抗性细胞系构建[D]. 李露媛. 扬州大学, 2021
- [3]鸡传染性喉气管炎病毒流行株生物学特征及影响其复制相关宿主蛋白作用机制的研究[D]. 吴咪. 内蒙古农业大学, 2021(01)
- [4]江苏地区家禽4种免疫抑制病病原检测及致瘤病毒三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 闫彩虹. 扬州大学, 2020(04)
- [5]黄酮类化合物抑制马立克氏病病毒在鸡胚成纤维细胞中复制的研究[D]. 杨帆. 扬州大学, 2020
- [6]鸡新城疫、传染性支气管炎、禽流感（H9亚型）三联灭活疫苗的研制[D]. 倪小舒. 扬州大学, 2020(04)
- [7]2017-2019马立克氏病病毒分子流行病学及分离株GX18NNM4的致病性研究[D]. 石梦雅. 广西大学, 2020(02)
- [8]安徽省部分地区蛋鸡肿瘤病的临床诊断与病理组织学观察[D]. 马奎. 安徽农业大学, 2019(05)
- [9]利用CRISPR/Cas9系统构建MDV meq基因缺失株及其检测方法的建立[D]. 张峰. 中国农业科学院, 2019(09)
- [10]过去五年10株ALV-J分离株全基因序列分析及接种ALV-J污染的活疫苗对三黄鸡的致病性研究[D]. 李海娟. 广西大学, 2019(01)