一、RNA干涉技术及其应用（论文文献综述）
王帅鹏[1]（2020）在《白菜型油菜BrDMC1响应盐胁迫的生理及分子机制研究》文中研究说明DMC1蛋白是真核生物典型的重组酶家族成员,具有搜索同源单链DNA来修复双链断裂的生物学功能。在修复胁迫产生的DNA氧化损伤中起重要作用。土壤盐渍化已成为全球极其重要的农业问题,因此鉴定出响应盐胁迫基因对提高植物胁迫耐受性具有重要意义。本研究中我们通过生物信息学的方法推测Br DMC1参与DNA修复过程,同时还可能参与植物对胁迫的响应,本实验通过RNA干扰技术下调白菜型油菜Br DMC1基因的表达水平,对比RNA干扰Br DMC1突变体和野生型在抗逆性的差异,来进一步探究Br DMC1在响应盐胁迫的可能机理。主要取得的实验结果如下:1.DMC1在白菜型油菜中有两个拷贝命名为Br DMC1.A01和Br DMC1.A03,对其功能域分析显示Br DMC1蛋白具有典型的重组酶Rec A结构域,功能上高度保守。通过半定量PCR验证了Br DMC1为单拷贝发挥功能,Br DMC1.A03未发生转录。2.使用q RT-PCR检测Br DMC1在Na Cl、Mannitol和ABA等不同胁迫处理下的表达量,结果显示Br DMC1受到盐胁迫的高度诱导。表明Br DMC1极有可能参与盐胁迫响应。3.Br DMC1基因在白菜型油菜的根、茎、叶、花、种子中均有表达,且花中表达量最高,其次在种子中。组织GUS染色结果显示,在pro Br DMC1::GUS转基因拟南芥的花以及萌动种子中能够检测到GUS信号。亚细胞定位结果显示Br DMC1蛋白位于细胞核上。4.克隆Br DMC1启动子,并对Br DMC1启动子进行了顺式作用元件预测发现其含有胁迫响应元件。并通过烟草叶片瞬时表达GUS来验证Br DMC1启动子在胁迫处理下的表达情况,结果显示Br DMC1启动子受到这些胁迫的诱导。5.创制白菜型油菜RNAi-Br DMC1转基因植株,抑制Br DMC1基因表达后发现,相比于对照野生型,进行盐胁迫处理,RNAi-Br DMC1种子萌发率显着降低,与此同时在正常（对照）处理下萌发率未见差异。进一步测定参与胁迫响应的抗氧化酶活性及渗透保护物质含量发现:RNAi-Br DMC1种子内抗氧化酶活性降低,可溶性糖含量降低,导致ROS清除能力降低,活性氧大量积累,MDA含量水平提高,膜质氧化加剧。大量积累的活性氧导致DNA氧化损伤加剧,造成RNAi-Br DMC1种子萌发严重滞后。以上结果进一步证实Br DMC1可能参与正向调控盐胁迫下植株的耐受性。
薛鹏[2]（2020）在《家蚕总RNA m6A修饰工具酶表达水平与其对BmNPV抗性的关系研究》文中指出已有的研究表明,N6-腺嘌呤甲基化（m6A）修饰在病毒侵染复制过程中具有重要的作用。家蚕核型多角体病毒病由家蚕核型多角体病毒（BmNPV）感染引起,BmNPV的感染途径分为经口感染和创伤感染,经口感染时BmNPV首先侵染幼虫中肠组织。那么,家蚕总RNA的m6A修饰水平与家蚕对BmNPV的抗性是否具有相关性呢?为此,我们以家蚕BmN细胞、家蚕普通品系秋丰和BmNPV抗性品系898WNB幼虫为材料,分别研究BmNPV感染后m6A修饰工具酶基因的表达水平、对病毒复制增殖的影响,以及抗性品系和普通品系m6A修饰工具酶基因表达水平的差异,主要研究结果如下。1、BmNPV感染前后BmN细胞m6A修饰工具酶基因表达水平的变化用BmNPV感染家蚕BmN细胞,利用荧光定量PCR（q RT-PCR）检测感染前后BmN细胞中m6A修饰工具酶基因METTL3、METTL14、Fl（2）d及YTHDC1转录水平的变化。结果显示,BmN细胞感染BmNPV后24 h,METTL3转录水平显着升高。2、BmN细胞中METTL3基因RNA干涉对BmNPV增殖的影响在BmN细胞中转染METTL3 ds RNA干涉METTL3基因的表达,并感染BmNPV,利用q RT-PCR检测BmNPV核衣壳蛋白基因VP39和囊膜融合蛋白基因GP64的转录水平的变化。结果显示,METTL3基因经RNA干涉后,VP39和GP64的表达水平均显着降低,说明降低METTL3转录水平可以在一定程度抑制细胞内BmNPV的复制。3、家蚕幼虫中肠组织m6A修饰工具酶基因的表达特性分析以秋丰为材料,利用q RT-PCR检测5龄饷食后72 h家蚕中肠组织中m6A修饰工具酶基因METTL3、METTL14、Fl（2）d和YTHDC1的转录特性,并利用Western-bloting检测了METTL3蛋白在不同时间的变化情况。结果表明,秋丰幼虫中肠组织METTL3的转录水平和蛋白水平变化相一致。4、家蚕幼虫中肠组织m6A修饰与家蚕品种对BmNPV抗性的关系以BmNPV抗性品系898WNB为材料,以普通品系秋丰为对照,5龄幼虫添食BmNPV多角体（1×108PIBS/m L）后,提取中肠组织总RNA,利用q RT-PCR检测m6A修饰工具酶基因METTL3、METTL14、Fl（2）d和YTHDC1在BmNPV感染前后表达水平的变化。结果显示,898WNB幼虫感染BmNPV后,中肠组织中METTL3转录水平降低,而秋丰幼虫中肠组织中METTL3转录水平升高,这说明家蚕幼虫中肠组织的METTL3表达水平高低与品种对BmNPV抗性强弱具有一定的相关性,抗性强的品系METTL3表达水平水平低。上述研究结果,有助于阐明抗BmNPV家蚕品系的抗性机制,并为抗性蚕品种选育提供参考。
常珈菘[3]（2020）在《家蚕全基因组编辑细胞库的构建及其应用》文中研究说明家蚕（Bombyx mori）是昆虫纲鳞翅目昆虫,有超过5000年的人工驯养的历史,自古以来就是中国重要的经济动物,也是中国传统文化的重要载体,同时,家蚕还是重要的鳞翅目模式生物,具有重要的研究价值。家蚕是较早完成全基因组测序的生物,而且家蚕已经建立了转基因技术、RNA干扰技术、基因组编辑技术等一系列遗传操作技术。经过几十年的研究,研究人员已经揭示了一系列家蚕基本遗传学问题,例如:性别决定、人工驯化等。但是,绝大多数的家蚕基因功能还未知。面对海量家蚕的功能基因和迫切的产业需求,我们急需一种全新的研究方法来加速家蚕功能基因组研究,加快家蚕功能基因组注释。在人类基因组计划（Human Genome Project,HGP）完成之后,注释基因组就成为了生物学的中心任务之一。近年来,高通量功能缺失筛选技术已被成功应用于基础生物学研究过程中新基因的功能注释。常用的高通量基因功能缺失筛选平台是基于RNA干扰（RNA interference,RNAi）或者规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）系统来建立的。与CRISPR系统相比,RNA干涉系统存在一些固有缺陷,限制了其应用,例如:脱靶效应、基因功能不完全缺失等。因此,全基因组的CRISPR系统是目前最有效的基因功能缺失筛选工具,已被用来识别必需基因、耐药基因和宿主-病原互作基因等。在本文中,我们利用piggyBac转座子将sgRNA文库稳定整合在家蚕胚胎细胞系（Bombyx mori embryonic cell line,BmE）的基因组上,建立了CRISPR全基因组编辑的筛选平台（BmE genome-scale CRISPR/Cas9 knockout library,BmEGCKLib）,这是首次在家蚕中构建高通量基因功能筛选平台。我们利用这个平台鉴定了家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因,以及BmE细胞系响应生物胁迫（家蚕核型多角体病毒,Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV）或者非生物胁迫（高温或低温）的基因。此外,在本研究中,我们应用piggyBac转座子系统替代普遍应用的慢病毒系统来递送CRISPR文库到目标细胞基因组上,为更多生物构建CRISPR全基因组编辑系统提供了新的递送工具。本研究的主要结果和结论如下:1.家蚕细胞转基因敲除系统的构建将CRISPR文库整合到宿主细胞基因组上是构建全基因组CRISPR筛选平台的关键步骤。在人或者小鼠的细胞中,CRISPR文库主要是应用慢病毒系统整合到基因组上。但是,慢病毒载体在昆虫细胞中转基因效率极低,不能满足构建文库的需求。在本文中,我们选择piggyBac转座子系统将CRISPR文库整合到家蚕细胞的基因组上。为了高效地将CRISPR文库整合到家蚕细胞基因组上,我们构建了一个一元载体系统,命名为:pB-CRISPR,该载体包括三个表达框,分别是由Hsp70启动子驱动的Cas9表达框、由U6启动子驱动的sgRNA表达框和由IE2启动子驱动的Zeocin抗性基因表达框。为了验证pB-CRISPR载体在家蚕胚胎细胞系BmE中的基因编辑效率,我们首先以BmE细胞为基础构建了一个稳定表达绿色荧光蛋白（enhance green fluorescence protein,EGFP）的细胞系BmE-Mi-EGFP。我们设计并构建了三个打靶绿色荧光蛋白编码基因EGFP的家蚕细胞转基因敲除载体pB-CRISPR-EGFP-1、pB-CRISPR-EGFP-2、pB-CRISPR-EGFP-3;两个不打靶EGFP的转基因敲除载体pB-CRISPR-NS-1和pB-CRISPR-NS-2作为对照。将这5个转基因敲除载体分别与piggyBac转座酶（piggyBac transposase）表达载体A3-Helper共转染至家蚕BmE-Mi-EGFP细胞系,转染后用含有Zeocin的完全培养基连续培养两个月。荧光显微镜观察显示:三种转染靶向EGFP的sgRNAs的载体（pB-CRISPR-EGFP-1、pB-CRISPR-EGFP-2、pB-CRISPR-EGFP-3）的实验组中几乎所有细胞的绿色荧光都消失了,而两组转染对照载体（pB-CRISPR-NS-1和pB-CRISPR-NS-2）的细胞中绿色荧光几乎保持不变,流式细胞仪分析显示同样的结果。最后,我们通过PCR扩增EGFP基因,并进行T-A克隆,应用Sanger测序法对突变模式进行了检测分析。我们挑选了44个单克隆进行Sanger序列,结果显示:几乎所有的EGFP基因都发生了突变,突变类型以小片段缺失为主。此外,超过70%的突变体发生了移码突变。这些结果表明,pB-CRISPR转基因敲除载体系统可以在BmE细胞中高效地实现基因编辑。2.家蚕BmE细胞全基因组编辑文库的构建为了在BmE细胞中建立全基因组CRISPR筛选文库,我们首先针对家蚕全部蛋白编码基因设计了1,534,227个sgRNAs,然后从中筛选了94,000个sgRNAs在94K基因芯片上合成寡核苷酸文库,筛选标准如下:为了提高移码突变效率,我们尽量选择靶向前三个外显子内并且打靶效率高而脱靶效率低的sgRNAs;最终,每个基因筛选出约6个sgRNAs。随后,从94K芯片中纯化出sgRNAs寡核苷酸文库,将其重组到家蚕细胞转基因敲除骨架载体pB-CRISPR上,构建家蚕全基因组编辑质粒文库,命名为:pB-CRISPR-lib。为了保证pB-CRISPR-lib具有较高的覆盖度和多样性,我们总共构建了大约1×108个克隆。最终,每个sgRNA覆盖了大约1000个克隆。之后,通过PCR扩增质粒文库pB-CRISPR-lib的sgRNA区域,并进行深度测序,分析质粒库的覆盖率、准确性和多样性。我们检测到51,431个sgRNAs,覆盖家蚕16198个基因,约占家蚕全部基因总数的97.7%。其中,约72%的sgRNAs的reads数在11–200之间。以上结果表明,我们构建的家蚕全基因组编辑质粒文库具有较高的覆盖度和较好的均匀度。在完成质粒文库的构建后,我们将pB-CRISPR-lib和A3-Helper共转染到家蚕胚胎细胞系（BmE）中,一共转染了150个T-25细胞培养瓶（25 cm2 flask）,每个sgRNA平均转染了大约2,000个细胞。经2个月的Zeocin筛选后,几乎所有细胞都整合了pB-CRISPR-lib系统,构建完成的家蚕全基因组编辑细胞文库,命名为BmEGCKlib（BmE genome-scale CRISPR/Cas9 knockout library）。随后,我们收集了4×107个BmEGCKlib文库的细胞,抽提基因组后测序分析sgRNA丰度。结果显示:BmEGCKlib细胞文库总计包含48,982个sgRNAs,约占pB-CRISPR-lib质粒文库中sgRNA数量的95.2%,相关性分析显示,BmEGCKlib细胞文库与pB-CRISPR-lib质粒文库高度相关,相关性系数为0.99。以上结果表明,我们构建的家蚕全基因组编辑细胞文库可以用于家蚕功能基因筛选。3.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因为了对家蚕的基本功能基因进行注释,我们首先应用家蚕全基因组编辑细胞文库BmEGCKLib鉴定了家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因。我们将构建好的细胞文库BmEGCKLib在27℃的条件下培养,每隔一个月收集一次细胞,每次收集4×107个BmEGCKLib文库的细胞,总共收集三次,分别命名为BmE-Lib 1、BmE-Lib 2和BmE-Lib 3。分别抽提三组细胞的基因组DNA,然后通过PCR扩增三组细胞的sgRNA片段进行深度测序。根据测序结果,我们计算了每个时间点的sgRNAs数量和sgRNAs丰度。结果表明,随着时间的推移,BmEGCKlib细胞文库中sgRNA的数量逐渐减少。虽然sgRNAs的总体丰度呈逐渐减少的趋势,但部分sgRNAs明显富集,表明随着培养时间的延长,BmEGCKlib细胞文库受到了筛选。我们利用MAGeCK软件分析家蚕胚胎细胞系BmE的必需基因和生长抑制基因。生物学重复实验显示,在基因水平（r=0.76）和sgRNA（r=0.87）水平具有高度可重复性,说明我们的筛选实验数据可信度很高。之后,我们计算了正筛选基因（sgRNA富集）得分和负筛选基因（sgRNA消耗）得分,然后以p-value≤0.05为阈值,总共筛选到1,006个必需基因和838个生长抑制基因。我们还发现,家蚕BmE细胞的必需基因和其他真核生物的必需基因高度重叠,但是和原核生物的必需基因重叠较少。家蚕BmE细胞的必需基因和生长抑制基因几乎都均匀地分布在28对染色体上。结合BmE细胞转录组数据,我们发现,与家蚕所有基因的平均表达水平相比,家蚕BmE细胞必需基因的平均表达水平更高,而BmE细胞生长抑制基因的平均表达水平比家蚕所有基因的平均表达水平低。同时我们对家蚕丝腺细胞的基因表达水平进行了同样的调查,也呈现出相同的规律。家蚕BmE细胞必需基因的基因本体论（Gene Ontology,GO）功能富集分析显示,BmE细胞的必需基因主要与核心细胞成分相关。为了确定家蚕BmE细胞必需基因的生物学功能,我们对家蚕BmE细胞的必需基因进行了KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集分析。结果显示,富集程度最高的通路大多与DNA代谢、RNA代谢或者蛋白质代谢相关,如:核糖体、RNA转运、mRNA、剪接体、核糖体生物发生、嘧啶代谢等。此外,我们还对BmE细胞的必需基因和生长抑制基因进行了亚细胞定位分析。结果显示,家蚕BmE细胞的必需基因主要定位于细胞核（38.2%）和细胞质（34.4%）。我们还发现,定位于细胞核和线粒体的基因中,必需基因的比例比生长抑制基因要高。4.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因自然环境对生物是至关重要的,环境变化往往会给生物体带来巨大的挑战。为了应对极端环境带来的生存挑战,生物进化出了很多的重要抵抗机制。本部分我们应用家蚕全基因组编辑细胞库筛选了家蚕响应高温或低温胁迫的基因,为研究生物体在高温或低温胁迫下的生理生化反应提供参考。我们将BmEGCKLib细胞文库平均分成三组,每组含有4×107个BmEGCKLib文库细胞。其中两组作为实验组,分别在4℃或者30℃培养,另一组作为对照组,在BmE细胞的正常培养温度（27℃）培养。培养20天后,分别收集三个组所有存活的细胞,提取三组细胞的基因组DNA,然后PCR扩增sgRNAs区域,进行深度测序分析,鉴定家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因。之后,我们对筛选到的家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因做了KEGG通路富集,分析这些基因可能的生物学功能。KEGG富集分析显示,4℃存活的细胞正筛选得到的基因（sgRNA富集）主要富集在必需基因的通路,这些通路主要包括RNA相关通路和蛋白质相关通路。此外,负筛选基因在甾体生物合成途径、脂肪酸生物合成通路和脂肪酸代谢通路富集,暗示维持细胞膜的流动性是细胞应对高温或低温胁迫的关键。然后,我们对筛选到的家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因做了亚细胞定位分析。我们发现,在4℃组和30℃组中,细胞膜上的负筛选基因均多于正筛选基因。然而,在4℃和30℃两组细胞中,线粒体上的正筛选基因均多于负筛选基因。这表明生物膜系统更有可能被高温或低温摧毁,降低能量代谢水平可能有助于细胞在极端环境下存活。5.运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染基因家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrodrovirus,BmNPV）是对蚕业生产危害最大的病原微生物。在本部分,我们将运用家蚕全基因组编辑细胞库（BmEGCKlib）筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因。我们将家蚕全基因组编辑细胞库（BmEGCKlib）均匀的分成两份,每份包含4×107个BmEGCKlib文库细胞。其中一份感染BmNPV（每隔一天感染一次,总共感染4次）,然后用流式细胞仪分选出绿色荧光蛋白阴性的少数细胞作为实验组,另一份不感染BmNPV作为对照组。分别收集实验组和对照组的所有存活细胞,提取两组细胞的基因组DNA,然后PCR扩增sgRNAs区域,进行深度测序分析,鉴定家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因。我们总共鉴定到811个正筛选基因和809个负筛选基因。之后,我们对筛选到的基因进行了KEGG通路富集分析,显着富集的通路是:吞噬体、Notch信号通路、Wnt信号通路等。最后,我们选择了三个家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的正筛选基因,构建了三个单基因敲除细胞系来验证我们的筛选结果。与对照相比,三个单基因敲除的细胞系均表现出一定的BmNPV抗性。总结:在本文中,我们首次构建了家蚕全基因组编辑细胞库,然后我们应用家蚕全基因组编辑细胞库筛选鉴定了家蚕BmE细胞的必需基因和生长抑制基因,以及家蚕BmE细胞响应生物胁迫（BmNPV侵染）或者非生物胁迫（高温或低温）的基因。我们的研究结果为家蚕基因组的功能注释提供了一个全新的高通量平台。此外,本研究还为非模式生物全基因组CRISPR筛选提供了可供借鉴的研究策略。
焦健,杜鹏[4]（2020）在《siRNA干涉技术在黄曲霉毒素抑制中的研究》文中进行了进一步梳理构建真菌基因敲除突变体的传统方法周期较长,为了快速检测和高通量筛选具有特定功能的目标基因,本研究利用小分子RNA干涉技术,沉默了黄曲霉毒素生物合成关键基因,有效降低了黄曲霉毒素B1（AFB1）的生物合成。通过设计合成人工小干涉RNA（artificial siRNA）,特异靶向黄曲霉毒素合成路径的关键基因aflR,将siRNA直接转化黄曲霉原生质体,有效沉默了黄曲霉毒素合成的关键调控基因aflR,并导致AFB1的合成明显减少。利用特异靶向黄曲霉毒素合成路径中其他11个靶标基因的siRNAs,通过原生质体转化方法可直接沉默这些基因,沉默后这些基因的转录水平均显着降低,其中hypC和aflW两个基因沉默后AFB1的生物合成量与对照相比下降显着。此外,利用特异靶向黄曲霉毒素合成基因簇外基因的siRNA,如pks-nrps基因,通过siRNA干涉技术沉默该基因同样可显着降低AFB1的合成。因此,本研究借助小分子RNA干涉技术,建立了一种快速检测和高通量筛选黄曲霉毒素生物合成路径相关基因的反向遗传学方法。
麦艳娜[5]（2018）在《小麦全蚀病菌ADP/ATP转位酶基因RNAi载体构建及龙胆酸加双氧酶基因RNAi的研究》文中指出小麦全蚀病菌是一种土壤寄居菌,引发的全蚀病是一种典型的小麦根部病害,对小麦产量有严重影响。目前,在普通小麦中尚没有发现对全蚀病高抗或免疫的品种。本研究在本实验室前期发现细胞分裂控制蛋白（Cdc）、龙胆酸加双氧酶（Gdo）、ADP/ATP转位酶（At1）这三种基因的RNA干涉能够影响小麦全蚀病菌生长发育的基础上,构建了RNA干涉载体,利用根癌农杆菌共培养方法,对小麦全蚀病菌进行了遗传转化,并对转化子后代的生长和致病能力进行了初步分析与研究。得到以下几个方面的结果:1.在p BHt2-CHSA-Intron载体上茶尔酮合成酶基因内含子序列（CHSA Intron）的上下游两边,分别通过无缝连接和双酶切连接的方法插入两段序列相同但方向相反的ADP/ATP转位酶基因（At1）片段,成功构建了At1的RNA干涉载体。2.对根癌农杆菌介导的遗传转化体系进行优化:用机械破碎和溶壁酶分别处理全蚀病菌菌丝,对遗传转化后代转化率的影响不大;全蚀病菌和根瘤农杆菌固体共培养体系转化率为43.01%,液体共培养体系转化率为35.77%,利用固体共培养体系更有利于提高转化率;潮霉素B浓度为200μg/ml时,野生全蚀病菌在PDA平板上几乎不生长,该浓度可用于筛选遗传转化后代。3.根癌农杆菌介导的遗传转化后代,在含潮霉素B的平板上继代三次后,随机挑选30个转化子,接种到无潮霉素B的平板上,25℃黑暗培养7天,结果转化子与野生全蚀病菌之间菌落直径存在极显着性差异,转化子生长速度明显小于野生菌。从中选出4个转化子进行鉴定,结果显示均含有T-DNA片段,证实利用潮霉素B筛选得到的转化后代是转化子。4.利用这4个转化子感染小麦根部,结果有2个转化子对小麦的致病性明显减弱,另外两个致病力没有变化。
唐少宇[6]（2018）在《多溴联苯醚的微生物降解机制及产物毒性研究》文中研究表明多溴联苯醚（PBDEs）是一类广泛使用的溴代阻燃剂,造成的环境污染对人类健康和生态环境带来极大的危害。本文以2,2’,4,4’-四溴联苯醚（BDE-47）作为PBDEs的代表污染物,以本课题组菌种库中筛选到的一株对BDE-47具有高效降解/吸附作用的细菌—铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）为实验菌株,研究其对BDE-47的降解性能,分析BDE-47降解产物的生成规律及细胞毒性效应,利用转录组测序技术从基因水平解释微生物降解转化PBDEs的分子生物学机制。以Cr（VI）作为重金属代表,探索PBDEs和重金属共存在P.aeruginosa细胞界面的复合效应和的降解转化规律。主要研究成果如下:P.aeruginosa对BDE-47具有较好的降解效果,添加一定量的碳源和表面活性剂可以提升菌种对BDE-47的降解性能。P.aeruginosa对BDE-47的降解主要是通过胞内酶的作用,降解产物主要包括BDE-28和BDE-7两种脱溴产物和6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、2-OH-BDE-28和4-OH-BDE-17等4种羟基化降解产物,另外还生成了2,4-DBP和4-BP两种溴酚类产物。P.aeruginosa对中间代谢产物BDE-28、BDE-7和2,4-DBP具有很好的降解效果。转录组测序结果发现,P.aeruginosa降解BDE-47的过程中有991个基因表达上调,923个基因表达下调（FDR≤0.001,|log2Ratio|≥1）。细胞膜外膜粘附蛋白、脂多糖、ABC转运蛋白、青霉素结合蛋白和孔蛋白等可能参与了P.aeruginosa胞外吸附BDE-47并将污染物运输到细胞内的过程。辅酶A连接酶、脱卤酶、P450单加氧酶、水杨酸羟化酶和尿黑酸1,2-双加氧酶可能参与了BDE-47还原脱溴、氧化羟基化以及开环矿化的分解代谢过程。过氧化物酶、超氧化物歧化酶、DNA修复重组蛋白和外排泵等基因的表达上调有利于菌体抵抗污染物造成的氧化胁迫。通过实时荧光定量PCR技术、RNA干涉技术等分子生物学实验发现P.aeruginosa降解/转化PBDEs过程中的外排泵机制。胞外的PBDEs通过细胞膜上的一些通道进入细胞内,一部分在胞内酶的作用下被降解,一部分会通过细胞膜上的外排泵排出细胞外,使得胞内积累的PBDEs在较低的水平,这既保证了PBDEs的有效降解,又可以使微生物细胞在处理较高浓度PBDEs时也保持高活性。BDE-47及其8种代谢产物对肝癌细胞HepG2的毒性研究结果表明,BDE-47及其所有降解产物对细胞的毒性表现为降低细胞存活率和增加细胞凋亡率,且这个毒性效应具有时间效应和剂量效应。BDE-47及其所有降解产物通过诱导ROS生成、影响SOD酶和GSH活性、扰乱细胞周期和诱导细胞基因损伤等方式造成细胞的死亡和凋亡。总的来说,溴酚类产物（2,4-DBP和4-BP）对HepG2细胞的毒性最高,其次为羟基化产物（6-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、2-OH-BDE-28和4-OH-BDE-17）,而脱溴产物（BDE-28和BDE-7）的毒性相对是最低的。低剂量BDE-47、BDE-28和BDE-7预处理后,细胞产生了一定含量的ROS,可以刺激细胞抗氧化系统和其他的防御系统抵制外来污染物的干扰,提升SOD酶和GSH的活性,减弱高剂量暴露造成的细胞氧化胁迫,并且预处理过后激活基因的修复系统,细胞的基因损伤会显着降低,提升了细胞存活率,并减少了细胞的凋亡。P.aeruginosa可以同时降解BDE-47和去除Cr（VI）。P.aeruginosa对Cr（VI）的去除过程主要分两步,首先在细胞外将Cr（VI）还原为Cr（III）,然后Cr（III）被吸附到细胞膜上或者进入细胞内。低浓度的BDE-47可以作为碳源促进菌体生长,提高胞外酶的产量,从而提高Cr（VI）的去除率;但是高浓度的BDE-47会抑制P.aeruginosa生长,从而抑制细菌对Cr（VI）的去除。低浓度的Cr（VI）共存时,可以刺激P.aeruginosa合成分泌更多的鼠李糖脂,并且一定程度地提高细胞表面疏水性和细胞质膜通透性,从而使更多的BDE-47能够进入细胞进而在胞内酶的作用下被分解代谢;另外,Cr（VI）还能促进细菌细胞分泌更多的胞内蛋白,从而提高BDE-47的降解率。上述研究为PBDEs的微生物降解、降解机制、降解产物的细胞毒性等领域的研究提供一定的理论依据。并且探讨了重金属共存条件下对PBDEs在细菌细胞水平的吸附、降解和转化的影响,具有重要的现实意义。
赵丹[7]（2016）在《烟草（Nicotiana tabacum L.）降烟碱代谢调控的分子机制研究》文中研究说明烟碱（nicotine）是普通烟草（Nicotiana tabacum L.）中主要的生物碱,占生物碱总含量的90%-95%,而降烟碱（nornicotine）含量通常低于总生物碱的5%,烟草在其成熟衰老和烘烤过程中大部分烟碱转化为降烟碱,使降烟碱成为含量最高的生物碱（Wernsman et al.,1968）。由于降烟碱不仅对烟草香味有影响,还会对人体健康产生危害,是潜在致癌物质亚硝基降烟碱（nitrosonornicotine,NNN）的合成前体。因此,本研究利用现代分子生物学手段,从基因水平探讨降烟碱代谢调控的分子机制,为烟草育种奠定理论基础。取得如下研究结果:（1）不同类型烟草种质烟碱和降烟碱含量及基因表达差异分析采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）和Real time PCR技术,分析了7种类型烟草材料叶片烟碱、降烟碱和亚硝基降烟碱含量及相关基因表达。通过比较,不同类型烟草种质的烟碱含量依次为黄花烟（黄花烟）>白肋烟（TN90）>烤烟（K326）>野生种（黏烟草）>晒烟（永胜）>香料烟（巴斯马）>晾烟（Florida301）,降烟碱依次为烤烟（K326）>白肋烟（TN90）>黄花烟（N.glutinosa）>野生种（黏烟草）>晒烟（永胜）>香料烟（巴斯马）>晾烟（Florida301）。而不同类型烟草种质的烟碱和降烟碱生物合成酶基因表达差异较大,表明烟碱和降烟碱生物合成是代谢途径中多基因共同作用的结果,推测烟碱和降烟碱含量可能还受到其他因素的影响。（2）PMT和QPT基因对烟碱生物合成的影响利用RNA干涉技术,经农杆菌介导法分别将人工合成并构建的含甲基腐胺转移酶（putrescine methyltransferase,PMT）、喹啉磷酸核糖转移酶（quinolinate phosphoribosyltransferase,QPT）基因超量表达载体和干涉PMT和QPT表达载体导入烤烟品种K326,经GUS组织化学染色和PCR鉴定,共获得转基因植株33株,其中转PMT基因烟草植株10株,转QPT基因烟草植株15株和转干涉PMT和QPT基因表达烟草植株8株。对基因超量表达植株、干涉表达植株烟碱和降烟碱含量及相关基因表达量分析表明,转PMT基因超量表达植株烟碱和降烟碱含量均显着高于野生型;转PMT和QPT干涉载体植株的烟碱和降烟碱平均含量比野生型植株分别降低了31.5%和60%,转QPT基因超量表达植株烟碱和降烟碱平均含量与野生型相比差异不显着。基因表达分析表明,PMT基因在超量表达PMT植株中的平均表达量为野生型植株的20倍,而在干涉植株中显着低于野生型,证明PMT是烟碱和降烟碱生物合成的关键酶基因。QPT基因在超量表达植株中的表达量高于野生型植株,最高上调46.2%,但在干涉QPT基因表达的植株中,QPT基因表达的干涉抑制不明显,有可能选择干涉的QPT片段效果不明显。（3）CYP82E4v1基因对降烟碱生物合成的影响通过同源克隆方法获得烤烟品种K326 CYP82E4v1基因全长DNA序列,分析发现该品种CYP82E4v1基因DNA序列全长1974bp,含有1段420bp的内含子。开放阅读框与NCBI报道的普通烟草CYP82E4v1基因相似度为99.81%,仅有3个碱基差别,编码氨基酸相似度为100%。农杆菌介导法将含CYP82E4v1超量表达和干涉表达的植物表达载体导入烤烟品种K326,获得转基因植株61株,其中超量表达植株42株,干涉表达植株19株。分析结果表明,转CYP82E4v1基因超量表达植株烟碱平均比野生型植株降低16.3%,降烟碱平均比野生型增加88.9%;而转CYP82E4v1干涉载体植株烟碱和降烟碱平均含量比野生型植株分别增加8.1%和降低61.1%,Real-Time PCR分析结果表明,超量表达植株中CYP82E4v1基因表达为野生型的20倍以上,在干涉表达植株中表达量仅为野生型的6%,表明CYP82E4v1的超量表达能提高烟草降烟碱含量,该基因的表达受到抑制时降烟碱合成受阻。同时,在干涉表达植株中其他降烟碱合成基因,如CYP82E5v2和CYP82E10等也受到不同程度的抑制,进一步证明烟碱是降烟碱的合成前体,降烟碱是烟碱去甲基化的产物。此外,在构建植物表达载体时,引入衰老基因SAG12启动子驱动重组酶基因FLP的“Gene-deletor”系统,在烟草叶片发育后期以清除转基因植株中外源的选择标记基因和报告基因表达元件（35S∷GUS∷NPT II∷NOS）,从而获得了降烟碱含量低且不含筛选标记基因的转基因烟草植株。利用基因编辑技术CRISPR/Cas9对CYP82E4v1基因开展定向突变,通过潮霉素抗性筛选已获得降烟碱含量较野生型低的F1代烟草植株,初步探索烟草分子技术。（4）烟碱和降烟碱合成部位的研究采用植物组织培养技术,获得无根的茎叶、无茎叶的根以及具有根和茎叶的完整植株。分析了各类型组培材料的烟碱和降烟碱含量,结果发现烟碱和降烟碱含量在无茎叶的根中极显着高于无根的茎叶,Real-Time PCR分析表明,无根的茎叶中PMT基因表达量仅为无茎叶根的0.14%,QPT基因表达量为无茎叶根的14.58%,CYP82E4v1基因在幼嫩烟草组织中表达量较低,CYP82E5v2主要在根中表达,无茎叶的根表达量是无根茎叶的6.08倍,CYP82E10主要在茎叶中表达,无根的茎叶表达量是无茎叶根的1.22倍。但完整烟草植株中烟碱和降烟碱含量是根中极显着低于茎叶,说明烟碱主要在根系合成,最终在茎叶中积累。而降烟碱含量在无根的茎叶中极显着低于无茎叶的根,可能是因为选择的研究材料多为幼嫩组织,而降烟碱主要是在成熟和加工过程中转化产生,因此研究结果与文献报道不一致（Wada,1956）。（5）干涉CYP82E4v1基因对烟碱抗蚜虫的影响利用T1代干涉CYP82E4v1基因烟草植株和野生型植株为研究对象,采用不同激素喷施处理,结果表明喷施生长素（Indole acetic acid,IAA）和赤霉素（Gibberellin A3,GA3）可降低烟草植株中的烟碱含量,在T1代转基因植株中烟碱含量降幅较野生型植株小;而喷施脱落酸（abscisic acid,ABA）和细胞分裂素（6-benzylaminopurine,6-BA）则促进了烟碱的积累,但野生型的积累量显着高于转基因植株,外源植物激素的喷施对干涉植株中烟碱含量影响较小。蚜虫接种实验表明,从接种蚜虫第12d后,T1代转基因植株蚜虫虫口数显着低于野生型植株,证明转基因植株对烟蚜的抗性显着高于野生型植株。当接种蚜虫3d时,T1代转基因植株及野生型植株接种蚜虫后的抗氧化酶（antioxidant enzymes,AOEs）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalaninammonilyase,PAL）酶活性较未接虫对照显着提高,但在接虫植株间差异不显着。接种蚜虫1d和3d时相比,水杨酸（salicylic acid,SA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）信号通路中的病程相关蛋白（pathogenesis-related proteins,PRs）基因PR-1a表达无显着增加,说明烟草植株在应答蚜虫侵害时并非通过调节SA抗病信号通路中的PR-1a基因高表达产生的防御保护。相反,JA诱导的脂肪氧合酶基因（JA-inducible lipoxygenase,LOX）LOX在干涉植株和野生型植株中的表达量均显着高于未接种对照组,是未接种对照组的1.4-2.2倍,说明接种蚜虫引起了植株JA抗虫信号通路的表达以应答对虫害的侵入。另外,尽管转基因植株与野生型植株中LOX和葡聚糖酶（β-1,3-glucanase）基因BGL的表达均显着高于未接虫对照,但在接种组植株间并无显着差异,说明CYP82E4v1干涉植株对烟蚜虫口数的抑制并非通过显着提高JA信号通路中的抗性防御应答来实现,而是由于较高的烟碱积累所引起的神经或拒食毒性所产生。
李志腾,常国斌,徐璐,马腾,陈静,陈蓉,王洪志,刘璐,徐琪,陈国宏[8]（2016）在《鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率》文中进行了进一步梳理【目的】针对禽类干细胞研究中,存在转染效率与干涉效率低下的问题,通过比较不同干涉方式对鸡原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）中Piwi基因的干涉效果,探讨提高禽类生殖干细胞干涉效率的有效方法。为进一步研究Piwi基因参与干细胞自我更新、RNA沉默以及转录后调控过程等生物学功能研究奠定基础。【方法】根据已建立的原代细胞分离技术,分别从健康鸡群的10日龄和4日龄鸡胚中分离成纤维细胞（chicken embryo fibroblast,CEF）与生殖脊,其中CEF作为PGCs细胞的饲养层,生殖脊经Trypsin-EDTA室温下消化获得PGCs细胞,并通过形态学、化学方法（PAS糖原染色、AKP活性检测）和免疫学方法（TERT抗体、SSEA-1抗体）对其进行鉴定。根据Genbank公布的鸡Piwi基因的m RNA序列（NM001098852）,利用在线软件分别靶向不同位点设计合成得到3个小片段的stealth si RNAs,并将通用无义序列BLOCK-i TTM Alexa Fluor®Red Fluorescent Oligo作为荧光素标记的阴性对照si RNA。同时,在线设计三条干扰序列和一条非特异性阴性对照序列,将其插入线性化空载体p RNA-U6.1,构建不同的sh RNA干涉载体。分别采用不同类型的转染试剂将构建好的si RNA和sh RNA转染PGCs细胞。首先利用通用无义si RNA以及仅带有GFP荧光标记基因的sh RNA载体作为阴性对照,检测si RNA和sh RNA转染效率,确定最佳转染条件。其次,将试验组si RNA和sh RNA在优化条件下转染PGCs细胞,分别收集转染了24、48、72和144 h这4个时间点的细胞,提取各个时间段的总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测Piwi基因m RNA表达水平,并用SPSS软件分析不同处理组的差异。【结果】在对原代分离的PGCs细胞进行了形态学、化学以及免疫学方法鉴定后,确认其所获得的细胞为PGCs细胞且状态良好。根据不同的转染试剂量与si RNA或sh RNA载体量的配比,得出si RNA转染最优条件为si RNA﹕Lipofectamine TM 2000=50 pmol﹕2μL;sh RNA转染最优条件为sh RNA﹕X-Treme GENE HP DNA Transfection Reagent=500 ng﹕1.5μL。在以上最优转染条件下,将试验组si RNA和sh RNA分别转染第二代PGCs细胞。发现在si RNA干涉组中,阴性si RNA组和空白组相比,Piwi基因表达量在24、48、72和144 h差异均不显着（P>0.05）;而3个试验组si RNA与阴性对照组相比,在24、48和72 h的Piwi基因表达量均呈现显着下降（P<0.05）,但在144 h时表达差异不显着（P>0.05）。在sh RNA干涉组中,空白组和阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上差异均不显着（P>0.05）;而3个试验组与阴性对照组相比,Piwi基因表达量在4个时间点上均显着下降（P<0.05）。与si RNA干涉试验组相比,sh RNA载体表现出更强及更长时间的稳定抑制Piwi基因的效果。【结论】si RNA与sh RNA均能较好抑制目的基因的m RNA表达,不同干涉效果表明采用sh RNA载体具有更好及更长时间的抑制作用,这为RNAi技术在家禽生殖干细胞中的应用研究提供基础资料。
彭文舫[9]（2015）在《Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析》文中提出许多细菌和大多数的古菌基因组均编码称作CRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic repeat-CRISPR-associated）的获得性免疫系统来抵御病毒或质粒的侵害。CRISPR-Cas系统被分为3个主要类型,I型,II型和III型,又被进一步划分为11个亚型。Sulfolobus islandicus Rey15A编码一个I-A亚型（Cascade）和两个III-B亚型（Cmr-α和Cmr-β）CRISPR-Cas干涉系统,本研究项目开始以前,这些系统中的cas基因的功能未被解析,而且,当时已研究过的Cmr系统被证实在体外切割RNA,但它们的体内RNA切割活性并未被证实。本研究的以S.islandicus Rey15A为研究材料,解析了I-A亚型系统中每个Cas蛋白在CRISPR介导的DNA干涉中的功能,另外,明确地证实了Cmr系统的体内RNA干涉活性。为了分析S.islandicus Rey5A I-A亚型系统中单个cas基因在入侵物免疫过程中的功能,我们构建了S.islandicus Rey5A I-A亚型系统中单个cas基因以及除I-A亚型系统外的其它几个cas基因座的缺失株。对每个缺失株在pre-cr RNA加工及质粒干涉方面的表型进行分析后,结果说明,Cas7,Cas5,Cas6和Cas3为I-A亚型系统介导的DNA干涉所必需的蛋白成分,然而,Csa5及其它几个CRISPR-Cas系统均不参与此过程。Cas6被证实为此菌株中唯一一个负责pre-cr RNA加工的酶,同时Cas7,Cas5和Cas3也介入此过程。Cas7和Cas5分别稳定pre-cr RNA加工中间产物和成熟cr RNA;缺少Cas3后加工中间产物大量积累,但其中涉及的原理目前未知。S.islandicus Rey15A Cmr系统介导的的体内RNA干涉活性的确定是通过构建一个RNA干涉试验来实现的。RNA干涉试验的原理是在质粒上表达一个人工CRISPR（artificial CRISPR;所得到质粒称为p AC质粒）,该人工CRISPR含有一个来源于β-糖苷酶编码基因lac S的spacer,因此,从p AC上表达出来的cr RNA能够介导内源CRISPR-Cmr系统对lac S信使RNA进行干涉,而干涉效果可以通过检测p AC转化子细胞提取物中残留的β-糖苷酶活性来进行评估。在不同的Cmr基因座缺失株中检测RNA干涉活性结果显示,只有两个Cmr基因座均缺失的突变株失去了RNA干涉能力,说明每个Cmr系统均参与了体内RNA干涉。在spacer的不同位点引入突变并用来构建p AC质粒,通过检测这些突变对RNA干涉活性的影响,一个位于cr RNA 3’端的3 nt长的序列被确定为对RNA干涉活性至关重要。对p AC转化子中未被切割的lac S信使RNA的量用实时定量PCR进行评估的结果进一步证实了Cmr介导的体内RNA切割活性。3’-RACE结果显示,lac S信使RNA中的剪切位点被定位在S1 protospacer序列内,结果还表明,Cmr-α利用尺标原理在测定的（间隔6 nt）位点对RNA进行切割,而Cmr-β则利用序列特异性原理在类似UA（UA,UG或UU）位点切割protospacer RNA。
陈若飞[10]（2009）在《RNA干扰技术及其应用研究》文中提出RNA干涉作用,是生物界一种古老而且进化上高度保守的现象。是基因转录后沉默作用（PTGS）的重要机制之一。它能定向关闭生物体内某一基因,使其不发挥作用,同时不影响其他基因的功能,便于研究特定基因的功能。在后基因组时代的基因功能研究、基因治疗和药物开发中具有广阔的应用前景。
二、RNA干涉技术及其应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RNA干涉技术及其应用（论文提纲范文）
（1）白菜型油菜BrDMC1响应盐胁迫的生理及分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 盐胁迫对植物的影响 |
| 1.1.1 盐胁迫下的DNA损伤修复 |
| 1.1.2 种子萌发过程的DNA损伤 |
| 1.1.3 同源重组修复与逆境胁迫 |
| 1.2 重组酶DMC1基因研究进展 |
| 1.2.1 重组酶基因DMC1 |
| 1.2.2 基因组复制事件对基因功能的影响 |
| 1.2.3 DMC1对同源重组及胁迫的影响 |
| 1.3 转基因技术研究进展 |
| 1.3.1 CRISPR-Cas9 编辑技术概述 |
| 1.3.2 RNAi技术概述 |
| 1.3.3 农杆菌介导的白菜型油菜浸花法概述 |
| 1.4 目的意义 |
| 2 BrDMC1基因的鉴定和生物信息学分析 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 总RNA的提取 |
| 2.2.2 cDNA的合成 |
| 2.2.3 BrDMC1基因克隆 |
| 2.2.4 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.2.5 白菜型油菜DMC1基因结构和保守功能域 |
| 2.2.6 拟南芥和白菜型油菜DMC1基因的分子进化率 |
| 2.2.7 白菜型油菜和拟南芥DMC1基因的GO功能注释 |
| 2.2.8 BrDMC1理化性质及共表达网络分析 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 植物DMC1的进化及表达分析 |
| 2.3.2 DMC1基因结构、功能域及启动子顺式元件分析 |
| 2.3.3 白菜型油菜和拟南芥DMC1基因的分子进化率及GO分析 |
| 2.3.4 白菜型油菜BrDMC1编码蛋白序列分析 |
| 2.3.5 BrDMC1蛋白的共表达网络分析 |
| 2.3.6 白菜型油菜DMC1基因的分子验证 |
| 2.4 讨论 |
| 3 BrDMC1基因的表达模式分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 植物材料及培养条件 |
| 3.1.2 载体及相关试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 测序及引物合成 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 DNA的提取 |
| 3.2.2 总RNA的提取及反转录 |
| 3.2.3 半定量PCR及荧光定量q PCR程序 |
| 3.2.4 pro Br DMC1::GUS融合载体的构建 |
| 3.2.5 烟草叶片下表皮瞬时转化 |
| 3.2.6 拟南芥浸花法遗传转化 |
| 3.2.7 GUS染色具体步骤 |
| 3.2.8 BrDMC1蛋白的亚细胞定位 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 白菜型油菜Br DMC1.A01 基因组织表达分析 |
| 3.3.2 Br DMC1 启动子融合GUS载体成功构建 |
| 3.3.3 BrDMC1启动子对盐胁迫具有响应 |
| 3.3.4 GUS转基因拟南芥筛选及组织染色结果 |
| 3.3.5 Br DMC1.A01 在不同胁迫处理下表达模式分析 |
| 3.3.6 BrDMC1蛋白定位在细胞核中 |
| 3.4 讨论 |
| 4 RNA干涉Br DMC1 突变体响应盐胁迫的生理指标分析 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 植物材料及培养条件 |
| 4.1.2 分子克隆所用载体及相关试剂 |
| 4.1.3 引物合成及测序 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 Br DMC1 基因RNA干扰载体构建 |
| 4.2.2 p KSE401-Br DMC1-Cas9 载体构建 |
| 4.2.3 农杆菌介导的浸花法转基因具体步骤 |
| 4.2.4 转基因植株的分子鉴定 |
| 4.2.5 Br DMC1 基因RNAi突变体在盐胁迫下生理指标的测定 |
| 4.2.6 相关基因的表达量分析 |
| 4.2.7 花粉亚历山大染色及扫描电镜观察 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 RNAi-Br DMC1 载体构建及转基因筛选 |
| 4.3.2 RNA干涉Br DMC1 降低盐胁迫下种子萌发率 |
| 4.3.3 RNA干涉Br DMC1 降低了盐胁迫下氧化应激的耐性 |
| 4.3.4 RNA干涉Br DMC1 造成的盐胁迫后萌发种子内活性氧含量升高 |
| 4.3.5 RNA干涉Br DMC1 造成盐胁迫的萌发滞后与DNA损伤有关 |
| 4.3.6 盐胁迫下BrDMC1相关基因的表达量测定 |
| 4.3.7 p KSE401-Br DMC1-Cas9 载体的构建与转基因筛选 |
| 4.3.8 敲除BrDMC1基因降低了花粉育性 |
| 4.4 讨论 |
| 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）家蚕总RNA m6A修饰工具酶表达水平与其对BmNPV抗性的关系研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 RNA m~6A修饰研究进展 |
| 1.1.1 表观遗传修饰 |
| 1.1.2 m~6A修饰研究进展 |
| 1.2 家蚕核型多角体病毒(BmNPV) |
| 1.2.1 家蚕核型多角体病毒的概念 |
| 1.2.2 家蚕核型多角体病毒的感染途径及症状 |
| 1.3 家蚕对BmNPV抗性相关研究 |
| 1.3.1 抗性家蚕品种选育与推广 |
| 1.3.2 家蚕抗BmNPV的分子机制研究 |
| 1.4 主要研究内容与意义 |
| 1.4.1 问题的提出 |
| 1.4.2 研究内容与方法 |
| 1.4.3 研究意义 |
| 第2章 BmNPV感染前后BmN细胞m~6A修饰工具酶基因表达水平的变化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 重组病毒BV-EGFP的滴度测定 |
| 2.3.2 标准曲线制作 |
| 2.3.3 目的基因表达分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 BmN细胞中METTL3 基因RNA干涉对BmNPV增殖的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 标准曲线制作 |
| 3.3.2 METTL3干涉结果 |
| 3.3.3 METTL3 干涉对VP39、GP64 表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 家蚕幼虫中肠组织m~6A修饰工具酶基因的表达特性分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 标准曲线 |
| 4.3.2 目的基因的表达 |
| 4.3.3 METTL3蛋白水平检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 家蚕幼虫中肠组织m~6A修饰工具酶基因的表达水平与品种对BmNPV抗性的关系 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 BmNPV对家蚕半数致死浓度(LC50)测定结果 |
| 5.3.2 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的METTL3 的表达水平的变化 |
| 5.3.3 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的METTL3 的蛋白水平的变化 |
| 5.3.4 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的METTL14 的表达水平的变化 |
| 5.3.5 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的Fl(2)d的表达水平的变化 |
| 5.3.6 家蚕幼虫感染BmNPV后中肠组织的YTHDC1 的表达水平的变化 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（3）家蚕全基因组编辑细胞库的构建及其应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 概述 |
| 1.2 家蚕功能基因组研究 |
| 1.2.1 家蚕研究历史 |
| 1.2.2 家蚕功能基因组研究进展 |
| 1.3 全基因组编辑技术的发展 |
| 1.3.1 基因组编辑技术的发展 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9 全基因组编辑技术 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9 全基因组编辑技术的应用 |
| 1.4 家蚕功能基因组研究的发展方向 |
| 1.4.1 应用定位克隆技术解析家蚕功能基因 |
| 1.4.2 参照近缘物种功能基因解析家蚕功能基因 |
| 1.4.3 应用全基因组编辑技术筛选家蚕功能基因 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的和意义 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 技术路线 |
| 第三章 家蚕细胞转基因敲除系统的构建 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 3.1.3 主要实验方法 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 家蚕细胞转基因敲除骨架载体p B-CRISPR的构建 |
| 3.2.2 家蚕绿色荧光蛋白表达细胞系BmE-Mi-EGFP的构建 |
| 3.2.3 家蚕细胞转基因敲除载体p B-CRISPR的编辑效率的检测 |
| 3.3 总结与展望 |
| 第四章 家蚕BmE细胞全基因组编辑文库的构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 4.1.3 主要试验方法 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 家蚕全基因组sgRNA的设计 |
| 4.2.2 家蚕全基因组编辑质粒库的构建 |
| 4.2.3 家蚕全基因组编辑细胞库的构建 |
| 4.3 总结与展望 |
| 第五章 运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 5.1.3 主要试验方法 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的筛选 |
| 5.2.2 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的染色体定位 |
| 5.2.3 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的表达水平分析 |
| 5.2.4 家蚕BmE细胞必需基因和其他生物必需基因的比较 |
| 5.2.5 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的KEGG富集分析 |
| 5.2.6 家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因的亚细胞定位 |
| 5.3 总结与展望 |
| 第六章 运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应高温或者低温胁迫的基因 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 6.1.3 主要试验方法 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的筛选 |
| 6.2.2 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的KEGG富集分析 |
| 6.2.3 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的亚细胞定位分析 |
| 6.2.4 家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因的表达水平分析 |
| 6.3 总结与展望 |
| 第七章 运用家蚕全基因组编辑细胞库筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 主要试剂及配置方法 |
| 7.1.3 主要试验方法 |
| 7.2 结果与讨论 |
| 7.2.1 家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因的筛选 |
| 7.2.2 家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因的验证 |
| 7.3 总结与展望 |
| 第八章 综合与结论 |
| 1 建立家蚕细胞转基因敲除系统。 |
| 2 建立家蚕全基因组编辑细胞库 |
| 3 筛选家蚕BmE细胞必需基因和生长抑制基因 |
| 4 筛选家蚕BmE细胞响应高温或低温胁迫的基因 |
| 5 筛选家蚕BmE细胞响应BmNPV侵染的基因 |
| 论文创新点 |
| 附件 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表文章 |
| 参研课题 |
| 会议报告 |
| 致谢 |
（4）siRNA干涉技术在黄曲霉毒素抑制中的研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 黄曲霉菌原生质体转化 |
| 1.2 DNaseI消化Total RNA中的基因组DNA |
| 1.3 逆转录合成cDNA |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 siRNA干涉技术体系在黄曲霉菌中的建立 |
| 2.2 siRNA干涉技术在黄曲霉毒素合成相关基因沉默中的应用 |
| 2.3 利用siRNA干涉技术沉默多个黄曲霉毒素合成相关基因 |
| 2.4 通过siRNA干涉技术沉默pks-nrps基因 |
| 3 讨论与结论 |
（5）小麦全蚀病菌ADP/ATP转位酶基因RNAi载体构建及龙胆酸加双氧酶基因RNAi的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 小麦全蚀病 |
| 1.1.1 小麦全蚀病简介 |
| 1.1.2 小麦全蚀病菌简介 |
| 1.1.3 小麦全蚀病发病症状及规律 |
| 1.1.4 小麦全蚀病传播及防治 |
| 1.1.5 小麦抗全蚀病的研究进展 |
| 1.1.6 小麦全蚀病菌分子生物学研究进展 |
| 1.2 RNAi技术 |
| 1.2.1 RNAi简介 |
| 1.2.2 RNAi机制及特点 |
| 1.2.3 RNAi研究进展与应用 |
| 1.3 寄主诱导的基因沉默技术 |
| 1.3.1 寄主诱导的基因沉默技术简介 |
| 1.3.2 HIGS研究机制与特点 |
| 1.3.3 HIGS研究进展及发展前景 |
| 1.4 根瘤农杆菌介导的真菌遗传转化 |
| 1.4.1 根癌农杆菌简介 |
| 1.4.2 根癌农杆菌转化机制 |
| 1.4.3 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的特点 |
| 1.5 本研究的目的意义及技术路线 |
| 1.5.1 本研究的目的意义 |
| 1.5.2 本研究的主要内容 |
| 1.5.3 本研究的技术路线 |
| 2 引言 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验所用菌种及载体 |
| 3.1.2 主要的仪器设备和试剂 |
| 3.1.3 所需试剂及培养基的配制 |
| 3.2 构建RNAi载体的方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体构建的过程 |
| 3.2.2 目的基因的作用及选择 |
| 3.2.3 构建RNAi载体所需引物 |
| 3.2.4 质粒的提取 |
| 3.2.5 质粒的酶切及纯化 |
| 3.2.6 无缝连接基因At1扩增 |
| 3.2.7 纯化方法 |
| 3.2.8 无缝连接 |
| 3.2.9 大肠杆菌转化方法 |
| 3.2.10 重组质粒的酶切及纯化 |
| 3.2.11 快速DNA连接基因At1扩增 |
| 3.2.12 快速DNA连接 |
| 3.2.13 RNAi载体的鉴定 |
| 3.3 根瘤农杆菌介导全蚀病菌遗传转化的实验方法 |
| 3.3.1 转化根瘤农杆菌 |
| 3.3.2 潮霉素B最佳浓度的筛选 |
| 3.3.3 全蚀病菌菌丝处理方式优化 |
| 3.3.4 共培养体系优化 |
| 3.3.5 遗传转化后代的筛选 |
| 3.3.6 全蚀病菌DNA的提取 |
| 3.3.7 转化子T-DNA基因鉴定 |
| 3.3.8 全蚀病菌转化子侵染小麦 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 ATP/ADP转位酶基因(At1)RNAi载体的构建 |
| 4.1.1 空载体p BHt2-CHSA-Intron的酶切电泳图 |
| 4.1.2 基因At1无缝连接鉴定 |
| 4.1.3 基因At1的RNAi载体酶切鉴定 |
| 4.1.4 龙胆酸加双氧酶基因Gdo的 RNAi载体鉴定 |
| 4.2 根瘤农杆菌介导全蚀病菌遗传转化实验的结果与分析 |
| 4.2.1 潮霉素B抑制全蚀病菌的最佳浓度 |
| 4.2.2 全蚀病菌菌丝处理方式不同对转化效率的影响 |
| 4.2.3 不同共培养体系对转化效率的影响 |
| 4.2.4 全蚀病菌候选转化子的筛选 |
| 4.2.5 全蚀病菌候选转化子数据分析 |
| 4.2.6 转化子基因检测 |
| 4.3 小麦全蚀病致病性检测 |
| 4.3.1 转化子侵染对小麦的影响 |
| 4.3.2 转化子侵染小麦结果分析 |
| 5 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（6）多溴联苯醚的微生物降解机制及产物毒性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 环境中多溴联苯醚的污染现状 |
| 1.1.1 大气中的多溴联苯醚 |
| 1.1.2 水体中的多溴联苯醚 |
| 1.1.3 土壤中的多溴联苯醚 |
| 1.1.4 室内灰尘中的多溴联苯醚 |
| 1.1.5 生物体和人体中的多溴联苯醚 |
| 1.2 多溴联苯醚的降解消除技术研究进展 |
| 1.2.1 多溴联苯醚的光降解 |
| 1.2.2 多溴联苯醚的零价铁法 |
| 1.2.3 多溴联苯醚的植物降解 |
| 1.2.4 多溴联苯醚的微生物降解 |
| 1.3 多溴联苯醚微生物降解机制研究进展 |
| 1.4 多溴联苯醚的毒性研究进展 |
| 1.5 多溴联苯醚和重金属复合污染 |
| 1.6 本课题研究意义和研究内容 |
| 1.6.1 研究目的和意义 |
| 1.6.2 研究内容 |
| 1.6.3 技术路线 |
| 第二章 铜绿假单胞菌对BDE-47的降解研究 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 菌种和培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 BDE-47及其降解产物的萃取 |
| 2.2.2 BDE-47及其降解产物的分析 |
| 2.2.3 不同菌种对BDE-47的降解效果比较 |
| 2.2.4 培养条件对BDE-47的降解效果比较 |
| 2.2.5 碳源对P.aeruginosa降解BDE-47的影响 |
| 2.2.6 表面活性剂对P.aeruginosa降解BDE-47的影响 |
| 2.2.7 菌体、胞外酶、胞内酶对BDE-47的降解 |
| 2.2.8 BDE-47降解产物分析及其在胞内外的分布 |
| 2.2.9 P.aeruginosa对BDE-47主要降解产物的降解 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 不同菌体对BDE-47的降解性能比较 |
| 2.3.2 培养条件对P.aeruginosa降解BDE-47的影响 |
| 2.3.3 碳源对P.aeruginosa降解BDE-47的影响 |
| 2.3.4 表面活性剂对P.aeruginosa降解BDE-47的影响 |
| 2.3.5 P.aeruginosa菌体、胞外酶、胞内酶对BDE-47降解的影响 |
| 2.3.6 P.aeruginosa降解BDE-47的主要产物 |
| 2.3.7 P.aeruginosa对降解产物的再降解 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 铜绿假单胞菌降解BDE-47的分子生物学机制 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 菌种和培养基 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细菌培养及RNA的提取 |
| 3.2.2 转录组测序分析 |
| 3.2.3 不同浓度的BDE-47对P.aeruginosa外排泵基因MexB表达的影响 |
| 3.2.4 构建外排泵基因MexB抑制的体系 |
| 3.2.5 不同MexB表达体系中BDE-47对P.aeruginosa生长和活性的影响 |
| 3.2.6 不同MexB表达体系对P.aeruginosa降解BDE-47的影响 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 RNA-seq测序质量分析 |
| 3.3.2 RNA-seq结果分析 |
| 3.3.3 BDE-47作用下物质运输相关的差异表达基因 |
| 3.3.4 BDE-47作用下代谢相关的差异表达基因 |
| 3.3.5 BDE-47作用下细胞应激响应相关的差异表达基因 |
| 3.3.6 不同体系下外排泵基因MexB表达的影响 |
| 3.3.7 不同体系下BDE-47对P.aeruginosa生长和活性的影响 |
| 3.3.8 不同MexB表达体系P.aeruginosa对BDE-47的降解 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 BDE-47及其降解产物的毒性研究 |
| 4.1 实验材料与仪器 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 HepG2细胞的培养和保存 |
| 4.2.2 染毒处理 |
| 4.2.3 BDE-47及降解产物对细胞存活率的影响 |
| 4.2.4 BDE-47及降解产物对HepG2细胞ROS生成的影响 |
| 4.2.5 BDE-47及降解产物对SOD酶和GSH活性的影响 |
| 4.2.6 BDE-47及降解产物对细胞周期的影响 |
| 4.2.7 BDE-47及降解产物诱导的细胞DNA损伤 |
| 4.2.8 BDE-47及降解产物诱导的细胞凋亡 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 BDE-47及降解产物对HepG2细胞存活率的影响 |
| 4.3.2 低剂量预处理作用对暴露在高剂量污染物中HepG2细胞活性的影响 |
| 4.3.3 BDE-47及降解产物对HepG2细胞的氧化胁迫 |
| 4.3.4 BDE-47及降解产物对HepG2细胞周期的影响 |
| 4.3.5 BDE-47及降解产物对HepG2细胞基因损伤的影响 |
| 4.3.6 BDE-47及降解产物对HepG2细胞凋亡的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 铜绿假单胞菌对BDE-47/Cr(VI)降解转化的研究 |
| 5.1 实验材料与仪器 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验仪器 |
| 5.1.3 菌种和培养基 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 污染物的萃取 |
| 5.2.2 污染物的检测 |
| 5.2.3 BDE-47对P.aeruginosa去除Cr(VI)的影响 |
| 5.2.4 Cr(VI)对P.aeruginosa降解BDE-47的影响 |
| 5.2.5 BDE-47和Cr(VI)对P.aeruginosa产表面活性剂的影响 |
| 5.2.6 鼠李糖脂对P.aeruginosa降解BDE-47和去除Cr(VI)的影响 |
| 5.2.7 BDE-47和Cr(VI)对P.aeruginosa细胞特性的影响 |
| 5.2.8 BDE-47和Cr(VI)对P.aeruginosa细胞产蛋白和酶活性的影响 |
| 5.2.9 BDE-47和Cr(VI)对P.aeruginosa细胞ATP酶活性及离子代谢的影响 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 BDE-47共存条件下P.aeruginosa对Cr(VI)的去除 |
| 5.3.2 Cr(VI)共存条件下P.aeruginosa对BDE-47的降解 |
| 5.3.3 鼠李糖脂与P.aeruginosa降解转化BDE-47和Cr(VI)的相互作用 |
| 5.3.4 BDE-47和Cr(VI)对P.aeruginosa细胞特性的影响 |
| 5.3.5 BDE-47和Cr(VI)对P.aeruginosa细胞产蛋白和酶活性的影响 |
| 5.3.6 BDE-47和Cr(VI)对P.aeruginosa细胞ATP酶活性及离子代谢的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 本论文的创新之处 |
| 对未来的工作建议 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（7）烟草（Nicotiana tabacum L.）降烟碱代谢调控的分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 Abstract 第一章 文献综述 |
| 1 烟草起源和种类 |
| 1.1 烟草起源 |
| 1.2 烟草种类 |
| 2 烟草降烟碱生物合成研究进展 |
| 2.1 烟碱生物合成研究 |
| 2.2 降烟碱合成代谢研究 |
| 3 本课题研究的科学问题及主要研究内容 第二章 不同类型烟草种质烟碱和降烟碱生物合成研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同类型烟草种质烟碱及其代谢产物差异分析 |
| 2.2 ADC和ODC基因表达对烟碱合成的影响 |
| 2.3 PMT和QPT基因表达对烟碱合成的影响 |
| 2.4 A622基因表达对烟碱合成的影响 |
| 2.5 降烟碱合成代谢途径相关基因分析 |
| 2.6 亚硝酸还原酶基因对亚硝基降烟碱合成影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同类型烟草种质烟碱和降烟碱含量与基因表达存在差异 |
| 3.2 烟碱和降烟碱间转化 第三章 PMT及QPT对烟碱合成代谢的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 菌株及载体 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 培养基 |
| 1.4 仪器 |
| 1.5 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 植物表达载体构建及对烟草遗传转化 |
| 2.2 PMT和QPT基因表达对烟碱和降烟碱合成的影响 |
| 2.3 PMT基因表达对烟碱生物合成基因表达的影响 |
| 2.4 PMT基因表达对降烟碱生物合成基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 PMT基因表达对烟碱合成有调控作用 |
| 3.2 降烟碱生物合成受到烟碱合成的影响 第四章 CYP82E4v1对降烟碱生物合成的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 K326 CYP82E4v1基因克隆及序列分析 |
| 2.2 植物表达载体构建及对烟草遗传转化 |
| 2.3 CYP82E4v1基因对烟碱和降烟碱代谢的影响 |
| 2.4 “Gene-deletor”系统对外源基因清除分析 |
| 2.5 CRISPR/Cas9基因编辑技术定向突变CYP82E4v1基因初步研究 |
| 3 讨论 |
| 3.1 烟草品种K326 CYP82E4v1基因分析 |
| 3.2 CYP82E4v1基因表达与烟碱及降烟碱代谢关系 |
| 3.3 “Gene-deletor”技术在烟草育种上的应用 |
| 3.4 基因编辑技术定向突变烟草的应用 第五章 烟草烟碱降烟碱生物合成部位研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 烟草不同部位烟碱和降烟碱含量差异分析 |
| 2.2 烟草不同部位烟碱及降烟碱代谢基因表达差异分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 烟碱和降烟碱合成部位 |
| 3.2 烟碱和降烟碱生物合成基因表达的关系 第六章 CYP82E4v1基因干涉烟草植株对烟蚜抗性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 T1代烟草植株鉴定及CYP82E4v1表达分析 |
| 2.2 干涉CYP82E4v1基因提高烟碱含量 |
| 2.3 不同植物激素对干涉植株烟碱含量影响 |
| 2.4 干涉CYP82E4v1提高植株对烟蚜的抗性 |
| 2.5 干涉CYP82E4v1对植株AOEs及PAL活性影响 |
| 2.6 CYP82E4v1干涉植株中SA/JA信号通路中基因表达分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 干涉CYP82E4v1基因减少外源激素对烟碱含量的影响 |
| 3.2 烟碱含量提高烟草植株对蚜虫抗性 |
| 3.3 CYP82E4v1基因干涉植株抗蚜虫与JA/SA信号通路的关系 第七章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 参考文献 附录一 附录二 致谢 |
（8）鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料与试剂 |
| 1.2 si RNA与sh RNA的合成 |
| 1.2.1 si RNAs的设计与合成 |
| 1.2.2 sh RNAs的设计与合成 |
| 1.3 鸡PGCs的分离、培养与鉴定 |
| 1.3.1饲养层的制备 |
| 1.3.2鸡PGCs的分离、培养 |
| 1.4 细胞转染 |
| 1.4.1 siR NAs的转染 |
| 1.4.2 Piwi-shR NA干涉序列的转染 |
| 1.5 CEF与PGCs目的片段常规PCR的扩增 |
| 1.6 Real-Time q PCR检测 |
| 1.7 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 sh RNAs质粒的PCR检测 |
| 2.2 PGCs的分离和鉴定 |
| 2.2.1 PAS糖原染色 |
| 2.2.2 AKP活性检测 |
| 2.2.3 TERT抗体鉴定 |
| 2.2.4 SSEA-1抗体鉴定 |
| 2.3 CEF与PGCs目的基因扩增 |
| 2.4 si RNA转染效率的检测 |
| 2.5 sh RNA转染效率的检测 |
| 2.6 si RNA靶向抑制Piwi的表达 |
| 2.7 sh RNA抑制Piwi的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（9）Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 CRISPR-Cas免疫系统的发现及其功能 |
| 1.2 CRISPR-Cas系统多样性及其分类 |
| 1.3 CRISPR-Cas系统介导的病毒防御原理 |
| 1.3.1 新spacer的获取 |
| 1.3.2 CRISPR RNA加工 |
| 1.3.3 Ⅰ型Cascade介导依赖PAM识别的DNA干涉 |
| 1.3.4 Ⅱ型和Ⅲ-A亚型CRISPR-Cas系统介导的DNA干涉简介 |
| 1.3.5 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导RNA干涉 |
| 1.4 S islandicus Rey15A中CRISPR-Cas干涉系统 |
| 1.5 本研究目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 分子生物学实验材料 |
| 2.1.3 Sulfolous细胞培养 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Sulfolobus感受态制备及电转化 |
| 2.2.2 cas敲除质粒及cas缺失株的构建 |
| 2.2.3 cas互补质粒,DNA、RNA干涉质粒构建 |
| 2.2.4 Sulfolobus总RNA提取及Northern分析 |
| 2.2.5 cDNA合成,qPCR及RACE |
| 2.2.6 β-糖苷酶试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 I-A亚型系统中Cas蛋白在pre-crRNA加工及PAM依赖型DNA干涉中功能的遗传学鉴定 |
| 3.1.1 cas缺失株的构建 |
| 3.1.2 对Cascis,Cmr-α和Cmr-β是否参与pre-crRNA加工和DNA干涉的确定 |
| 3.1.3 S islandicus Rey15A I-A亚型CRISPR-Cas系统中Cas6,Cas7,Cas5和Csa5蛋白功能分析 |
| 3.1.4 Cas3(解旋酶-核酸酶)在pre-crRNA加工及DNA干涉过程中的功能分析 |
| 3.2 Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的RNA干涉的体内分析 |
| 3.2.1 S.islandicus内源CRISPR系统介导的RNA干涉活性研究 |
| 3.2.2 pAC质粒表达的crRNA对S.islandicus Rey15A中靶基因表达高效抑制作用的鉴定 |
| 3.2.3 S1 crRNA 3’端一个3nt序列对Cmr介导的体内RNA干涉重要性的确定 |
| 3.2.4 S.islandicus中Ⅲ-B亚型Cmr系统介导的基因沉默分析 |
| 3.2.5 S.islandicus Cmr系统执行的RNA剪切特征的分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于S.islandicus I-A亚型Cascade的组装 |
| 4.2 关于S.islandicus CRISPR-Cmr系统介导的干涉复合体对靶RNA的识别 |
| 4.3 关于6亚基Cmr复合体组装样式和靶RNA切割特征 |
| 4.4 Cmr-α与Cmr-β能否相互转化? |
| 4.5 CRISPR-Cas系统的应用前景 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录1-本研究所用引物 |
| 附录2-Sulfobus培养基基础盐及维他命溶液配方 |
| 博士期间研究成果 |
| 致谢 |
（10）RNA干扰技术及其应用研究（论文提纲范文）
| 1 RNAi的发现 |
| 2 RNA干涉技术的研究及应用 |
| 2.1 功能基因组的研究 |
| 2.2 RNA干涉在疾病治疗方面的应用 |
| 2.3 RNA干涉技术在药物研究中的应用 |
| 2.4 RNA干扰技术在农业生产中的应用 |
四、RNA干涉技术及其应用（论文参考文献）
- [1]白菜型油菜BrDMC1响应盐胁迫的生理及分子机制研究[D]. 王帅鹏. 郑州大学, 2020(02)
- [2]家蚕总RNA m6A修饰工具酶表达水平与其对BmNPV抗性的关系研究[D]. 薛鹏. 江苏科技大学, 2020
- [3]家蚕全基因组编辑细胞库的构建及其应用[D]. 常珈菘. 西南大学, 2020(12)
- [4]siRNA干涉技术在黄曲霉毒素抑制中的研究[J]. 焦健,杜鹏. 中国农学通报, 2020(05)
- [5]小麦全蚀病菌ADP/ATP转位酶基因RNAi载体构建及龙胆酸加双氧酶基因RNAi的研究[D]. 麦艳娜. 河南农业大学, 2018(02)
- [6]多溴联苯醚的微生物降解机制及产物毒性研究[D]. 唐少宇. 华南理工大学, 2018(12)
- [7]烟草（Nicotiana tabacum L.）降烟碱代谢调控的分子机制研究[D]. 赵丹. 贵州大学, 2016(05)
- [8]鸡生殖干细胞中Piwi基因的干涉效率[J]. 李志腾,常国斌,徐璐,马腾,陈静,陈蓉,王洪志,刘璐,徐琪,陈国宏. 中国农业科学, 2016(03)
- [9]Sulfolobus islandicus CRISPR-Cas病毒防御功能的遗传学分析[D]. 彭文舫. 华中农业大学, 2015(11)
- [10]RNA干扰技术及其应用研究[J]. 陈若飞. 畜牧与饲料科学, 2009(05)