一、PCNA与P53蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及意义（论文文献综述）
胡博[1]（2021）在《长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究》文中认为背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种原发性肝脏恶性肿瘤,在世界范围内发病率高、治疗效果欠佳。随着靶向治疗药物如索拉非尼、伦伐替尼,以及免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂的出现,其预后得到一定的改善,但5年生存率仍旧不高。竞争性内源性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）揭示了RNA间相互作用的新机制,即以长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）为主的非编码RNA通过竞争性共享微小RNA（microRNA,miRNA）来调节mRNA（messenger RNA,信使RNA）的表达,这种调节机制在癌症的发病机理中扮演了重要的角色。但是,ceRNA在HCC中的功能作用及调节机制仍未被完全解释,新的ceRNA调控轴亟待探究。lncRNA CYTOR是一种已被证实在多种肿瘤中发挥促进细胞增殖、迁移等作用的非编码基因,并可作为多种miRNA的内源性海绵。然而,lncRNACYTOR作为ceRNA在HCC发生、发展中的作用及调控网络目前仍不十分清楚。因此,本研究以lncRNACYTOR为起点,探索ceRNA调节机制在HCC中的应用。材料与方法:通过检索癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）,获得人类HCC的lncRNA、mRNA和miRNA数据集表达数据和相应临床信息。下载基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database,GEO）数据库中GSE62232和GSE84402的HCC相关RNA数据用于后续验证。借助在线数据分析工具,分析lncRNA CYTOR在多种肿瘤类型及HCC相关数据集中的表达情况。借助R语言分析lncRNA CYTOR在TCGA数据库中HCC肿瘤组织及癌旁正常肝组织中的差异表达情况,以及其表达水平与TCGA数据库HCC患者总生存期（overall survival,OS）之间的关系。分析lncRNA CYTOR与常用临床病理参数,如性别、年龄、肿瘤分级、临床分期和T、N、M分期之间的关联性,并进一步整合这些参数,通过单因素及多因素Cox回归分析探究lncRNA CYTOR独立预测患者预后的能力。之后,识别TCGA数据库HCC样品中差异表达的miRNA,同时使用ENCORI软件（starbase3.0）预测目标lncRNA的靶向的miRNA,选择差异分析中表达下调的miRNA与预测的miRNA做交集后得出候选miRNA。同理,基于TCGA数据库分析HCC样品中差异表达的mRNA,并基于ENCORI软件使用6个数据库（PITA、miRNAmap、DIANA-microT、miRanda、PicTar 和 TargetScan）预测候选 miRNA 靶向的mRNA,选择差异分析中表达上调的mRNA与预测的mRNA做交集后得出候选的mRNA。使用基因集富分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）来识别与所筛选出的mRNA高表达相关的基因集和通路途径,探索其潜在的功能。结果:lncRNACYTOR在多种癌症的肿瘤组织（如结肠癌、肾透明细胞癌、膀胱尿路上皮癌等）及多个HCC相关数据集中（如GSE54236、GSE64041、GSE36376等）相较于癌旁组织表达上调。在TCGA数据库中,与癌旁正常组织相比,HCC组织中的lncRNACYTOR表达水平显着增高（P<0.001）;且高表达患者组的OS较低表达患者组显着缩短（P<0.001）。临床病理参数关联性分析显示,lncRNACYTOR的表达水平与病理分级（Grade）显着相关,且G2与G1（P<0.01）、G3与G2（P<0.05）、G3与G1（P<0.001）和G4与G1（P<0.05）之间存在显着性差异;该基因在临床Ⅱ期（StageⅡ）的表达水平较临床Ⅰ期（StageⅠ）显着上调（P<0.001）,在T2期及T4期的表达水平较T1期显着上调（P<0.001;P<0.05）。独立预后分析表明lncRNA可独立于上述临床参数来预测HCC患者的预后（P<0.05）。ENCORI软件分析得出miR-125b-5p可作为lncRNA CYTOR的靶向miRNA,后续6个数据库综合分析得出KIAA1522及PODXL可作为miR-125b-5p的候选靶向mRNA。对二者进行差异分析、生存分析及与miR-125b-5p的相关分析后,选择KIAA1522作为目标靶向mRNA。相较于癌旁组织,KIAA1522在GSE62232和GSE84402的HCC组织中表达显着上调（P<0.001）。GSEA富集分析结果表明,cell cycle信号通路、adherens junction信号通路、Notch信号通路、mTOR信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、VEGF信号通路、apoptosis信号通路和tight junction信号通路相关的基因集在高KIAA1522表达的表型中显着富集。结论:探究lncRNA的表达情况、生物学功能,构建新的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴是研究HCC发病机制的有效手段。lncRNA在HCC组织中表达水平显着上调,与多种临床病理参数相关,且可作为HCC患者潜在的预后生物标志物。此外,lncRNA CYTOR可通过靶向miR-125b-5p进而调节KIAA1522的表达参与HCC的发生发展。背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种由多种病因引起肿瘤,目前仍是人类最常见、最致命的恶性肿瘤之一。因此,寻找新的、临床上有效的HCC诊断及预后生物标志物至关重要。本实验的主要目的是基于第一部分生物信息学分析的结果,探索长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）CYTOR、微小RNA（microRNA,miRNA）miR-125b-5p 以及蛋白编码信使 RNA（messenger RNA,mRNA）KIAA1522的靶向调控作用及该调控轴在HCC发生、发展中的作用。材料与方法:通过脂质体将目的基因相关载体转染至正常肝细胞（HHL-5）及几种HCC细胞（SK-Hep-1、Hep3b和Huh-7）后,采用实时荧光定量聚合酶链式反应（real time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）检测 HCC 细胞中 lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522的表达,并筛选实验细胞。免疫组化检测KIAA1522在HCC组织及癌旁正常组织中的表达情况。采用双荧光素酶报告基因检测试验证实lncRNA CYTOR、miR-125b-5p和KIAA1522间的调控关系。之后,利用CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8,CCK-8）检测不同转染条件下HCC细胞的增殖情况,采用流式细胞仪分析转染后HCC细胞周期的变化,使用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidy l transferase mediated nick end labeling,TUNEL）观察转染后 HCC 细胞的凋亡情况;并通过蛋白免疫印迹实验（western blot,WB）分析检测细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡等相关蛋白的表达。结果:转染后,相较于HHL-5细胞,Hep3b细胞中上述基因的表达均是最为显着的,故选择Hep3b细胞进行下一步实验。双荧光素酶报告基因检测实验的结果显示miR-125b-5p mimic+CYTOR-wt 共转染组和miR-125b-5p mimic+KIAA1522-wt 共转染组Hep3b细胞的荧光素酶活性显着降低;lncRNA CYTOR可直接作用于miR-125b-5p,而miR-125b-5p可直接靶向KIAA1522。CCK-8实验结合WB检测结果显示敲低lncRNACYTOR抑制了 HCC细胞的增殖,并下调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则促进了细胞的增殖并上调了 Ki-67和PCNA的蛋白表达。流式细胞仪分析结合WB检测结果显示敲低lncRNA CYTOR 降低了 S期及G2/M期比值,下调了 cyclin D1及cyclin E等蛋白的表达而上调了 p21表达;抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过度表达则升高了 S期及G2/M期比值,并上调了 cyclin D1等蛋白的表达并下调了 p21表达。TUNEL细胞凋亡检测结合WB检测提示敲低lncRNA CYTOR可促进Hep3b细胞凋亡,下调Bcl-2的表达同时上调 Bax 的表达及 cleaved caspase3/caspase 3、cleaved caspase9/caspase 9;而抑制miR-125b-5p或KIAA1522的过表达则抑制Hep3b细胞凋亡,上调Bcl-2的表达并下调 Bax 的表达及 cleaved caspase 3/caspase 3、cleaved caspase 9/caspase 9。结论:综上所述,HCC中过表达的lncRNA CYTOR可通过靶向抑制miR-125b-5p进而上调KIAA1522的表达水平,促进HCC细胞增殖、影响细胞周期并抑制细胞凋亡。本研究为肝细胞癌的发生机制注入了新的见解。
徐永政[2]（2020）在《KIAA1522在原发性肝细胞癌中的表达及其临床意义》文中进行了进一步梳理目的:肝细胞癌是一种预后较差的恶性肿瘤,目前其分子机制尚不清楚。KIAA1522在不同类型肿瘤组织中表达上调,但在肝细胞癌中的表达尚未见报道。本文章是为了研究KIAA1522基因在原发性肝细胞癌及癌旁组织中的表达情况,并进一步研究KIAA1522基因表达与原发性肝细胞癌患者预后的关系,最终为原发性肝细胞癌早期诊断、有效治疗和预后评估提供依据。方法:（一）应用生物信息分析技术分析KIAA1522基因在Oncomine、Oncolnc等数据库中的表达以及与临床预后的关系。（二）收集本院肝胆外科2013年原发性肝细胞癌手术病例79例,获得其相关的临床资料,同时从病理科获得79例病理标本,分别提取79例肝细胞癌组织及癌旁组织标本中的RNA,并通过实时定量荧光PCR技术检测KIAA1522基因在肝细胞癌组织和癌旁组织的表达水平。（三）应用组织芯片-免疫组织化学染色技术,检测79例原发性肝细胞癌组织及其配对癌旁组织中KIAA1522蛋白的表达情况,并对其阳性表达率与原发性肝细胞癌患者预后的关系进行统计学分析。（四）运用统计学的方法分析肝细胞癌中KIAA1522的表达与临床病理指标之间的关系。（五）单因素和多因素分析预后（COX风险回归模型）,寻找到与肝细胞癌预后相关的独立危险因子。结果:（一）在Oncomine数据库中KIAA1522在肝细胞癌和癌旁肝组织中的表达量明显有差异（P<0.001）,在Oncolnc数据库中高表达的KIAA1522肝细胞癌患者术后生存期显着缩短（p<0.05）。（二）实时定量荧光PCR结果显示KIAA1522在肝细胞癌组织的表达明显高于癌旁组织（P<0.05）。（三）组织芯片-免疫组织化学染色技术显示KIAA1522蛋白在癌旁组织中阳性表达率为15.2%（12/79）,而在原发性肝细胞癌组织中KIAA1522蛋白阳性表达率为89.8%（71/79）,两者差异具有统计学意义（P<0.05）。Kaplan-Meier生存分析结果显示,KIAA1522高表达与原发性肝细胞癌患者术后3年总体生存时间缩短显着正相关（P<0.001,Log-rank检验）,同时本研究对KIAA1522在肝细胞癌中的表达水平与术后复发时间进行比较,结果显示KIAA1522表达水平与患者术后3年的无瘤生存时间无关（P>0.05）。（四）KIAA1522表达与临床病理指标的关系研究结果显示:肝细胞癌组织中KIAA1522的表达水平与患者年龄、性别、HBV感染、肝硬化、AFP水平、Child-Pugh分级、肿瘤数目、大小、分化程度、脉管癌栓、肝被膜侵犯、TNM临床分期等均无关。（五）多因素Cox回归分析结果表明,肿瘤大小、TNM分期、KIAA1522表达水平是影响肝细胞肝癌患者术后总体生存时间的独立危险因素（P<0.05）。结论:KIAA1522在肝细胞癌组织中表达较癌旁组织明显增高,并且KIAA1522高表达组的肝细胞肝癌患者术后总体生存时间缩短,提示KIAA1522表达与肝细胞癌患者预后密切相关。同时KIAA1522表达水平、TNM分期、肿瘤大小是影响肝细胞癌患者预后的独立危险因素。这些均提示KIAA1522可能作为预测原发性肝细胞癌患者预后潜在分子标志。
栗佳琦[3]（2019）在《S100A1与PCNA在卵巢高级别浆液性腺癌中的表达及相关性研究》文中指出研究目的:卵巢癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,据世界卫生组织（world health organization,WHO）估计,每年新诊断的卵巢癌病例约225,500例,新增死亡病例数约140,200名。尽管近年来恶性肿瘤的诊断和治疗逐渐改善,但卵巢癌的死亡率仍居妇科恶性肿瘤首位。卵巢高级别浆液性腺癌（high-grade serous ovarian adenocarcinoma,HGSC）是最常见、最致命的卵巢恶性肿瘤病理学类型,约占卵巢恶性肿瘤的60%以上,占所有卵巢恶性肿瘤死亡的70%以上。长期以来,HGSC一直被认为起源于卵巢表面上皮细胞,但近年的研究结果表明,输卵管上皮细胞可能是HGSC的主要潜在来源。因为卵巢癌缺乏典型症状和早期诊断方法,寻找卵巢癌早期诊断和治疗的新靶点迫在眉睫。S100蛋白（S100 calcium binding protein）家族是一类小型酸性钙离子结合蛋白,特征是具有EF手型结构。S100蛋白家族多个成员的表达失调是人类癌症的一个共同特征。S100蛋白既可在细胞内参与调控细胞增殖、分化、细胞分裂,也可在细胞外与多种受体结合发挥细胞因子的作用。S100A1蛋白是S100蛋白家族中的成员,在恶性肿瘤发生等病理条件下S100A1蛋白呈现异常表达,与恶性肿瘤的发生发展密切相关。增殖细胞核抗原（proliferating-cell nuclear antigen,PCNA）是一种高度保守的酸性蛋白,其在DNA复制、DNA修复、细胞周期调控和细胞增殖中发挥着重要的作用,在恶性肿瘤组织中,高水平的PCNA可以作为识别侵袭性肿瘤的生物标志物。鉴于S100A1与PCNA在恶性肿瘤中的作用,我们推测这两种蛋白可能参与了恶性肿瘤的发生发展。本研究以HGSC为疾病模型,旨在通过检测S100A1及PCNA在HGSC中的表达水平,研究二者与HGSC临床病理参数的关系及二者的相关性,探讨二者作为HGSC早期诊断和治疗靶点的可能性。研究方法:1.应用免疫组织化学的方法,分别检测HGSC组织（69例）和正常输卵管上皮组织（22例）中S100A1与PCNA的表达水平。2.分析S100A1和PCNA与HGSC患者的手术病理分期、年龄、腹水量、残余肿瘤大小、淋巴结转移及大网膜转移等临床病理指标之间的关系,并探讨二者表达的相关性。结果:1.与正常输卵管上皮组织相比,S100A1和PCNA在HGSC中的表达明显上调（P<0.001）;2.S100A1的高表达与HGSC患者的国际妇产科联盟（Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO）分期、年龄、腹水量、残余肿瘤大小、淋巴结转移、大网膜转移存在相关性（P<0.05）;3.PCNA的高表达与HGSC患者的FIGO分期、残余肿瘤大小、淋巴结转移存在相关性（P<0.05）,与年龄、腹水量及大网膜转移无相关性（P>0.05）;4.S100A1与PCNA在HGSC中的表达呈正相关性（r=0.43,P<0.01）。结论:S100A1与PCNA在HGSC中明显表达上调,与肿瘤病理学特征具有一定相关性,且二者的高表达呈正相关。说明S100A1与PCNA可能通过一定相互作用,从而促进HGSC的发生、发展及转移。
余廷东[4]（2019）在《黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响及TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组学研究》文中研究表明研究内容:本研究共分为四部分:1.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702生物学行为的影响研究;2.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录测序研究及差异表达分析;3.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录组关联分析;4.黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响与TP53突变的原发性肝细胞癌的转录组联合分析及验证目的:研究黄曲霉毒素B1（AFB1）在肝微粒体代谢后的次级代谢产物对肝细胞株HL-7702的影响材料和方法:AFB1+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体（1.5mg/mL最终浓度）与PBS混合,放入37℃、5%CO2恒温培养箱中孵育30分钟,获得AFB1在肝微粒体代谢后的次级代谢产物混合液。将上述混合液干预人肝细胞株HL-7702,培养箱中孵育30分钟,PBS清洗三遍后加入含10%胎牛血清的DMEM完全培养液继续培养。用MTT法检测24小时至96小时不同浓度AFB1对细胞株HL-7702的生长活性的影响。用流式细胞仪检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株周期和凋亡情况。酶联免疫法检测AFB1干预后24小时的HL-7702细胞株8羟基脱氧鸟苷（8-OHdG）变化。Sanger法对AFB1干预后96小时的HL-7702细胞株进行TP53 R249S突变检测。数据统计和计算采用SPSS 22.0软件包,作图使用GraphPad Prism 6.0软件。符合正态分布的计量资料的描述使用均数±标准差进行描述。用t检验对正态分布的计量资料分组之间进行比较。P<0.05为统计学差异达到显着性。结果:1.MTT结果显示:HL-7702细胞在AFB1处理后24小时和48小时,实验组（AFB1浓度为:0.001μM,0.005μM.0.025μM,0.125μM,0.625μM,1.25μM 和 2.5μM）、阳性对照组及空白对照组之间细胞增殖活性无显着性差异,于AFB1处理后72小时至96小时,各组细胞增殖活性出现显着差异,不同浓度的AFB1处理的HL-7702细胞增殖活性均有不同程度降低,AFB1浓度越大,细胞增殖活性越低。细胞培养至96小时,正常细胞组、对照组和AFB1浓度为0.00lμM组间细胞增殖活性差异统计学无显着性（P>0.05）,其余各组之间细胞增殖活性差异有显着性（P<0.05）。2.流式细胞技术检测浓度为2μM和0.2μM AFB1干预的HL-7702细胞G1-G0期或G2-M期比例与浓度为0.02μM组比较均有显着差异（P<0.05）。而浓度为0.02μM干预组与肝微粒体对照组和空白对照组比较,无显着差异。3.浓度为2μM和0.2μM AFB1干预的HL-7702细胞8-OHdG含量较浓度为0.02μM干预组均显着增加（P<0.001）,0.02μM干预组与肝微粒体对照组和空白对照组无显着差异。4.浓度为2μM的AFB1在肝微粒体代谢后产物干预HL-7702细胞能诱发细TP53 R249S第三位碱基G突变成T。结论:AFB1在肝微粒体代谢后的产物抑制人正常肝细胞株HL-7702生长活性并导致G2/M细胞周期停滞,并呈浓度相关性;但AFB1在2μM及以下浓度短期干预未引起HL-7702细胞早期凋亡。AFB1在肝微粒体代谢后产物干预HL-7702细胞能诱发细TP53 R249S第三位碱基G突变成T目的:用全转录组测序技术检测AFB1对肝细胞株HL-7702影响的全转录组变化情况,并进行显着差异表达的转录组进行分析。材料和方法:实验组用AFB1（0.2μM）+NADPH（2mM最终浓度）+肝微粒体（1.5mg/mL最终浓度）,对照组用肝微粒体+NADPH,放入恒温培养箱中孵育30分钟,孵育后混合液干预HL-7702细胞30分钟,PBS清洗三遍,然后加入完全培养液继续培养48小时。胰酶消化,收集细胞,标注标签,液氮速冻,干冰运输至检测公司进行全转录组测序和测序数据分析。结果:通过全转录组测序,发现AFB1影响肝细胞株HL-7702以下转录组显着差异表达:1.1027基因mRNA显着差异表达,其中上调432个,下调595个,GO富集分析显示,AFB1引起mRNA显着差异表达的基因主要参与了调控细胞周期、增殖、凋亡、粘附、代谢、细胞化学刺激反应、DNA损伤修复和血管生成等生物学进程。KEGG通路分析提示AFB1可能影响TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK信号通路等。2.显着差异表达lncRNA共29个,其中上调15个,下调14个。3.显着差异表达的共miRNA9个,其中上调3个,下调6个4.显着差异表达的circRNA共72个,其中上调35个,下调37个结论:AFB1显着影响肝细胞株HL-7702的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA的表达,对其显着差异表达的基因进行富集分析显示:差异基因参与了细胞周期、增殖、凋亡、粘附和DNA损伤修复等生物学进程。并可能参与调控TNF信号通路、TGF-β、染色体重组、P53信号通路、NF-κB信号通路、细胞周期、粘附和AMPK等信号通路。目的:在转录组水平探索AFB1对肝细胞株HL-7702影响的各转录组变化之间的关联性及其可能的相互调控机制。材料和方法:分析材料来源于论文第二部分全转录组测序数据。使用Novofinder（诺禾致源）、miRanda-3.3a、PITA、RNAhybrid、psRobot、GOSeq-topGO:Release 2.12、KOBAS:version 2.0、Cytoscape 等软件对显着差异表达的全转录组数据进行关联分析,并构建ceRNA调控网络。结果:1.AFB1影响细胞株HL-7702显着差异表达的29个lncRNA和mRNA显着差异表达的757个基因之间有共存或共表达的关系。其中lncRNAs上调,伴随mRNA上调的靶基因有234个;lncRNAs下调,伴随mRNA下调的靶基因有439个。功能富集分析提示这些差异基因和细胞周期的调节、分化、细胞代谢、DNA重组及损伤修复有关,并和P53信号通路、癌症相关信号通路相关。2.AFB可能影响HL-7702细胞以下lncRNA与miRNA之间的调控:CDKN2B-AS1 与 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-455-3p,CTD-3014M21.1 与hsa-miR-41 1-5p 和 hsa-miR-3591-3p,LINC00162 与 hsa-miR-3591-3p 和hsa-miR-494-3p,PP7080 与 hsa-miR-122-5p 和 hsa-miR-3690,PSMA3-AS1与 hsa-miR-455-3p 和 hsa-miR-41 1-5p,RP11-658F2.8 和 hsa-miR-31-5p,SBF2-AS1 与 hsa-miR-41 1-5p,SCARNA9 与 hsa-miR-379-5p。3.本研究发现9个显着差异表达的miRNA（hsa-miR-455-3p、hsa-miR-41 1-5p、hsa-miR-31-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-379-5p、hsa-miR-494-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）共调控534个mRNA显着差异表达的靶基因。基因富集分析提示这些候选靶基因参与调控细胞分子功能、细胞代谢与发展进程以及蛋白结合的调控,并参与调控细胞周期、PI3K-Akt信号通路、P53信号通路、AMPK信号通路、NF-kB信号通路等。4.AFB1可能影响HL-7702细胞以下circRNA与基因之间的调控:hsacirc0078538-EZR、hsacirc0017348-ZNF124、novelcirc0005089-ZNF124、novelcirc0002289-CEP 128、novelcirc0000551-BIRC2)5.对全转录组差异表达数据进行ceRNA网络分析,共构建出以6个miRNA（上调:hsa-miR-455-3p、hsa-miR-411-5p、hsa-miR-31-5p;下调:hsa-miR-122-5p、hsa-miR-3690、hsa-miR-3591-3p）为核心的lncRNA-miRNA-gene 调控网络。结论:全转录组关联分析提示AFB1影响HL-7702细胞的lncRNA,miRNA,circRNA和mRNA之间存在相互调节关系。用显着差异表达的miRNA（hsa-miR-455-3p,hsa-miR-41 1-5p,hsa-miR-3 1-5p;hsa-miR-122-5p,hsa-miR-3690,hsa-miR-3591-3p）构建出六个 lncRNA-miRNA-基因调控网络。目的:利用论文第二部分全转录组差异表达数据和TCGA数据库TP53 R249S突变与不突变的HCC显着差异的表达谱进行联合分析,挖掘AFB1与TP53 R249S突变HCC具有共同作用的分子标志物。研究它们在HCC中TP53 R249S突变的作用,探索AFB1在其相关性HCC的发生及疾病进展的机制。材料和方法:从TCGA数据库获取HCC的表达谱（mRNA、lncRNA和miRNA）、临床病理及预后资料,以TP53 R249S突变与否进行分组,获取显着差异的表达谱信息,然后与论文第二部分差异表达的全转录测序数据进行联合分析,取交集获得候选差异表达谱信息。并在本中心已完成TP53 R249S突变测序的HCC样本进行验证,分析其与临床病理及预后之间的关系。利用GO和KEGG进行分子生物学功能及相关通路机制预测。TCGA原发性肝癌表达谱数据表达差异分析采用EdgeR软件包处理。候选表达谱差异基因癌和癌旁组织统计学差异分析采用配对样本t检验,其次,基因在TP53 R249S突变和非突变肿瘤和癌旁组织样本的相对表达量统计学差异分析采用独立样本t检验。比较突变组与非突变组、候选表达谱基因高表达和低表达组两组间各项临床因素的分布差异用卡方检验。各临床因素与临床预后的分析采用Kaplan-Meier生存曲线、单因素Cox风险模型。各组间曲线统计学差异比较采用Log Rank检验。各个分组风险比（Hazard Ratio,HR）与 95%置信区间（Confidence Interval,CI）评估 TP53 R249S突变状态以及基因表达量高低与临床预后的相关性。统计学分析均采用SPSS 22.0,P<0.05被认为差异达到统计学显着性。统计作图采用GraphPad Prism 6.0软件绘制。结果:1.AFB1干预后HL-7702细胞株的全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53 R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显着差异表达的基因,包括上调基因:CTXN1、CDCP1、CALB2;下调基因:CRYAB、EN03、GPRC5A。未发现有共同显着差异表达的lncRNA或miRNA。2.独立样本验证中发现 CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03 和 GPRC5A 5个基因在癌组织中mRNA表达水平低于癌旁组织（P<0.05）,在TP53 R249S突变的癌组织中CALB2、CRYAB和GPRC5A的mRNA表达水平要高于TP53非突变的癌组织（P<0.05）。3.CDCP1和CTXN1可能与HBV DNA复制有显着相关（两者P=0.035）而CTXN1和GPRC5A可能与HCC的分化程度显着相关（两者P=0.047）。4.TP53 R249S突变与TCGA数据库HCC的TNM分期有关（P=0.039）,分期越晚,突变可能性越大。TP53 R249S非突变的患者总生存时间（t=1791 days）长于存在突变患者（t=334 days）。对重要的复发生存时间而言,HCC患者携带非突变的TP53 R249S复发风险更低（HR=0.37,95%CI=0.19-0.73,P=0.003）5.生物信息学功能富集分析提示CALB2、CRYAB和GPRC5A可能与TP53基因存在调控关系。结论:全转录组测序数据与TCGA数据库中HCC TP53 R249S突变的表达谱共同分析筛选出6个mRNA显着差异表达的基因,包括CTXN1、CDCP1、CALB2、CRYAB、EN03、GPRC5A。其中CALB2、CRYAB 和GPRC5A可能参与TP53基因调控以及与TP53 R249S突变相关。TP53 R249S突变与HCC患者不良预后有关。
李华兰[5]（2019）在《XPC、ERCC1及XPF表达与肝细胞癌临床病理特征及预后的相关性研究》文中研究表明目的有研究表明DNA修复基因XPC、ERCC1及XPF与HCC易感性相关。本研究通过RT-PCR测定177例HCC中XPC、ERCC1及XPF的表达,探索XPC、ERCC1及XPF在HCC中的临床意义,为监测HCC复发转移、评估预后寻找新的分子标志物。方法收集2008年10月-2013年12月在广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科施行肝癌根治术的177例HCC患者的肝癌组织标本作为研究对象,其中21例有配对的癌旁组织。采用RT-PCR技术测定XPC、ERCC1及XPF在HCC中的mRNA水平。采用Western Blot（W-B）技术检测XPC、ERCC1及XPF在10例肝癌组织及癌旁组织中的蛋白表达情况。比较分析XPC、ERCC1及XPF在肝癌组织与对应癌旁组织的差异表达,探索XPC、ERCC1及XPF表达与HCC临床病理特征之间的关系。无复发生存期（RFS）及总生存期（OS）采用kaplan-meier法和log-rank检验法进行分析,采用Cox比例风险回归模型进行预后分析。结果1.与配对癌旁组织比较,肝癌组织中XPC及XPF mRNA及其蛋白的表达水平显着降低,差异均具有统计学意义（P<0.05）。肝癌组织ERCC1 mRNA水平显着低于癌旁组织（P<0.05）,但其蛋白的表达水平无统计学差异（P>0.05）。2.在HCC中,XPC、ERCC1及XPF的表达均与肝被膜侵犯、癌栓形成相关,有肝被膜侵犯、癌栓形成的HCC患者的XPC、ERCC1及XPF mRNA表达均低于无肝被膜侵犯、无癌栓的HCC患者（P<0.05）。ERCC1表达与HCC的TNM分期相关,Ⅱ-Ⅲ期HCC患者的ERCC1表达低于Ⅰ期HCC患者（P<0.05）。而XPC、XPF表达与TNM分期无相关性（P>0.05）。HCC中XPC、ERCC1及XPF的表达与年龄、性别、吸烟史、饮酒史、HBsAg、ALT、AST、AFP、分化程度、肝硬化、肿瘤大小、肿瘤数目、BCLC分期均无相关性（P>0.05）。3.XPC、ERCC1与XPF在HCC中的表达呈正相关（γ>0,P>0.05）。4.中位随访时间为63.0个月,随访时间2.0个月-135.0个月。XPC低表达组的中位RFS和中位OS分别为15.0个月和51.0个月,高表达组的中位RFS和OS分别为33.0个月和88.0个月,log-rank检验结果显示,低表达组的RFS及OS显着差于高表达组（P=0.001和P=0.001）。5.ERCC1低表达组的中位RFS和中位OS分别为15.0个月和68.0个月,高表达组的中位RFS和OS分别为35.0个月和64.0个月,log-rank检验结果显示,低表达组的RFS比高表达组短（P=0.025）,但两组间的OS无显着差异（P=0.749）。6.XPF低表达组的中位RFS和中位OS分别为19.0个月和45.0个月,高表达组的中位RFS和OS分别为31.0个月和79.0个月,log-rank检验结果显示,低表达组的RFS及OS比高表达组差,差异有统计学意义（P=0.010和P=0.025）。7.RFS单因素分析结果显示,肿瘤大小、分化程度及XPC、ERCC1、XPF表达与RFS有关,肿瘤越大、分化程度越差,其RFS越短（HR=1.48,95%CI:1.07-2.05,P=0.017 和 HR=2.79,95%CI:1.96-3.95,P<0.001）;与高表达比,XPC、ERCC1、XPF低表达的HCC患者的RFS较差（HR=1.73,95%CI:1.25-2.39,P=0.001;HR=1.43,95%CI:1.04-1.97,P=0.028;HR=1.52,95%CI:1.10-2.09,P=0.011）。8:OS单因素分析结果显示,“肿瘤数目、分化程度及XPC、XPF表达与OS有关。多个肿瘤、分化程度差,其OS越短（HR=1.63,95%CI:1.03-2.57,P=0.036 和 HR=2.08,95%CI:1.41-3.08,P<0.001）;与高表达比,XPC、XPF 低表达的 HCC 患者的 OS 较短（HR=1.91,95%CI:1.29-2.82,P=0.001和HR=1.54,95%CI:1.05-2.26,P=0.027）。9.RFS多因素分析结果显示,肿瘤大小、分化程度、XPC、ERCC1是影响HCC患者RFS的独立因素,肿瘤>5cm、肿瘤低分化的HCC患者的复发风险是肿瘤≤5cm、肿瘤高/中分化的HCC患者的1.48倍（HR=1.48;95%CI:1.05-2.08;P=0.025）和 2.54 倍（HR=2.54;95%CI:1.78-3.63;P<0.001）;,XPC、ERCC1低表达的HCC患者的复发风险是XPC、ERCC1高表达者的1.45 倍（HR=1.45;95%CI:1.03-2.06;P=0.034）和 1.49 倍（HR=1.49;95%CI:1.05-2.10;P=0.025）。10.OS多因素分析结果显示,肿瘤数目、分化程度、XPC是影响HCC患者OS的独立因素,多发肿瘤、肿瘤低分化的HCC患者的死亡风险分别是单发肿瘤、肿瘤高/中分化的HCC患者的2.12倍（HR=2.12;95%CI:1.31-3.43;P=0.002）和 1.93 倍（HR=1.93;95%CI:1.30-2.86;P=0.001）;XPC低表达者的死亡风险是XPC高表达者的2.05倍（HR=2.05;95%CI:1.36-3.09;P=0.001）。结论1、XPC、ERCC1、XPF在肝癌中低表达;2、XPC、ERCC1及XPF表达下调与肝癌的肝被膜侵犯、癌栓形成等恶性生物行为有关;3、XPC、ERCC1及XPF两两之间的mRNA表达呈正相关,在肝癌中表达呈一致性降低;4、分化程度、肿瘤大小及XPC、ERCC1、XPF表达与HCC的RFS有关,分化程度、肿瘤大小、XPC、ERCC1是影响肝癌RFS的独立因素,XPC、ERCC1低表达提示复发转移风险高;5、分化程度、肿瘤数目及XPC、XPF表达与HCC的OS有关,分化程度、肿瘤数目、XPC是影响肝癌OS的独立因素,XPC低表达提示死亡风险高。
霍奇[6]（2017）在《MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究》文中提出大量研究结果显示MDIG基因与人类多种恶性肿瘤（如食管癌、胃癌、结肠癌和肺癌等）的发展及预后相关,但是MDIG在肝细胞癌中的功能及调控机制尚不清楚。本研究中,我们发现在肝细胞癌细胞中过表达IKZF1或干扰IKZF1的表达可以影响MDIG的表达水平,MDIG与IKZF1两者之间的m RNA表达水平呈负相关性。染色质免疫沉淀实验（Ch IP）结果显示,IKZF1直接结合MDIG的启动子区域,在转录水平上调控MDIG的表达。体外功能实验结果显示,MDIG促进肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,稳定干扰MDIG表达抑制肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,裸小鼠肝脏原位成瘤实验结果显示MDIG促进肝细胞癌细胞体内成瘤。体外进一步实验显示,MDIG降低肝细胞癌细胞对药物索拉菲尼（sorafenib）的敏感性。MDIG含有组蛋白去甲基化酶,实验结果显示,肝细胞癌细胞中MDIG影响组蛋白3赖氨酸9三甲基化表达水平（H3K9me3）,H3K9me3在表观遗传上调控p21（CIP1/WAF1）的表达,染色质免疫沉淀实验结果显示,H3K9me3直接结合p21（CIP1/WAF1）的转录区而影响其表达水平。本研究通过免疫组织化学染色对155例原发性肝细胞癌患者临床样本分析,发现MDIG在肝细胞癌中表达高于配对的癌旁组织,MDIG表达与病理组织学分级和乙型肝炎病毒感染呈正相关。研究结果提示,MDIG在肝细胞癌中促进肝细胞癌细胞的增殖,有望作为临床治疗肝细胞癌的一个候选分子靶标。
王颖[7]（2016）在《TPD52基因在原发性肝细胞癌中的表达及作用的初步研究》文中指出研究背景及目的原发性肝癌是全球实体瘤中第五位发病和第三位死因的癌症,其中大多数属于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。我国在2015年开展癌症统计调查结果显示,肝癌死因顺位高居第三位。可见,肝癌已成为威胁人类健康的主要肿瘤之一。目前,HCC的一线治疗方法是肝切除术和局部射频消融,但其治疗效果常常受到各种因素的限制,例如肝功能衰竭、多病灶、病人自身健康状况等。因此,HCC的多种替代疗法也应运而生,包括选择性动脉内的放射治疗（SIRT）和分子靶向治疗（索拉菲尼）等。HCC对传统的化疗和放疗不敏感,因此患者术后也常加以辅助免疫治疗来缩小残余瘤灶。然而,HCC很容易发生复发,尤其是肝内复发,因此患者只有不足30%的长期生存率。HCC的形成和进展是一个复杂的多基因改变的过程,如相关癌基因的过表达和某些抑癌基因的失活等。因此,深入研究与HCC密切相关的基因并阐明其对HCC的作用,有助于我们了解HCC的发生发展机制,也对提高HCC的诊治水平和预后评估具有重要意义。肿瘤蛋白D52（tumor protein D52,TPD52）在20年前被首次发现。人TPD52长度约为180-200个氨基酸残基,包含了许多顺序结构,如Coil-coil序列,PEST基序等。许多研究表明,TPD52参与调解多种细胞功能,如细胞增殖、生存、DNA修复、胞外分泌以及囊泡运输,但其在恶性肿瘤中的作用仍存在争议。TPD52在多种肿瘤中呈现高表达水平,包括乳腺癌、多发性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤、黑色素瘤和卵巢癌等;而在一些肿瘤,如乳突状肾细胞瘤、肾透明细胞瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和肺癌中的表达是下调的,但关于TPD52在HCC中的表达及诊治意义尚缺乏相关的研究报道。本研究欲通过荧光定量rt-pcr、westernblotting和免疫组织化学染色法检测tpd52在hcc中的表达情况,分析其与hcc肿瘤特征及患者临床参数及预后的关系,并进一步探究tpd52在hcc发生发展中的分子机制,从而为将来肝癌疾病的临床诊断及治疗提供新的理论依据。研究方法采用荧光定量rt-pcr、westernblotting和免疫组化方法检测tpd52在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况,探讨tpd52与hcc肿瘤特征及临床指标的关系,并分析其在患者预后中的作用。通过细胞转染方法,构建过表达/沉默tpd52的hepg2和bel7402细胞株,研究tpd52在p21相关通路上的作用情况。统计方法:秩和检验用于比较tpd52在肝癌组织和癌旁组织中的mrna转录水平及蛋白表达水平差异;卡方检验用于分析tpd52表达水平与临床参数或p21表达水平的关系;生存分析用于比较tpd52高表达组和tpd52低表达组之间总生存期和无病进展生存期的差异;单因素和多因素cox回归分析用于探究tpd52表达水平和临床特征对hcc术后生存的影响。结果1、肝癌组织中tpd52的mrna转录水平（p<0.05）和蛋白表达水平（p=0.039）明显低于癌旁组织;同样地,与正常肝细胞lo2相比,tpd52在肝癌细胞株中mrna转录水平和蛋白表达水平亦明显下调。2、tpd52阳性染色主要位于细胞胞浆和细胞膜中,其在癌旁组织中的表达水平明显比在癌组织中的表达高;相关分析表明tpd52表达水平与tnm分期显着相关（p=0.011）,高表达tpd52的患者总生存期（p=0.007）和无病进展生存期（p=0.019）明显长于低表达者;多因素分析表明tpd52表达水平是患者总生存（p=0.019）和无病进展生存（p=0.019）的独立预测因素。3、肝癌中tpd52和p21的表达呈现正相关关系（r=0.176,p=0.026）,且同时高表达水平的tpd52和p21能明显提高患者总生存期（p=0.012）和无病进展生存期（p=0.013）。4、体外实验证实,过表达tpd52可上调p53、p21和下调mdm2、bcl2及p-gsk-3β的水平;沉默tpd52则可下调p53、p21和上调mdm2、bcl2及P-GSK-3β的水平。由此表明,TPD52可能直接或间接地通过MDM2-p53-p21途径来影响HCC的发生发展。结论TPD52在HCC形成与发展过程中起抑制作用,有可能作为HCC诊治和患者预后评估的标志,也可成为HCC分子靶向治疗的一个新潜在靶点。
谢兴旺[8]（2015）在《去泛素化酶PPPDE1稳定N端MDM2蛋白片段促进原发性肝细胞癌进展》文中提出HCC肿瘤细胞基因组中,1号染色体长臂21-44区（Iq21-q44）的拷贝数扩增是频率最高的基因组拷贝数变异（copy number variations,CNVs）区段（可达51.7%）,如此高的扩增变异频率提示该DNA区段可能包含多个在HCC发生发展中具有重要作用的癌基因或者肿瘤驱动基因。但是,1号染色体长臂44号区段（1q44）尚未鉴定出功能明确的癌基因或者肿瘤驱动基因。通过整合分析公共数据库中HCC患者的CNVs数据和基因表达数据,挖掘1q44区段编码基因中的候选肝细胞癌驱动基因,我们发现PPPDE1（也即DESI2）的编码基因在HCC肿瘤组织中和HCC细胞系中均有高频率的拷贝数扩增、过度表达并与患者的预后显着相关。提示其可能是一个在HCC中具有重要功能的肝细胞癌驱动基因。美国的癌症和肿瘤基因图谱计划（Cancer Genome Atlas,TCGA）的HCC患者的CNVs数据显示约32%（42/133）HCC患者的PPPDE1编码基因拷贝数扩增达1.5倍以上。TCGA样本和桂林样本两个独立的HCC样本中,HCC肿瘤组织中的PPPDE mRNA均相对于癌旁组织过度表达,而且与HCC患者的不良预后相关。除外HCC,PPPDE1 mRNA也在低分化胶质瘤、结直肠腺癌和肾透明细胞癌中过度表达,而且均与患者的不良预后相关。IHC染色显示PPPDE1蛋白呈局灶性表达于HCC肿瘤细胞的细胞质中,阳性率约为41%（9/22）;对应癌旁组织的阳性率约为14%（3/22）。部分HCC细胞系（Huh7、MHCC97H和PLC/PRF/5细胞）存在PPPDE1的编码基因扩增和mRNA及蛋白质过表达,使用shRNA敲减其中的PPPDE1能显着抑制其克隆形成能力和裸鼠成瘤能力。因此,上述数据和实验结果说明PPPDE1是一个原发性肝细胞癌的驱动基因。体外泛素降解实验和细胞内去泛素化实验均证实PPPDE1具有去泛素化酶活性,能够降解K48和K63连接的泛素修饰。免疫共沉淀联合质谱鉴定和Wstern blot分析发现:HCC细胞内,PPPDE1能够结合一个约25kd的MDM2 N端降解片段（MDM2 p25）,通过去泛素化修饰K63泛素连接的MDM2 p25,促进MDM2 p25在细胞内的稳定,进而上调其蛋白水平。通过依赖细胞内MDM2 p25的一种机制,过表达的PPPDE1能促进细胞内p53蛋白的降解,进而抑制p53通路;在细胞内缺乏MDM2的状态下,过表达的PPPDE1不能促进p53的降解。最后,我们还发现敲减HCC细胞中的PPPDE1能够下调HCC细胞内的MDM2 p25,同时上调p53和BAX蛋白的水平,并能显着地抑制HCC细胞系的裸鼠皮下移植瘤瘤生长速度。
王伯庆[9]（2013）在《CBX4在肝细胞癌中的生物学功能及其对肝癌预后的影响和分子机制》文中认为目的：CBX4（Chromobox4）最初被证实具有E3连接酶活性,参与了染色质重组与转录抑制,能维持上皮干细胞的干性,阻止其衰老。截至目前,CBX4与肿瘤的关系研究很少,本研究旨在检测CBX4在原发性肝癌中的表达情况,分析CBX4表达与原发性肝癌术后预后的关系,初步探讨CBX4在原发性肝细胞癌中的作用。同时考察敲低CBX4基因对肝癌细胞的哪些恶性表型产生影响,初步阐释相关的分子机制。方法：1)实时荧光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）和Western Blot分别检测原发性肝癌术后标本的癌组织和癌旁正常肝组织中CBX4的mRNA丰度和蛋白表达水平；2)免疫组织化学检测有完整临床预后资料的246例石蜡包埋原发性肝癌和癌旁组织标本中CBX4的蛋白表达；3)用Pearson Chi-Square Kruskal-Wallis tests法分析CBX4表达与原发性肝癌临床病理特征的关系,Kaplan-Meier method/log-rank test分析与预后有关的因素,多因素Cox回归模型筛选分析和预后有关的独立危险因素；4)分别在原发性肝癌的细胞株,BEL7402和QGY7703细胞中,瞬时转染小RNA干扰片段,敲低内源性CBX4。通过MTT细胞增殖活性实验检测细胞增殖能力,平板克隆形成实验检测肝癌细胞克隆形成能力；5)敲低肝癌细胞内源性CBX4后,用胸腺嘧啶核苷双阻断方法使BEL7402和QGY7703细胞同步化于G1/S交界处,然后释放进入S期,流式细胞仪检测并比较不同时间点细胞进入S期的比例；6)敲低内源性CBX4后,Western blot检测下游与细胞增殖和细胞周期调控相关的靶基因变化。结果：1)CBX4在原发性肝癌组织较癌旁正常肝组织表达上调。在实时荧光定量PCR检测的8对配对新鲜标本中,癌组织CBX4的mRNA丰度比癌旁肝组织升高；Western blot检测相同的8对配对标本中,癌组织中CBX4蛋白表达也比癌旁肝组织升高；2)246例原发性肝癌手术切除标本,用IHC染色评分后分析,发现CBX4在原发性肝癌患者中存在表达失调。与癌旁组织相比,肝癌组织中CBX4蛋白表达明显上调,且主要定位在肝癌细胞的胞浆：3)CBX4表达在原发性肝癌中的临床意义。免疫组化结果显示,CBX4表达与原发性肝癌患者的临床病理特征密切相关,主要包括：血清AFP水平（P=0.036）,肿瘤大小（P=0.029）,病理分化（P=0.033）,临床TNM分期（P=0.032）。原发性肝癌患者胞浆CBX4高表达者预后差,总生存期（overall survival, OS）和无复发生存期（recurrence free survival, RFS）比CBX4低表达的患者缩短（OS, P=0.003; RFS,P=0.012）。多因素Cox回归分析显示,CBX4浆表达和肝肿瘤数目是原发性肝癌患者总生存期和无复发生存期的独立预后因素。4)分别在肝癌细胞株BEL7402和QGY7703敲低内源性CBX4能够降低原发性肝癌细胞增殖活性和细胞克隆形成能力；敲低内源性CBX4后,细胞的增殖活性降低,克隆形成数减少,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）；5)敲低内源性CBX4后,原发性肝癌细胞由G1/S交界处进入S期的细胞比例较对照组减少,差异有统计学意义（P<0.05）,即细胞由G1/S转换点进入S期的速度减慢：6)CBX4基因可以通过抑制PCNA和cyclinE2,上调p16影响原发性肝癌细胞增殖和G1/S关键点的转换。结论：1)CBX4在原发性肝癌中较癌旁肝组织表达上调；2)CBX4主要定位在肝癌组织的细胞胞浆；3)CBX4胞浆表达水平与原发性肝癌患者预后呈反向相关,CBX4可以作为原发性肝癌术后预后的一个独立预测指标；4)CBX4与原发性肝癌细胞恶性增殖和克隆形成能力密切相关；5)CBX4基因可以通过PCNA而维持原发性肝癌细胞的快速增殖活性；6)CBX4可以通过调控cyclinE2和p16影响肝癌细胞的周期进展。
李永继[10]（2012）在《P125在肝细胞癌中的表达及CDK4对POLD1/P125调控机制的研究》文中认为研究背景：肝细胞癌（HCC）是一种常见的恶性肿瘤,也是全球三大肿瘤死因之一。POLD1是DNA聚合酶δ催化亚基P125的编码基因。P125在细胞周期的S期与增殖细胞核抗原（PCNA）和复制因子C（RFC）的参与下形成复合物定位于复制叉,以前导链和后续链为模板两种不同形式的DNA复制,为细胞的增殖提供物质基础。研究发现POLD1基因在某些肿瘤细胞系中高表达,并具有促进细胞恶性增殖,增强细胞侵袭力的作用。近年来有研究表明,细胞的增殖依赖POLD1编码的P125参与合成复制DNA,且这个过程与细胞周期调控密不可分。调控细胞周期的核心因子是细胞周期蛋白依赖性激酶,它与不同的细胞周期蛋白形成多种复合物,作用于细胞周期的不同时相,决定着细胞周期的进程。其中CDK4/cyclinD的复合物就是调控G1/S期的关键蛋白复合物,它可以使Rb蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基发生磷酸化。在通常情况下Rb蛋白处于低磷酸化状态,并与转录因子E2F结合。磷酸化后的Rb蛋白可导致E2F的释放,释放出的E2F可以诱导cyclin E的表达, cyclin E与CDK2蛋白形成复合物后又可以使Rb蛋白发生磷酸化,使E2F与cyclin E的活性在G1/S期交界点处迅速增高,引起一系列与G1/S期行进有关的靶分子的表达,调控细胞完成DNA复制。近来的研究结果显示,CDK4基因在多种恶性肿瘤组织和细胞中都存在表达异常,包括核苷酸序列位点的缺失和（或）插入、替换,基因表达表达丰度的改变等。作为POLD1基因上游的细胞周期关键因子,CDK4调控POLD1通路及机制对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义,对此深入的研究有利于肿瘤的诊断、治疗及预后判断。目的：检测P125在HCC中的表达；检测CDK4和POLD1在肝癌细胞系SMMC-7721中的表达相关性；探讨CDK4对POLD1/P125表达的调控及其意义。方法：1.免疫组织化学：采用广西医科大学一附院2011年4月-2011年7月期间经病理确诊的HCC患者47例,取其肝癌组织及其癌旁组织（距肿瘤2cm以上）,15例肝内胆管结石旁肝组织作为正常对照。采用免疫组织化学方法检测P125蛋白在肝癌、癌旁及正常组织中的表达情况,分析P125蛋白与HCC临床病理特征的关系。2.质粒构建：设计人CDK4基因全长特异性引物进行PCR扩增人肝癌细胞系SMMC-7721总cDNA,以真核表达载体pEGFP-C1为模板酶切后连接,获得重组质粒GFP-CDK4。3.细胞转染：A：瞬时转染：将转染试剂lipo2000与质粒以1：2比例混合,（转染质粒GFP-CDK4为实验组,转染pEGFP-C1为阴性对照组,未经处理的SMMC-7721为空白对照组）。室温孵育15min后均匀滴入培养板细胞,6h后换用完全培养基,48h收取细胞。B：稳定转染：将瞬时转染5天后的6孔板细胞,在每个孔加入终浓度为500μg/ml的G418进行筛选,3周后得到稳定转染的细胞。4.MTT：将方法3中稳定转染SMMC-7702种植于96孔板中,种板后的24、48、72、96h分别采用MTT法检测实验组和对照组细胞,绘制生长曲线。5.实时荧光定量PCR （qRT-PCR）:用Trizol提取方法3中瞬时转染的实验组和对照组细胞总RNA,逆转录为cDNA后,以此为模板,采用比较△ΔCt法,Real Master Mix（SYBR Green）,设置β-actin为内参,检测CDK4与POLD1以及其他相关细胞周期因子的表达,结果用ABI7500Software v2.0.5分析数据。6.蛋白质印迹（Western blot）:用Western blot检测方法3中稳定转染的实验组和对照组中CDK4和P125蛋白的表达量,设置β-actin为内参,结果用LI-COR Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描,Odyssey V3.0软件分析图像及数据。7.生物信息学分析POLD1启动子结合位点：使用当今主流权威的转录因子结合位点在线预测软件www.gene-regulation.com/pub/databases.html#transfac和www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html预测POLD1基因启动子上的结合位点,发现并初步筛选出与CDK4/POLD1通路相关的目标因子。结果：1.免疫组化检测P125蛋白在肝癌中的阳性率为93.6%（44/47）,明显高于癌旁10.6%（5/47）及正常肝组织6.6%（1/15）。三组比较有显着差异（P<0.01）,其中,P125蛋白在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织和正常肝组织（P<0.01）。癌旁组织与正常组织比较,差异无统计学意义（P>0.05）。P125蛋白在肝癌组织中的阳性表达率与肿瘤大小、肿瘤组织Ki67的表达、HBV感染、AFP水平、肝内外转移以及是否伴有肝硬化无明显相关（P>0.05,）,但是与肝癌组织的分化程度有统计学意义（P<0.01）。2.成功构建人CDK4绿色荧光真核表达重组质粒GFP-CDK4。经过测序比对后发现SMMC-7721细胞中的CDK4为突变型基因,存在碱基的突变和缺失。GFP-CDK4转染到SMMZ-7702中后GFP蛋白和CDK4同时表达,瞬时转染和稳定转染后的细胞都可以观察到细胞内出现绿色荧光。3.MTT分析实验组SMMC-7702细胞与转染PEGFP-C1对照组细胞SMMC-7702和空白对照组SMMC-7702细胞相比,吸光度值OD490在种板后的24h差异无统计学意义（P>0.05）,但在48h、72h和96h差异具有统计学意义,（P<0.05）,实验组细胞增殖速度显着高于对照组和空白对照组。4. qRT-PCR在mRNA水平证实了实验组细胞7702在转染GFP-CDK4后的12h后CDK4相对表达量升高并持续高表达,POLD1在转染后的24h和48h的相对表达量明显高于12h（P<0.01）,说明POLD1的表达相对于CDK4存在表达时间滞后效应；在转染后48h实验组CDK4和POLD1的相对表达量则明显高于对照组,阴性对照组和空白对照组（P<0.01）。5. Western blot分析实验组cdk4蛋白相对于对照组和空白对照组高表达P<0.05),对应的P125蛋白的表达增高,与对照组和空白对照组差异明显（P<0.05）,对照组和空白对照组间则没有明显差异（P>0.05）,结果具有统计学意义。即cdk4高表达可以促进P125的高表达,结论与mRNA水平趋势一致。6.生物信息学软件预测POLD1启动子上没有直接和CDK4结合的位点,但是我们发现有某些结合位点存在于POLD1的启动子序列上的因子其启动子上存在CDK4的结合位点。我们推测CDK4可能是通过其他因子间接调控POLD1的表达。结论：1.P125蛋白在肝癌组织中呈较高表达,且与肝癌等级密切正相关,但与Ki67无明显相关性,提示P125在肝癌的发生和发展中不仅起到合成DNA的作用,而且可能还担负肝细胞癌相关其他已知或未知的作用。2.细胞系试验中证实了CDK4高表达促进了POLD1/P125在mRNA和蛋白质水平的高表达,从而促进了细胞的增殖；验证了POLD1作为CDK4的下游基因受到CDK4的调控。
二、PCNA与P53蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、PCNA与P53蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及意义（论文提纲范文）
（1）长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 第一部分: 应用生物信息学方法筛选新的肝细胞癌相关的lncRNA/miRNA/mRNA调控轴 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分: lncRNA CYTOR/miR-125b-5p/KIAA1522调控轴在肝细胞癌细胞系中的作用 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 第二章 材料与方法 |
| 第三章 结果 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 非编码RNA在肝细胞癌发生与发展中的调节作用及临床应用(文献综述) |
| 第一章 引言 |
| 第二章 作为ceRNA的ncRNA及其它ncRNA在肝细胞癌发展中的可能作用及机制 |
| 第三章 ncRNA在HCC诊断及预后中的临床应用 |
| 第四章 结论、局限性和展望 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（2）KIAA1522在原发性肝细胞癌中的表达及其临床意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 主要仪器、设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 KIAA1522引物 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 资料的收集和随访 |
| 2.2 生物信息分析技术 |
| 2.3 RNA的提取和实时定量荧光PCR |
| 2.4 免疫组织化学方法及评分原则 |
| 2.5 数据处理和统计学分析 |
| 结果 |
| 1.79例肝细胞癌患者临床病理资料总结 |
| 2 KIAA1522在肝细胞癌组织及癌旁正常组织中的表达情况 |
| 3 肝细胞癌中KIAA1522表达与临床病理指标的相关性 |
| 4 肝细胞癌中KIAA1522表达与患者预后的关系 |
| 5 肝细胞癌术后预后的因素分析 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表(附录) |
| 致谢 |
（3）S100A1与PCNA在卵巢高级别浆液性腺癌中的表达及相关性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 组织标本 |
| 1.1.2 试剂盒 |
| 1.1.3 一般试剂 |
| 1.1.4 抗体 |
| 1.1.5 实验仪器设备 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 组织切片的准备 |
| 1.2.2 免疫组织化学方法 |
| 1.3 结果判定方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 第二章 结果 |
| 2.1 S100A1在HGSC组织及正常输卵管上皮组织中的表达 |
| 2.2 PCNA在 HGSC组织及正常输卵管上皮组织中的表达 |
| 2.3 S100A1和PCNA蛋白的表达与HGSC患者临床病理参数关系 |
| 2.4 S100A1和PCNA蛋白在HGSC中表达的相关性 |
| 第三章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究结果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响及TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组学研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702生物学行为的影响研究引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录测序研究及差异表达分析引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702影响的全转录组关联分析引言 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响与TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组联合分析及验证 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 综述 黄曲霉毒素B1体内代谢与原发性肝细胞癌的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文 |
（5）XPC、ERCC1及XPF表达与肝细胞癌临床病理特征及预后的相关性研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1、材料与方法 |
| 2、结果 |
| 3、讨论 |
| 4、结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（6）MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 IKZF1 在肝细胞癌中转录调控MDIG的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 MDIG基因在肝细胞癌中的功能 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 MDIG在肝细胞癌中表观遗传调控p21(CIP1/WAF1)的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MDIG在肝细胞癌中差异表达及其临床意义 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）TPD52基因在原发性肝细胞癌中的表达及作用的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 序言 |
| 1.1 原发性肝癌流行病学与病因学 |
| 1.2 肿瘤蛋白D52家族 |
| 1.3 p21基因 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 肝癌标本的收集 |
| 2.1.2 主要实验用品与仪器设备 |
| 2.1.3 主要的缓冲溶液、培养基等配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实时荧光定量RT-PCR |
| 2.2.2 免疫印迹法 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色法 |
| 2.2.4 细胞瞬时转染 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TPD52在肝癌组织和肝癌细胞中的转录和表达情况 |
| 3.1.1 TPD52 mRNA在肝癌组织和肝癌细胞中的转录水平 |
| 3.1.2 TPD52蛋白在肝癌组织和肝癌细胞中的表达水平 |
| 3.1.3 TPD52表达与肝癌患者临床恶性特征的关系 |
| 3.1.4 TPD52表达、各临床病理特征与肝癌患者生存预后的关系 |
| 3.2 TPD52与p21通路的关系 |
| 3.2.1 TPD52与p21的关系 |
| 3.2.2 TPD52与相关通路蛋白的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）去泛素化酶PPPDE1稳定N端MDM2蛋白片段促进原发性肝细胞癌进展（论文提纲范文）
| 序言 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 PPPDE1能够促进原发性肝细胞癌进展 |
| 引言 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 PPPDE1去泛素化修饰25kd MDM2N端片段调节p53通路 |
| 引言 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 实验材料与方法 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 简历 |
（9）CBX4在肝细胞癌中的生物学功能及其对肝癌预后的影响和分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 前言 第一部分 CBX4在肝细胞癌中的表达及其与预后的关系 |
| 引言 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 第二部分 CBX4基因在原发性肝癌中的生物学功能 |
| 引言 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 结论 致谢 参考文献 综述 |
| 参考文献 攻读博士期间发表的学术论文 个人简历 导师评阅表 |
（10）P125在肝细胞癌中的表达及CDK4对POLD1/P125调控机制的研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩略语表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 P125在HCC中的表达及与Ki67和肿瘤分化程度的研究 |
| 第1节 P125在HCC的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第2节 HCC中P125与Ki67及肿瘤分化程度相关性的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二章 CDK4对POLD1/P125的调控 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士研究生期间发表的论文 |
四、PCNA与P53蛋白在原发性肝细胞癌中的表达及意义（论文参考文献）
- [1]长链非编码RNA CYTOR通过调节miR-125b-5p/KIAA1522轴影响肝细胞癌增殖、凋亡和细胞周期的机制研究[D]. 胡博. 北京协和医学院, 2021(02)
- [2]KIAA1522在原发性肝细胞癌中的表达及其临床意义[D]. 徐永政. 青岛大学, 2020(01)
- [3]S100A1与PCNA在卵巢高级别浆液性腺癌中的表达及相关性研究[D]. 栗佳琦. 青岛大学, 2019(01)
- [4]黄曲霉毒素B1对人肝细胞株HL-7702的影响及TP53基因突变的原发性肝细胞癌的转录组学研究[D]. 余廷东. 广西医科大学, 2019(08)
- [5]XPC、ERCC1及XPF表达与肝细胞癌临床病理特征及预后的相关性研究[D]. 李华兰. 广西医科大学, 2019(08)
- [6]MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究[D]. 霍奇. 上海交通大学, 2017(05)
- [7]TPD52基因在原发性肝细胞癌中的表达及作用的初步研究[D]. 王颖. 广东药科大学, 2016(02)
- [8]去泛素化酶PPPDE1稳定N端MDM2蛋白片段促进原发性肝细胞癌进展[D]. 谢兴旺. 中国疾病预防控制中心, 2015(05)
- [9]CBX4在肝细胞癌中的生物学功能及其对肝癌预后的影响和分子机制[D]. 王伯庆. 新疆医科大学, 2013(02)
- [10]P125在肝细胞癌中的表达及CDK4对POLD1/P125调控机制的研究[D]. 李永继. 广西医科大学, 2012(10)