一、不同血样收集和模板制备方法聚合酶链反应检测疟疾比较（论文文献综述）
黄和荣[1]（2021）在《人CYP2D6基因编码区遗传多态与云南省间日疟复发的关联性分析》文中研究说明研究目的:通过分析细胞色素P450超家族成员2、D亚族的6多肽（Cytochrome P450,family 2,subfamily D,polypeptide 6,CYP2D6）基因编码区的遗传多态性,初步了解云南省间日疟患者的CYP2D6基因突变多态,并在此基础上进行酶活性预测以及对云南省间日疟复发受CYP2D6基因突变影响的关联性进行初步揭示。研究方法:收集云南省2014～2020年间经“氯喹/伯氨喹八日疗法”治疗的间日疟病例血样。通过流行病学和基因序列比对确定间日疟疑似复发（Suspected relapsed cases of vivax malaria,SR）和未复发（Non-relapsed cases of vivax malaria,NR）病例组。采用聚合酶链反应（PCR）扩增人基因组中的CYP2D6基因,并对扩增成功的产物进行测序。将测序获得的CYP2D6基因序列与非突变参考序列进行比对确定测序的正确性和9个外显子区域。人工截取9个外显子的DNA序列、并拼接成DNA编码区序列（coding DNA sequence,CDS）,该链默认为母体（maternal）CDS链,父体（paternal）CDS链根据测序峰图调整碱基信息而得。用Dna SP 6.11.01软件识别CDS链的突变多态、单倍型等。参照“人类细胞色素P450等位命名委员会数据库”标准命名CYP2D6基因的单倍型（等位基因）,并以双倍体基因型预测CYP2D6酶活性。用IBM?SPSS?21软件分析所有CDS链的突变位点、等位形式、基因型与间日疟复发的比值比（odds ratio,OR）。结果:共获得长度为1491bp的母体（maternal）CDS链326条。所有652条母体、父体（paternal）CDS链中共检出12个突变位点,c.1457 G>C位点突变在间日疟疑似复发病例组和未复发病例组均为检出最多,分别为81.2%（112/138）和68.5%（352/514）;c.271、c.281、c.294、c.505、c.408、c.1457等6个位点突变与间日疟复发的关系最为密切。23种单倍型（Hap＿1～Hap＿23）中,Hap＿3为非突变型,Hap＿9的序列结构最复杂;11种为已知等位,可合并为*1、*2、*4、*10和*39等5种星等位基因,且检出最多等位形式为*10等位（45.1%,294/652）;*1等位在未复发组中检出率显着增高（x2=10.484,P<0.05）,而*39等位在疑似复发组检出率显着高于未复发组（x2=19.188,P<0.05）,*4等位仅在疑似复发组检出（P<0.05）。326例间日疟患者共定义了10种可准确命名的基因型,其中除酶活性完全丧失基因型*4/*4仅在疑似复发组中出现外,其余9种基因型在两组病例中均有检出,酶活性降低基因型*10/*10在两组病例中均为最常见的基因型分别为27.6%（19/69）和26.5%（68/257）,但差异不具有统计学意义（x2=0.032,P>0.05）;酶活性正常基因型*1/*1在未复发组的检出率显着高于疑似复发组（x2=8.096,P<0.05）,而基因型*10/*39则在疑似复发组的检出率更高（x2=8.851,P<0.05）,相较于其他基因型对间日疟复发的风险增加了8.063倍。Tajima’s中性检验检验结果表明,Tajima’s D中性检验值为0.42819（P>0.10）,且D值波动性较大,说明所研究CYP2D6全基因编码区序列检出的突变不属于定向选择压力下的非中性突变,Ka/Ks比值为2.9大于1,说明研究序列非常活跃、错义突变率高于同义突变率、正向多元选择的效应较强。结论:在云南省伯氨喹暴露人群中,c.1457、CYP2D6*10以及*10/*10分别为CYP2D6基因最常见的突变位点、等位基因以及基因型;c.271、c.281、c.294、c.408、c.505、c.1457位点突变及其参与组合构成的*4等位与间日疟复发发生的关系最为密切,且酶活性完全丧失的基因型*4/*4仅在间日疟疑似复发患者中出现,提示云南疟区人群中可能存在因CYP2D6酶活性受损导致的伯氨喹根治间日疟疗效降低的风险。
钱程[2]（2021）在《荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究》文中指出核酸检测技术是以生物体内的核酸为靶标进行分析的检测手段。该技术目前已经被广泛应用于食品安全检测、环境污染物监控、临床诊断、遗传分析等众多领域。从样本获取到结果输出,核酸检测技术一般包含提取、扩增和检测三个基本环节。目前,已知的核酸检测技术或是需要复杂的样本提取操作、或是需要耗时冗长的扩增环节、或是需要毒性较大的凝胶电泳鉴定等,都存在着许多的缺陷。为了能够将该技术更好的在实际使用场合中进行推广,本论文从该技术的三个基本环节入手,针对其中的不足之处进行了相应的优化和改进,建立了集荧光可视化、便携性、低成本等优点的核酸分析平台。论文中选取了三种重要的感染于常见农副产品的动植物病菌作为应用对象,将所建立的分析平台用于对这些病菌的快速检测以评估其实际性能。本论文主要研究内容及相关结论如下:（1）论文建立了集核酸快速提取、快速PCR扩增、终点肉眼检测于一体的高效核酸分析平台,并将其应用于对虾传染性皮下组织及造血器官坏死病病毒（IHHNV）的检测。为了尽可能简化核酸检测的流程,提高检测效率,本论文分别从提取、扩增、检测的三个环节进行了相应的优化。首先,论文中引入了碱裂解法用以快速获取核酸样本,将繁琐的核酸提纯环节缩短到仅需3 min即可完成;其次,引入了快速PCR体系,通过对“平衡范例方程”的理解和探索,将传统的三温区PCR循环简化为动态双温区进行,成功地将本需要2 h的PCR扩增环节缩短到10 min以内;接着,引入了分子信标技术,通过对其结构的研究,设计了具有较高特异性的探针体系,实现了在常温下对靶标核酸的肉眼荧光可视化结果判读。此外,通过改变分子信标末端的荧光标记,实现了在同一反应管内对两种不同靶标核酸的高灵敏度双重检测。该分析平台具有较高的特异性和灵敏度,可以充分用于虾苗的IHHNV感染情况的初筛和周期性复检,其低成本、易操作的特性也十分适宜现场检测的应用,该病毒在对虾养殖产业中危害巨大,连年造成不小的经济损失。基于该分析平台的方法可以实现在15 min内对虾苗样本中的IHHNV靶标进行快速可视化分析,检测限达到每反应1000拷贝。与现行国标方案相比,将检测时间从3 h缩短到仅需15 min,并且减少了对大型仪器设备的需求,大大提高了检测效率和实用性。（2）论文建立了集防止核酸污染、恒温扩增、荧光可视化终点检测为一体的分析平台,并将其应用于对柑橘黄龙病病菌的快速检测。论文中引入了基于CRISPR/Cas系统的基因编辑技术通过对CRISPR/Cas系统的探索,验证了Cas12a效应蛋白尚未被报道的新PAM序列“UUUN”。基于此新PAM序列,论文中进一步引入了利用尿嘧啶糖基化酶（UracilDNA Glycosylase,UDG）体系来实现防止核酸扩增子气溶胶污染的方案,解决了核酸检测领域的这一痛点。此外,用更为便携和快捷的环介导等温核酸扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）代替国标采用的PCR方法,可以进一步缩短整个检测流程的时间并减少对复杂温控仪器的需求。利用CRISPR/Cas体系的高特异性,当特殊设计的cr RNA与靶标黄龙病病菌的核酸配对后会与Cas12a效应蛋白形成复合体,从而激活该蛋白的旁路切割活性,使得体系中带有荧光标记的单链寡核苷酸探针被切割降解,进而导致荧光信号的释放,实现荧光可视化的高灵敏度检测。该分析平台可以实现对柑橘养殖产业影响颇大的的柑橘黄龙病的致病菌——黄龙病病菌（Cirtus huanglongbing,HLB）每反应10拷贝的高灵敏度检测,其检测限相较传统的嵌入式染料方法提高了约100倍。（3）论文建立了针对组分复杂样本的免核酸提纯分析方案,并结合玻璃化手段为热敏感的酶类试剂提供了一种更方便的储藏思路。为了进一步提高核酸检测技术的实际使用性能,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文以近些年在全球范围内疯狂肆虐的非洲猪瘟疫情的病原菌非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）为应用对象,建立了基于玻璃化CRISPR体系及免样本提取的荧光可视化核酸分析平台。基于对CRISPR体系在灵敏度和特异性方面的探索和相关研究结果,论文中进一步尝试省略样本提纯的繁琐步骤,对全血样本不进行任何预处理直接对其中的核酸靶标进行检测。通过对三种常用的具有链置换功能的Bst DNA聚合酶的实验探究,筛选出了最适宜的酶种,用以对未经处理的原始全血样本进行直接扩增,并进行后续的可视化检测。此外,为了更好地将LAMP扩增体系与热敏感的CRISPR体系兼容于同一反应管中,并提高酶类试剂的储藏稳定性,论文探索了以普鲁兰糖和海藻糖作为保护剂,通过玻璃化的方法,将液态的CRISPR试剂脱水成膜的手段来实现其较长时间的稳定储存。基于该方法,经过老化加速试验的测试,原本需要低温储存环境的CRISPR体系可以在室温下稳定储藏180天。该方案可以很好地解决此类热敏感的酶类试剂对于储存环境的超低温要求,并且可以大大节省其远距离冷链运输的成本。该平台可以实现对家猪全血样本中的非洲猪瘟病毒每反应100拷贝级别的检测灵敏度,并且整个检测过程都可以在便携的装置上完成,实现“从样本到结果”的直观输出。
陈明慧[3]（2020）在《基于等温扩增技术构建microRNA纳米检测传感器的初步研究》文中研究表明MicroRNA（miRNA）在人体内的异常表达与多种疾病的发生发展密切相关,因此,实现对人体miRNA含量的检测分析,将有助于相关疾病的早期诊断及治疗。传统的miRNA检测分析方法因操作复杂、仪器设备昂贵、特异性差等缺点无法满足资源贫乏地区的早期检测和诊断的需求。因此,本文以核酸等温扩增技术为基础,结合纳米探针技术,构建操作简便、灵敏度高、特异性强的miRNA检测纳米生物传感平台,以实现对体液样本中多种miRNA标志物的检测分析,具体研究内容如下:1.基于Poly（A）加尾等温扩增技术,研发超灵敏生物循环发光miRNA磁性纳米检测传感器:本章利用链霉亲和素-生物素反应系统在磁性纳米颗粒（MNB）表面偶联特异结合目标miRNA的茎环DNA（h DNA）,制备MNB-h DNA探针,实现复杂样本中目标miRNA的快速特异分离。接着,基于Poly（A）聚合酶加尾等温扩增技术在目标miRNA的3’羟基末端延伸出重复的腺嘌呤核糖核苷酸序列,收集AMP焦磷酸化-ATP脱磷酸化转化反应所生成的循环生物发光信号,实现目标miRNA的超灵敏定量检测。对miRNA-21的检测灵敏度高达2.26×10-17mol/L,检测时间为120 min,对癌症病人全血样本中miRNA-21的检测结果与q RT-PCR的检测结果呈现高度一致性。该传感器无需复杂的miRNA提取程序即可直接检测血清中的miRNA-21,且可重复应用以降低检测成本,对miRNA的检测具有潜在的临床应用价值。2.基于链置换等温扩增技术,构建快速便携的miRNA金纳米检测试纸条:本章制备不同粒径的金纳米颗粒（AuNP）,设计具有荧光淬灭性能的黑洞淬灭剂2标记的茎环DNA（SH-h DNA-BHQ2）,通过金巯键的反应制备金球探针（AuNP@h DNA-BHQ2）,AuNP@h DNA-BHQ2可以与对应的目标miRNA互补配对。设计“侵入堆叠引物”（IS-引物）等温链置换扩增反应（Invading stack primer isothermal chain displacement amplification reaction,ISAR）,当h DNA/miRNA杂交后,h DNA的茎环结构被破坏,ISAR反应被激活,释放目标miRNA实现目标循环扩增和信号放大,生成大量带生物素或地高辛标记的AuNP@ds DNA-BHQ2产物,该产物可以和特殊设计的反向荧光增强试纸条（Reverse fluorescence enhancement lateral flow test strip,rLFTS）反应,根据检测线上AuNP红色信号强度变化实现目标miRNA可视化裸眼定性检测,同时,检测线上包被的荧光分子Cy5/Cy3被金纳米粒子淬灭,根据荧光强度变化实现目标miRNA的灵敏定量检测。结果表明,该miRNA快速金纳米检测试纸条检测灵敏度为3.42×10-15 mol/L,检测时间缩短至35 min。此外,通过将不同荧光分子Cy5/Cy3标记到不同的检测线上,研究在同一试纸条上实现has-miRNA-5010-3p（miRNA-5010）和has-miRA-331-5p（miRNA-331）两种神经退行性疾病核酸标志物的同步测定,该试纸条成功用于帕金森患者全血样品中miRNA-5010和miRNA-331的检测,在实际样本的检测中检测结果与q RT-PCR一致,且和帕金森疾病临床分期结果一致,表明我们建立的方法在帕金森疾病的诊断和治疗中具有重要价值。3.基于链置换等温扩增及CRISPR-Cas12a信号放大技术,研制超灵敏便携的miRNA金纳米检测试纸条:本章通过设计h DNA检测探针及对应的“侵入堆叠引物”构建链置换等温扩增反应（Invading stack primer isothermal chain displacement amplification reaction,ISAR）,当目标miRNA存在时,发生ISAR反应,反应后释放目标miRNAs,实现目标循环扩增和信号放大,ISAR生成大量的双链DNA产物（ds DNA）,ds DNA被CRISPR-Cas12a系统识别,激活Cas12a蛋白的DNA核酸酶的“疯切”能力,高效切割反应体系中两头分别标记了生物素和地高辛的ss DNA序列（Digoxin-ss DNA-Biotin）,该反应液体与设计的金纳米反向荧光增强检测试纸条（rLFTS）反应,产生相应可见信号变化,同时淬灭T线荧光,产生对应的定量荧光变化信号。结果表明,通过ISAR、CRISPR-Cas12a和rLFTS实现三重信号放大,该miRNA超灵敏金纳米检测试纸条检测灵敏度高达3.84×10-17 mol/L,检测时间仅需90 min。最后,使用此方法对口腔癌病人唾液样本中miRNA-31进行检测,检测结果与q RT-PCR的检测结果具有优异的一致性,表明本方法可在资源匮乏社区实现对唾液样本miRNA的无创超灵敏检测。我们还对本方法的储存稳定性进行了评估,结果表明本方法中可稳定保存6个月以上,性能未见明显下降。
刘淑萍[4]（2020）在《云南省间日疟患者G6PD基因编码区突变与伯氨喹服用人群溶血发生的相关性初步分析》文中研究指明目的:分析云南省间日疟患者的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）基因编码区突变多态及其与伯氨喹诱发性溶血现象之间的相关性;分析人G6PD酶活性降低者中常出现的G6PD基因编码区突变位点,为云南省进一步筛选出G6PD酶活性降低的基因标志奠定基础。方法:（1）收集2018年1月～12月,经“氯喹/伯氨喹八日疗法”治疗的云南省间日疟病例血样184份,本实验采用的样本包括G6PD基因拼接成完整c DNA链的间日疟报告病例样本和外显子exon10～13编码区段的间日疟报告病例样本两部分,以间日疟病例服用伯氨喹初期出现头晕、乏力、腹痛不适,数小时或几天间出现黄疸、尿液呈“茶色”样改变、血红蛋白指征持续降低,NADPH/NADP+比值法测试G6PD酶活性存在任何水平的下降,判断为伯氨喹诱发性急性溶血。（2）从滤纸血样本中提取人基因组DNA使用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒,参照DNA提取试剂盒说明书（QIAgen DNA Mini Kit）,提取人基因组DNA,巢氏PCR扩增含外显子exon2～13片段的G6PD基因并送测序。测序结果用DNAStar11.0、Bio Edit7.2.5等软件进行整理,将获得的DNA序列与G6PD基因非突变型参比序列、突变型参比序列进行比对并拼接测序序列,确定DNA序列的G6PD基因exon2～exon13外显子区域的起止点,并将这12个外显子的DNA序列沿exon2至exon13的顺序拼接成G6PD基因的c DNA序列。（3）用MEGA5.04软件对c DNA链和外显子exon10～13编码区段进行文件格式调整和氨基酸转换,并与非突变型序列比对分析以确认错义突变、同义突变位点。用Dna SP5.10软件对G6PD基因片段的单倍型期望杂合度（Expected heterozygosity,He）、核酸多样性指数（π）、同义替代率（Ks）和异义替代率（Ka）比值,即Ka/Ks比值,进行计算分析。（4）用统计学中IBM?SPSS?21软件的“交叉列表”程序对G6PD基因编码区位点突变与伯氨喹诱发性溶血出现的相关性系数（Relevance,R）、比值比（Odds ratio,OR）进行分析计算。结果:（1）本研究收集云南省间日疟报告病例G6PD基因血样共184份,获得间日疟报告病例血样的G6PD基因完整c DNA链（长度为1545bp）的样本44份,其中1条来自溶血病例的G6PD基因组;获得间日疟报告病例血样的G6PD基因部分外显子exon10～13（长度为495bp）样本91份。44条c DNA链与非突变型序列比对的突变位点包括c.461T>A、c.574C>T、c.786C>T、c.1059 C>T、c.1311T>C和c.1376 G>T,频率分别为1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、1.5/10万、47.1/10万和1.5/10万。91条外显子exon10～13的部分G6PD基因片段与突变型序列比对出的突变位点为c.1311T>C,未检测出与伯氨喹诱发性溶血发生为正相关性的突变位点c.1376 G>T,突变位点为c.1311T>C的频率为168.72/10万。（2）c.1311与c.1376的双位点突变连锁仅存在于1例溶血病例的基因组,且c.1376位点突变与伯氨喹诱发性溶血的发生为正相关性（R=1.000,P?0.05）。（3）44条c DNA链定义为6种单倍型（Hap＿1～Hap＿6）,He、π、Ka/Ks分别为0.493、0.001和0.062;c.1311单点突变的Hap＿2单倍型占比最多,为68.2%（30/44）,等位组成亦最复杂,出现非突变半合子（6/44,13.6%）、突变半合子（17/44,38.6%）、非突变纯合子（5/44,11.5%）、突变纯合子（11/44,25%）、突变杂合子（5/44,11.4%）等5种类型合子。Tjima’s中性检验D值为-1.414（P>0.10）,且全段的D值均<1,表明研究序列检出的突变不属于定向选择压力下的非中性突变,Ka/Ks比值为0.062,说明研究序列非常保守、错义突变率低于同义突变率。（4）91条c DNA链定义为2种单倍型（Hap＿1～Hap＿2）,He、π分别为0.2784、0.001和0.001;c.1311单点突变的Hap＿2单倍型占比最多,为83.5%（76/91）,等位组成亦最复杂,出现非突变半合子（12/91,13.2%）、突变半合子（56/91,61.5%）、非突变纯合子（3/91,3.3%）、突变纯合子（18/91,19.8%）、突变杂合子（2/91,2.2%）等5种类型合子。Tjima’s中性检验D值为0.48503（P>0.10）,但其D值<1,说明所研究序列检出的突变不属于平衡选择压力下的非中性突变。G6PD基因外显子核苷酸变异不受选择压力作用,或受选择压力的影响不大,符合中性突变假设。结论:1.本实验样本共从44例G6PD全基因中检测出6种突变位点,3种为同义突变,另3种引起氨基酸变异,其中,c.461、c.574和c.786为新发现的3个位点的碱基替换突变类型。2.通过对云南地区1例疑似伯氨喹诱发溶血的间日疟病例G6PD基因突变型进行分析,c.1311与c.1376的双位点突变连锁仅存在于溶血病例的基因组,研究发现,c.1376位点的突变与伯氨喹诱发性溶血的发生有关。仅c.1376位点的G>T突变与氧化剂诱发性溶血的发生呈正相关关联性（R=1.000,P?0.05）。3.本研究的44例全基因样本中有32例c.1311位点发生突变,91例G6PD基因外显子exon10～13样本中有76例c.1311位点发生突变。说明在云南省疟区人群中,c.1311为G6PD基因外显子exon11编码区的常见突变位点,G6PD基因外显子exon11是外显子exon 2～13编码区中基因易突变的高发区。4.44例样本中,共鉴定出8种突变基因型,18例半合子3种突变基因型（461、1311、1376）,6例杂合子2种突变基因型（786、1311）,13例突变纯合子3种突变基因型（574、1059、1311）。5.本研究利用优化设计的引物和PCR技术,扩增出了G6PD基因外显子全长为1545bp的全基因编码序列,为分析G6PD基因外显子的多态性奠定了基础。
王笑笑[5]（2020）在《中缅边境疟疾无症状感染者流行病学特征研究》文中进行了进一步梳理背景和研究目标:消除疟疾的核心策略之一是通过发现和管理所有疟原虫感染者,以达到清点拔源、阻断传播的目的。疟疾无症状感染者被认为是“传染源储存库”,在疟疾传播和传染源管理中具有重要意义。中缅边境作为我国消除疟疾的重点难点地区,边境两侧疟疾发病和无症状感染水平在消除疟疾过程中逐渐引起关注,但对无症状感染者流行病学特征、带虫持续时间以及分子机制缺少系统研究。本课题围绕中缅边境疟疾无症状感染水平、流行病学特征和影响因素开展研究,为该地区实施消除疟疾“线索追踪、清点拔源”核心策略和巩固消除疟疾成果提供科学依据。技术路线:本文分三部分开展研究,首先比较镜检、荧光PCR和超敏PCR等当前用于疟原虫检测的常用方法对无症状感染者的检测敏感性和一致性,从中优选出对无症状感染者最敏感的检测方法,在中缅边境两侧选点开展横断面研究,了解边境两侧疟疾无症状感染水平（第一部分）;现场收集调查对象的基本信息和职业、人蚊接触和疟疾罹患史等与疟原虫感染有关信息,进行单因素与多因素分析,并对个体免疫相关基因位点和疟原虫抗性分子多态性进行检测,以阐明无症状感染者的流行病学特征及其影响因素（第二部分）;同时对调查发现的疟疾无症状感染者进行队列研究,探讨无症状感染持续时间、感染状态动态变化特征及其可能的影响因素（第三部分）。方法:利用中缅边境地区既往现场采集的居民血样,比较显微镜检测、超敏PCR法与荧光PCR法对无症状感染的检出率和一致性,遴选无症状感染者筛查最敏感的方法,在云南中缅边境两侧的4个村寨/安置点开展疟疾无症状感染水平横断面研究。收集调查对象的年龄、性别、职业、外出特征、蚊媒暴露、近期疟疾罹患史等资料,应用单因素和多因素分析方法,阐明无症状感染者的人群流行病学特征及其主要影响因素。在分子水平对调查发现的无症状感染者抗性分子标记多态性进行分析,运用飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）分型技术对免疫相关分子 TLR SNP 位点（TLR9 T1486C、TLR9 G1174A、TLR5 R392Stop）进行检测,分析TLR SNP位点的等位基因和基因型多态性对无症状感染的影响。同时对无症状感染者进行队列研究,运用Kaplan-Meier法和Cox比例风险回归模型分析无症状带虫持续时间、感染状态变化特征及其影响因素。结果:超敏PCR法对无症状感染者的检出率最高,387份样本中检出38例阳性,检出率达9.82%;荧光PCR法检出阳性13例,检出率3.36%;镜检仅检出6例,检出率仅为1.55%。超敏PCR法与另两种方法的一致性较好,与荧光PCR法和显微镜检测的观察一致性分别为93.54%和91.73%,且荧光PCR法和显微镜检测发现的阳性者,超敏PCR法均能检出,表明超敏PCR法对无症状感染者的检出最为敏感。采用超敏PCR法在中缅边境两侧4个村寨/安置点（境外3个,境内1个）对共1147个居民开展无症状感染水平的横断面研究,结果发现该地区无症状感染率为8.81%,均为间日疟。境外调查点的无症状感染率（9.60%）显着高于境内（3.40%）（χ2=6.13,P=0.01）。检测分析不同疟疾发病率年份的人群血样,发现境内无症状感染水平因发病率不同有显着差异,2014年境内调查点疟疾发病率为0.40%,其无症状感染率为9.75%,而2019年同一调查点疟疾发病率为0%,无症状感染率为3.40%（χ2=5.54,P=0.02）。境外不同采样年份虽然疟疾发病率有下降,但无症状感染水平无明显变化,分别为10.00%和9.60%。流行病学特征分析发现,男性无症状感染率（10.91%）明显高于女性（7.21%）（χ2=4.78,P=0.03）,不同年龄无症状感染水平亦有显着差异（χ2=14.89,P=0.02）,51～60岁组最高为17.57%。男性41～50岁年龄组无症状感染率最高,为22.58%;而女性51-60岁最高,为15.69%,另女性11～20岁年龄组亦较高,达8.77%。单因素和多因素分析表明,性别、主要生活/工作场所、每周最远外出距离为无症状感染的影响因素,即男性（OR=1.73,95%CI=1.05～2.85）、生活/工作场所主要为室外（OR=1.96,95%CI=1.05～3.65）、每周外出距离较远（与≤1公里相比,每周最远距离1～5公里:OR=2.76,95%CI=1.55～4.92;每周最远距离>5公里:OR=2.88,95%CI=1.21～6.87）是无症状感染的主要危险因素。TLR SNP位点等位基因多态性分析发现,与AA基因型相比,TLR9 T1486C位点AG基因型是无症状感染的保护因素（校正OR=0.45,95%CI-0.24～0.84）。抗性分子标记多态性分析显示,间日疟无症状感染者抗性分子标记多态性明显,包括:Pvdhfr突变型占100%、Pvdhps突变型占40%、Pvmdr1突变型占100%、Pvcrt-o突变型占40%;恶性疟无症状感染者Pfcrt亦为突变型。间日疟无症状感染者抗性分子标记多态性分布与确诊病例无明显差别。队列研究表明,中缅边境地区间日疟无症状感染者发展至有症状的比例为3.85%（3/78）。Kaplan-Meier法分析显示,无症状感染持续时间平均（中位数）为8周,感染状态变化模式多样,24.36%的随访者表现为持续阳性、20.51%持续1～4次阳性后转阴、32.05%表现为间断性阳性、11.54%呈现一过性阳性。Cox比例风险回归模型分析表明,年龄、外出频率、森林/林区暴露史是影响无症状感染持续时间的重要因素,其中相较于≤20岁组,年龄>20岁无症状感染者从阳性转阴的概率更高,风险比HR为2.11（95%CI=1.12～3.97）;与不外出者相比,经常外出者从无症状感染阳性转阴的概率较低,风险比HR为0.39（95%CI=0.16～0.96）;与无森林/林区暴露者相比,有暴露史者从无症状感染阳性转阴的概率较低,风险比HR为0.51（95%CI=0.27～0.94）。结论:中缅边境地区疟疾无症状感染水平较高,发病较高的缅甸一侧其无症状感染水平显着高于发病较低的云南一侧。流行病学特征表现为男性和51～60岁是高发人群,男、女性无症状感染的年龄分布不同。性别、主要生活/工作场所、每周较远距离外出是无症状感染率的主要影响因素,上述流行病学特征显示无症状感染和疟疾显性发病一样与人蚊接触关系紧密。队列研究发现,近四分之一无症状感染者持续带虫,持续时间平均（中位数）达8周,年龄、外出频率和森林/林区暴露史是无症状感染持续时间的主要影响因素。
夏舒[6]（2019）在《基于RPA和ECL的生物气溶胶核酸检测方法研究》文中认为气溶胶态病原体主要包括病毒和细菌（生物气溶胶）,由于气溶胶粒径小常悬浮于空气中,因此,生物气溶胶病原体容易造成呼吸道传染性疾病的大规模爆发。生物气溶胶采样对传染性疾病的防控尤为重要,目前传统的生物气溶胶采样方法主要有自然沉降法、冲击法、撞击法、采样膜法等。采样膜法由于采样效率高,常被用于空气采样。FTA卡（Flinders Technology Associates）适用血液、口腔拭子、上皮细胞、细菌、病毒和培养细胞等多种样品的保藏,可与核酸结合,维持样品中DNA的完整性。目前尚未见利用FTA卡进行生物气溶胶病原体采集的报道。生物气溶胶病原体常用检测方法主要包括细胞培养菌落计数法、免疫检测法和核酸检测法。细胞培养菌落计数法需依靠人工操作,耗时费力,细胞培养超过24 h,不能实现自动化快速检测。免疫检测法对样本的处理相对较为简便,但是复杂样本的检测,存在交叉污染等问题。近年来,核酸分子检测技术在临床医疗、疾病防控等领域发挥越来越重要的作用,如聚合酶链式反应（PCR）、荧光原位杂交技术（FISH）、基因测序技术等。但传统PCR方法由于需依靠精密的仪器以精确控制温度的变化,并且由专业技术人员操作分析,很大程度上限制其在条件有限的现场检测领域的应用。近年来我国出现各种空气传播传染病爆发（如SARS、H1N1、H7N9）,给传染性疾病的预防工作带来了前所未有的挑战,为有效预防传染性疾病的爆发,开展针对生物气溶胶病原体快速检测的研究意义重大。本研究拟构建以FTA卡进行生物气溶胶病原体采样方法,实现气溶胶病原体采样与核酸提取一体化操作。结合重组聚合酶扩增和纸基电化学发光（RPA-ECL）检测技术,初步建立一种特异灵敏、操作简便的生物气溶胶病原体检测方法。通过检测临床HBV血清样本进行验证,并与实时荧光定量PCR法比较。主要实验结果如下:1.FTA卡在初始负压40 kPa、空气湿度98%RH和26℃条件下可以持续采样8 min,采样最大单位截留量为0.96 mg/cm2。FTA卡可用于气溶胶HBV质粒的采集,采集效果可通过RPA+凝胶电泳紫外成像法进行半定量分析。2.三联吡啶钌标记引物标记率达到74.62%,为后续钌标引物的制备提供技术基础。3.RPA扩增HBV质粒的优化反应条件为:0.8μmol/L引物,280 mmol/L醋酸镁,30℃下扩增20 min。4.RPA-ECL方法的灵敏度及线性检测范围实验结果表明,电化学发光响应强度在0.12—1200 ng/mL HBV质粒样品浓度之间呈现良好的线性关系;检出限为1.2 pg/mL（S/N>3）;检测的相对标准偏差分别为5.18%和6.40%。提示RPA-ECL法对HBV基因检测具有良好的重复性、灵敏度和较宽的线性范围。5.FTA-RPA-ECL方法对临床HBV血清样本检测分析,结果表明电化学发光响应强度在20—2×105 IU/mL浓度之间呈现良好的线性关系,检出限为0.2 IU/mL（S/N>3）;相对标准偏差分别为1.94%、2.03%和2.32%。检测结果与实时荧光定量PCR结果相对偏差范围在-8%—12%之间。提示FTA-RPA-ECL方法对临床HBV血清样本的检测具有较高的准确度和重复性。总之,利用FTA卡进行空气气溶胶病原体采样,可实现采样与核酸提取一体化操作,简化整体检测过程。基于RPA和纸基ECL的核酸检测技术具有特异、简便、灵敏及快速等特点。因此,本研究构建的基于FTA卡的生物气溶胶采样方法,结合RPA和纸基电化学发光（ECL）技术,有望为生物气溶胶中病毒的快速和实时现场检测技术研发提供新途径。
杨英超[7]（2019）在《利用CRISPR/Cas9技术建立删除Pfhrp2基因恶性疟原虫参考虫株及其对快速诊断试剂的影响研究》文中研究指明疟疾（Malaria）是全球广泛关注的重要公共卫生问题之一。该病是由蚊虫叮咬后子孢子（Sporozoites）进入人体从而引起疾病,可引起人类患病的疟原虫包括恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodiumvivax）、三日疟原虫（Plasmodium malarial）、卵形疟原虫（Plasmodium ovale）和诺氏疟原虫（Plasmodium knowlesi）。其中,恶性疟原虫致病力和危害最为严重,非洲大约99.7%的疟疾病例是由恶性疟原虫所导致的。根据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）疟疾报告,2017年全世界有2.19亿疟疾病例。在疟疾流行地区,某些病人在没有感染疟原虫的情况下可患有“疟疾样”发热,从而可导致错误使用抗疟药进行治疗。为防止抗疟药物滥用,世界卫生组织建议所有疑似疟疾病例的患者在使用抗疟药进行治疗之前需要使用显微镜或快速诊断试剂（Rapid diagnostic reagents,RDTs）来确诊。RDTs是采用双抗体夹心法原理定性检测人血中组氨酸富集蛋白2（Histidine-rich protein2,HRP2）用于恶性疟原虫的诊断。如果血样中含有HRP2抗原,将与金标抗HRP2抗体反应形成复合物,在层析作用下,被预先固定在膜上的抗HRP2抗体捕获,在检测区形成一条紫红色条带,此为阳性结果。由于RDTs操作简单,使用方便,成本低,结果可信而在全世界范围内被广泛应用。据WHO估算,2016年全球共交付3.12亿份RDTs,其中2.69亿份RDTs被在非洲地区使用。2010年在秘鲁亚马逊地区首次报道发现缺失Pfhrp基因的恶性疟原虫株。随后,在巴西、马里、塞内加尔和印度均有报道发现了缺失Pfhrp2基因的野生株。再有,位于恶性疟原虫PF3D7的13号染色体的Pfhrp3基因也富含组氨酸序列,因而其对于主要检测恶性疟原虫PfHRP2抗原的RDTs可能具有辅助作用。鉴于PfHRP2蛋白的有无,大小和所含的特征性重复序列存在诸多变异并可影响快速诊断试剂,因此获得缺失或删除Pfhrp基因的恶性疟原虫以便考核与评价以HRP2为基础的RDTs,基于考核结果对以HRP2为基础的RDTs提出建议。由于收集的恶性疟原虫感染者的血液样本中未发现缺失Pfhrp2基因的虫株,且随着基因编辑技术尤其是 CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9）方法取得的极大进步,有鉴于此,本课题组选择遗传背景清楚的恶性疟原虫国际标准株PF3D7,采用CRISPR-Cas9方法来特异性删除该恶性疟原虫国际标准株的hrp基因外显子2（exon 2）区域,包括设计了一个含有特异性sgRNA（single guide RNA）和重组同源臂及一个含有Cas9核酸内切酶共计两个质粒,电转化入疟原虫后,sgRNA可将Cas9酶靶向至Pfhrp2基因从而产生缺口诱发同源重组,经药物筛选后获得基因删除的疟原虫。随后提取转基因疟原虫的基因组DNA进行聚合酶链式反应,基因测序,蛋白免疫印迹（Western blot,WB）和Southern印迹（Southern blot）等试验证明了Pfhrp2 基因被从恶性疟原虫基因组删除,成功获得了删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫参考虫株。使用删除Pfhrp2的恶性疟原虫来考评已经获得国家药品监管机构批准的用于快速诊断恶性疟原虫感染的基于HRP2的RDTs。检测结果发现,若血液中含有删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫低于1000个虫/微升,则基于HRP2的RDTs不能检测出恶性疟原虫感染。若血液中删除Pfhrp2基因的恶性疟原虫大于等于1000寄生虫/微升,则基于HRP2的RDTs仍可检出恶性疟原虫感染。为了深入研究在删除Pfhrp2基因后,应用以HRP2为基础的RDTs仍可检出患者感染恶性疟原虫这一疑问,本课题组重组表达了与HRP2高度同源的HRP3（Histidine-rich protein 3,HRP3）蛋白来开展研究。WB试验结果表明,无细胞蛋白表达系统成功制备了HRP3蛋白,证明了 HRP3蛋白可与识别HRP2蛋白的单克隆抗体结合,证实了HRP3蛋白的辅助诊断作用。综上所述,试验结果证实使用CRISPR-Cas9方法可在实验室建立删除Pfhrp2基因且遗传背景清楚的恶性疟原虫参考虫株;使用基因删除虫株考核基于HRP2的RDTs时,若恶性疟原虫的染虫率较低时,基于HRP2的RDTs可产生假阴性结果;若恶性疟原虫的染虫率较高时,基于HRP2的RDTs检测仍可获得阳性结果,可能的原因是HRP3辅助诊断恶性疟原虫感染。基于这些结果,恶性疟原虫流行区仍可继续使用基于HRP2的RDTs进行疾病诊断,若出现疑似假阴性的检测结果,应联合使用可检测其它抗原的RDTs再次检测以避免做出错误诊断。
丁梦玥[8]（2018）在《新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序》文中提出蓝舌病（Bluetongue,BT）是由蓝舌病病毒（BTV）引起的一种经由库蠓、伊蚊等媒介昆虫叮咬传播的严重侵害反刍动物的急性病毒性虫媒病。世界动物卫生组织（OIE）规定蓝舌病为法定上报传染病,我国规定为一类传染病。该病的死亡率一般在10%左右,由于近年来该病的发病率逐渐上升,已严重影响了动物贸易。该项目根据蓝舌病在新疆的流行病学史和媒介昆虫的习性,结合地理位置、气候特点、牧区分布等因素,选择新疆巴州尉犁县墩阔坦乡某场作为建立监控群的监控点,于2016年对年龄小于1岁的家畜进行筛选后,选取BT检测结果为阴性的10头牛、10只山羊和10只绵羊作为哨兵动物建立监控群。每周采集监控动物群血样一次,每次采集普通采血管（分离血清）、肝素钠抗凝采血管和EDTA抗凝采血管共3管,从2016年6月28日开始到2016年12月6日共采样21次,采集血清492份。用BTV竞争ELISA试剂盒检测血清BTV抗体,将所有采集的监控动物群血样接种于BHK-21细胞、Vero细胞和C6/36细胞进行BTV分离,每日观察记录细胞是否病变。对出现细胞病变（CPE）的细胞液进行鉴定;群特异性鉴定采用BTV抗原捕获ELISA（AC-ELISA）、RT-PCR扩增BTV VP7片段以及免疫电镜观察方法;型特异性鉴定采用病毒中和试验;对分离到的BTV（4630号样品）进行全基因测序和初步分析。用BTV竞争性ELISA检测了血清492份,总阳性率为0.41%（2/492）,山羊的阳性率为1.29%（2/155）,转阳时间是10月10日和10月17日,监控动物群中的绵羊、牛未发生转阳。将492份血样接种细胞后,有18份样品出现CPE,其中有12份样品在盲传至第3代的第3天出现CPE,有6份样品在盲传至第4代的第3天出现CPE,出现CPE的18份样品有4份样品来源于牛。对18份CPE样品进行AC-ELISA检测,结果显示都为BTV阳性。对4份牛源样品进行BTV VP7 RT-PCR的扩增,在1100 bp处出现条带单一的目标条带。对4份牛源样品测定TCID50,TCID50在10-3.25/0.1m L至10-4.33/0.1 m L之间。对牛源4630号样品进行中和试验,结果显示,4630号样品与BTV-1～BTV-24型标准血清无中和反应,不属于BTV-1～BTV-24型,进行免疫电镜观察,可观察到具有环状病毒属病毒形态典型特征的病毒颗粒。对分离株BTV/XJYL/2016/01进行全基因组的测序,测序结果说明BTV/XJYL/2016/01毒株与新疆分离的BTV V196毒株和XJ1407毒株相似度最高,BTV/XJYL/2016/01毒株确实为蓝舌病病毒且为新的血清型,是新疆首次从牛上分离的蓝舌病毒。
赵俸涌[9]（2017）在《大熊猫输血基础研究》文中研究表明大熊猫作为中国特有的珍稀动物,一度濒临灭绝的边缘。经过多年有效的保护,目前已由濒危水平降至易危水平。医疗救治是大熊猫保护的重要环节,而输血则是医疗救治中不可缺少的手段。对现有大熊猫死亡病例（n=71）的分析发现,大约有20%的死亡病例（急性慢性疾病造成的贫血）可以通过输血得到救治的。对大熊猫输血治疗病例记录总结后发现,以输血方式提高病患大熊猫血红蛋白含量的治疗方法,使得大部分患病大熊猫得到了救治,但出现输血反应及输血后死亡各一例（发生概率约5%）;而未得到及时输血救治的7例患病大熊猫中,43%个体死亡,上述临床病例说明:首先,红细胞输注是挽救大熊猫生命的有效手段;其次:由于缺乏理论研究大熊猫输血目前仍存在较大风险。仅在万不得已的情况下对大熊猫进行输血救治,这一情况也导致通过不配合输注造成的临床输血免疫反应进而对大熊猫血型进行研究的几率大大降低。若能对大熊猫红细胞功能、输血相关的红细胞保存及免疫血液学特性进行系统研究,将降低大熊猫输血不良反应风险,有助于更系统科学的进行大熊猫输血治疗,使其真正成为大熊猫日常医疗手段以挽救更多生命。红细胞体外保存是红细胞输注的前提条件。在本研究中发现,大熊猫红细胞如使用人类红细胞保存液进行保存,约一周即会出现较严重的溶血现象。究其原因主要是大熊猫血液生理特性与人类有所差异,故本研究依据文献报道补充测定了与大熊猫红细胞保存密切相关的pH值、血浆渗透压、红细胞脆性区间及血气分析等大熊猫血液生理学指标,最终配制了适合大熊猫的红细胞体外保存液（4℃）。对该保存液进行评估后证明保存液可有效保存大熊猫红细胞达30天。大熊猫红细胞免疫特性是决定大熊猫红细胞输注的关键问题,大熊猫与其异种血源亚洲黑熊的红细胞红细胞免疫特性尚无系统性研究。因此,本研究探索了不同个体的大熊猫之间及其与亚洲黑熊间血液的相容性,并进一步使用哺乳类红细胞膜保守蛋白相对应的人类血型抗体对大熊猫及其潜在的异种供血者亚洲黑熊红细胞进行免疫血液学分析。在不同大熊猫的血液相容性试验中（配合性实验/交叉配血试验）（n=17）发现:大熊猫同种异体间存在弱凝集现象,4℃条件下凝集加强,4℃条件下大熊猫同种异体间的配合率是71.11%,亚洲黑熊的同种异体间交叉配血实验显示（n=40）:5只亚洲黑熊血浆与其他绝大部分亚洲黑熊红细胞发生凝集,呈现3种血清学格局;大熊猫与亚洲黑熊间的异种交叉配血实验中发现:大熊猫（n=17）与亚洲黑熊（n=10）的异种交叉配血中亦存在凝集现象,上述血清学结果说明提示:大熊猫存在疑似血型抗原物质、亚洲黑熊至少存在三种疑似血型抗原。在对大熊猫红细胞疑似血型抗原物质的研究中,使用人类血清学血型定型试剂对大熊猫及亚洲黑熊红细胞进行进一步研究,并使用人类及小鼠天然血浆作为对照试验。实验结果表明:一、使用人源性抗血清无法避免种间抗体对实验结果的干扰,故文献中报道大熊猫红细胞存在类似人类M抗原的报道有误（刁玉英,1989）;二、现有人类ABO血型检测试剂无法检测出大熊猫红细胞上存在人类ABO血型糖蛋白类似结构,无法得到文献中大熊猫红细胞类似人类O型红细胞的结论（王德春,1999）。三、人类抗-B单克隆抗体血型试剂与不同亚洲黑熊存在不同的反应性。红细胞膜蛋白对于红细胞功能及免疫原性有重要作用,故针对大熊猫红细胞生理特性及免疫血液学特性,本研究对大熊猫红细胞膜进行了蛋白及基因水平的分子研究。对大熊猫红细胞血液生理特性的研究中发现,与亚洲黑熊相比,大熊猫血液红细胞计数较少/压积较小（单位体积血液中红细胞数目较少）,而二者同属熊科动物,个体平均体重接近,大熊猫如何利用较少数目的红细胞完成全身气体交换等红细胞功能的维持,是否因为其红细胞代谢和膜蛋白组成与亚洲黑熊有所差异?在本研究中,首先通过对大熊猫全血分选,获得较纯大熊猫红细胞;进而通过反向液相色谱联用质谱（LC-MS/MS）分析大熊猫与亚洲黑熊红细胞膜蛋白,鉴定出大熊猫红细胞膜上存在388种蛋白,亚洲黑熊红细胞膜上存在315种蛋白;最终在大熊猫膜蛋白与亚洲黑熊膜蛋白质谱结果的比对中,发现了大熊猫在糖酵解过程中有以下酶类:己糖激酶X2（占共有酶类的33.3%）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（占共有酶类50%）、乙酰辅酶A合成酶2及ATP结合盒式蛋白（ABC Transporter）:ABCB6、ABCB8（占共有ABCB家族的18.2%）,ABCC1（占共有ABCC家族的7.6%）等代谢途径相关蛋白比亚洲黑熊更丰富,说明其红细胞在代谢水平上效率更高,在进一步使用数据量及功能分析更全面的人类蛋白数据库解析后,发现大熊猫与亚洲黑熊的红细胞差异膜蛋白除能量代谢外还参与了O2/CO2气体交换（碳酸酐酶I、Rh TypeA蛋白）,使得大熊猫可以以较少红细胞维持机体气体交换,从而揭示了大熊猫红细胞较亚洲黑熊红细胞具有的独特功能特性及其导致的大熊猫红细胞计数/红细胞压积较小的血液生理特性。同时,由于大熊猫蛋白图谱尚未建立,为了验证质谱结果,本研究对大熊猫带3蛋白编码序列（SLC4A1）全长进行了扩增和克隆,一方面通过其序列及功能域分析,确定大熊猫带3蛋白的存在,证明了质谱结果对大熊猫红细胞膜带3蛋白的检出,证明了质谱实验的准确性;另一方面,以功能结构域分析了大熊猫带3蛋白的功能并基于红细胞保守蛋白——带3蛋白分析了大熊猫进化上与其他熊科动物最为接近,但存在差异。综上所述,血液输注是大熊猫救治的重要手段,但目前大熊猫输血体系研究不足,本研究根据大熊猫血样资源有限、血样获得困难的现状,针对大熊猫输血中的关键问题设计实验开展研究,以大熊猫血液保存为起点并作为后续工作的基础,进一步分析了大熊猫及其异种血源亚洲黑熊红细胞免疫血液学特性、并利用质谱技术分析了二者红细胞血液生理差异及红细胞代谢差异之间的关系,为大熊猫红细胞功能及红细胞膜蛋白研究奠定了基础,为大熊猫红细胞输注提供理论依据和实践方法。
邢骅[10]（2015）在《疟原虫分子诊断新方法及恶性疟富组氨酸蛋白2基因（Pfhrp2）多态性分析》文中研究指明疟疾（Malaria）是由寄生人体的疟原虫引发的传染病,与艾滋病、结核一起被世界卫生组织（WHO）列为全球三大公共卫生问题。疟疾的治愈与消除受到全球普遍关注。疟疾临床诊断主要依赖于镜检和免疫学快速检测（RDT）方法。然而,镜检诊断灵敏度低,对于有经验的镜检人员依赖性较重；免疫学方法受环境条件及疟原虫多态性的影响较大且对低原虫密度的误诊率较高,新近有研究认为特定基因（pfhrp2）的缺失会影响诊断灵敏度等缺点。在分子诊断方法中,PCR技术因具有灵敏度高、特异性强等优点,能够对不同的疟原虫种类进行准确检测诊断。但是该方法由于昂贵的成本,模板制备的高要求及繁琐操作,使得该技术在大规模疟疾流行性调查中的应用受到限制。本研究针对目前疟原虫检测诊断中存在的问题,开发疟原虫诊断新方法和改进检测手段。并对特定地区的pfhrp2基因多态性进行了分析,以期为该地区免疫学快速检测方法的使用提供理论依据。（1）本研究首先建立了一种直接使用经saponin常温处理的疟原虫滤纸血样品作为DNA模板的疟原虫PCR检测方法（FP-PCR）,将单样本模板制备的时间由使用Qiagen试剂盒提取所需的90-100 min缩短至10-12 min,大大提高了检测的时效性,并将制备成本减少至原来的四十分之一,有效降低了检测费用。该方法的检出限达到0.2寄生虫/μL,比目前临床普遍采用的镜检方法高50倍。同时,模板制备时不需加热过程,避免了样本的交叉污染。（2）其次,在简化PCR反应中模板制备的繁琐操作及降低成本的基础上,进一步优化套式PCR第二步反应体系,将原先的分四管反应鉴定不同疟原虫种简化为单管一个反应体系内同时鉴定四种不同疟原虫,建立了一个混合体系的疟原虫PCR诊断技术（Multi-FP-PCR），该方法具有降低反应数、减少试剂消耗的优点,将PCR反应的检测时间缩短一半以上,其重新优化的特异性引物扩增结果差异显着,提高了检测的临床操作性。（3）同时,本研究还对恶性疟原虫hrp2基因的多态性和缺失情况进行了探究,发现4例缺失虫株。对于恶性疟原虫hrp2基因是否会对RDT的灵敏度造成影响,需要更加深入的研究。
二、不同血样收集和模板制备方法聚合酶链反应检测疟疾比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同血样收集和模板制备方法聚合酶链反应检测疟疾比较（论文提纲范文）
（1）人CYP2D6基因编码区遗传多态与云南省间日疟复发的关联性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语中英对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 疟疾的流行趋势和防治现状 |
| 1.2 间日疟复发及其治疗研究进展 |
| 1.3 CYP2D6 的基因多态性与间日疟复发 |
| 1.4 本课题研究内容及其意义 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 研究对象与样本采集 |
| 2.2.1 间日疟疑似复发与未复发判断标准 |
| 2.2.2 研究对象及血样采集 |
| 2.2.3 病例样本来源诊断标准及使用流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验前准备 |
| 2.3.2 基因组DNA提取 |
| 2.3.3 人基因组DNA引物设计 |
| 2.3.4 目的基因片段PCR扩增及反应条件 |
| 2.3.5 PCR产物进行水平式琼脂糖凝胶电泳分离人基因组DNA |
| 2.4 数据分析处理 |
| 2.4.1 目的基因PCR扩增产物序列整理分析 |
| 2.4.2 CYP2D6 基因的等位类型识别和命名 |
| 2.4.3 CYP2D6 基因的突变与间日疟复发的关联程度统计学分析 |
| 2.4.4 CYP2D6 基因的酶活性预测 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 样本信息 |
| 3.2 CYP2D6 基因外显子exon1~9 编码区的PCR扩增 |
| 3.3 CYP2D6 基因CDS链的多态性分析 |
| 3.3.1 CYP2D6 基因CDS链的位点多态性分析 |
| 3.3.2 CYP2D6 基因CDS链的单倍型多样性分析 |
| 3.3.3 CYP2D6 基因的等位类型及其频率分析 |
| 3.3.4 CYP2D6 基因的基因型及其频率分析 |
| 3.4 CYP2D6 全基因编码区多样化选择效应 |
| 3.5 CYP2D6 基因突变与间日疟复发的关联性 |
| 3.5.1 CYP2D6 基因的位点突变与间日疟复发的关联性 |
| 3.5.2 CYP2D6 基因的等位基因与间日疟复发的关联性 |
| 3.5.3 CYP2D6 基因的基因型与间日疟复发的关联性 |
| 3.6 CYP2D6 基因的酶活性预测结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 课题背景及意义 |
| 1.1.1 核酸检测技术在分子诊断方面的应用 |
| 1.1.2 农副产品中动植物病菌快速检测的重要性 |
| 1.1.3 本节小结 |
| 1.2 核酸扩增检测技术的原理和基本流程 |
| 1.2.1 核酸提取 |
| 1.2.2 核酸扩增 |
| 1.2.3 核酸扩增子检测 |
| 1.2.4 本节小结 |
| 1.3 新型核酸检测分析方法的研究进展 |
| 1.3.1 核酸气溶胶污染防止办法 |
| 1.3.2 快速PCR技术的应用 |
| 1.3.3 免扩增的核酸分析方法 |
| 1.3.4 新型探针技术的应用 |
| 1.3.5 基因编辑技术的应用 |
| 1.3.6 本节小结 |
| 1.4 核酸检测技术目前面临的问题 |
| 1.5 研究目的、内容和技术路线 |
| 1.5.1 研究目的和内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 基于分子信标和快速PCR的双重荧光可视化检测方法的建立 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 对虾IHHNV病毒标准PCR检测方法建立 |
| 2.3.2 快速PCR体系循环时间参数探索 |
| 2.3.3 分子信标用于可视化检测条件探索 |
| 2.3.4 可视化检测平台灵敏度与特异性评估 |
| 2.3.5 可视化检测平台应用于双重检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 基于基因编辑技术的防污染核酸荧光可视化检测方法的建立 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料和试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 针对柑橘黄龙病菌的LAMP扩增体系 |
| 3.3.2 Cas12a效应蛋白新PAM序列可行性分析 |
| 3.3.3 基于Cas12a效应蛋白的荧光可视化检测体系 |
| 3.3.4 基于UDG酶消解的防污染核酸检测体系 |
| 3.3.5 防污染荧光可视化核酸分析平台的搭建 |
| 3.3.6 防污染荧光可视化核酸分析平台灵敏度评估 |
| 3.3.7 防污染荧光可视化核酸分析平台用于柑橘黄龙病菌检测 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 基于玻璃化CRISPR及免样本提取的荧光可视化核酸分析方法的建立 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 针对非洲猪瘟病毒的LAMP扩增体系 |
| 4.3.2 免样本提取的恒温核酸扩增体系 |
| 4.3.3 针对非洲猪瘟病毒的CRISPR/Cas12a检测体系 |
| 4.3.4 普鲁兰糖和海藻糖用于对CRISPR体系的保护 |
| 4.3.5 玻璃化的CRISPR薄膜加速老化试验 |
| 4.3.6 免样本提取可视化核酸分析平台搭建 |
| 4.3.7 免样本提取可视化核酸分析平台用于非洲猪瘟病毒检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要研究结论 |
| 5.2 主要创新点 |
| 5.3 进一步研究展望 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
（3）基于等温扩增技术构建microRNA纳米检测传感器的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 miRNA概述 |
| 1.2.1 疾病生物标志物miRNA |
| 1.2.2 miRNA检测技术的发展 |
| 1.3 等温扩增技术概述 |
| 1.3.1 聚合酶加尾等温扩增技术 |
| 1.3.2 链置换等温扩增技术 |
| 1.3.3 其他等温扩增技术 |
| 1.4 纳米检测传感器概述 |
| 1.4.1 磁性纳米检测传感器 |
| 1.4.2 金纳米检测传感器 |
| 1.4.3 其他纳米检测传感器 |
| 1.5 本论文的研究思路 |
| 第2章 基于Poly(A)聚合酶加尾等温扩增技术构建超灵敏生物循环发光miRNA磁性纳米检测传感器的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 方法与步骤 |
| 2.3.1 制备磁球探针分离并富集目标miRNA |
| 2.3.2 基于Poly(A)聚合酶加尾等温扩增技术构建超灵敏生物循环发光磁性纳米检测传感器的可行性研究 |
| 2.3.3 磁性纳米检测传感器反应条件优化 |
| 2.3.4 磁性纳米检测传感器定量检测miRNA-21 的研究 |
| 2.3.5 磁性纳米检测传感器检测miRNA-21 的特异性实验研究 |
| 2.3.6 磁性纳米检测传感器检测miRNA-21 的可重复性使用研究 |
| 2.3.7 磁性纳米检测传感器实际样本中miRNA-21 的检测研究 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 基于Poly(A)聚合酶加尾等温扩增技术构建超灵敏生物循环发光磁性纳米检测传感器超灵敏检测miRNA-21 的机理 |
| 2.4.2 特异性识别miRNA-21的DNA探针的设计 |
| 2.4.3 磁性纳米检测传感器检测miRNA可行性研究 |
| 2.4.4 磁性纳米检测传感器用于检测miRNA-21 的反应条件优化 |
| 2.4.5 Poly(A)聚合酶加尾等温扩增技术放大检测信号的研究 |
| 2.4.6 磁性纳米检测传感器定量检测miRNA-21 的研究 |
| 2.4.7 磁性纳米检测传感器性能的研究 |
| 2.4.8 磁性纳米检测传感器应用于实际样品的检测 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 基于链置换等温扩增技术构建快速便携式miRNA金纳米反向荧光增强检测试纸条的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 仪器设备 |
| 3.3 方法与步骤 |
| 3.3.1 不同粒径AuNP的制备 |
| 3.3.2 高荧光猝灭AuNP@h DNA-BHQ2 检测探针的制备 |
| 3.3.3 反向荧光增强试纸条(rLFTS)的制备 |
| 3.3.4 基于链置换等温扩增技术构建快速便携式金纳米反向荧光增强检测试纸条的研究(ISAR-rLFTS)用于miRNA检测的可行性研究 |
| 3.3.5 ISAR-rLFTS用于检测miRNA的反应条件优化 |
| 3.3.6 ISAR-rLFTS于定量检测miRNA的研究 |
| 3.3.7 ISAR-rLFTS对同一样品中miRNA-5010和miRNA-331 同步检测的研究 |
| 3.3.8 ISAR-rLFTS检测miRNA-5010和miRNA-331 特异性的研究 |
| 3.3.9 ISAR-rLFTS检测实际样本中miRNA的研究 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 基于链置换等温扩增技术构建快速便携式金纳米反向荧光增强检测试纸条(ISAR-rLFTS)同时检测miRNA-5010和miRNA-331 的机理 |
| 3.4.2 ISAR-rLFTS检测miRNA的可行性研究 |
| 3.4.3 ISAR-rLFTS检测miRNA的反应条件优化 |
| 3.4.4 ISAR-rLFTS定量检测miRNA-5010 的研究 |
| 3.4.5 ISAR-rLFTS实现miRNA-5010和miRNA-331 共存时同步检测的研究 |
| 3.4.6 ISAR-rLFTS检测miRNA-5010和miRNA-331 特异性的研究 |
| 3.4.7 ISAR-rLFTS检测实际样本中miRNA-5010和miRNA-331 的研究 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 基于链置换等温扩增及CRISPR-Cas12a信号放大技术构建超灵敏便携式miRNA金纳米反向荧光增强检测试纸条的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 仪器设备 |
| 4.3 方法与步骤 |
| 4.3.1 金纳米粒子检测探针的制备 |
| 4.3.2 金纳米颗粒反向荧光增强检测试纸条的制备 |
| 4.3.3 核酸等温链置换扩增(ISAR)和Cas12a反应用于miRNA检测的信号放大 |
| 4.3.4 基于ISAR及 CRISPR-Cas12a技术构建超灵敏便携式miRNA金纳米反向荧光增强检测试纸条的可行性研究(CRISPR-rLFTS) |
| 4.3.5 CRISPR-rLFTS检测miRNA条件优化 |
| 4.3.6 CRISPR-rLFTS定量检测miRNA的研究 |
| 4.3.7 CRISPR-rLFTS检测miRNA-31 特异性的研究 |
| 4.3.8 CRISPR-rLFTS实际样本检测的研究 |
| 4.3.9 CRISPR-rLFTS储存稳定性的研究 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 基于ISAR和 CRISPR-Cas12a技术构建的超灵敏便携式反向荧光增强检测试纸条检测miRNA的机理(CRISPR-rLFTS) |
| 4.4.2 CRISPR-rLFTS用于miRNA检测的可行性分析 |
| 4.4.3 CRISPR-rLFTS检测miRNA反应条件优化 |
| 4.4.4 CRISPR-rLFTS定量检测miRNA-31 的研究 |
| 4.4.5 CRISPR-rLFTS检测miRNA-31 特异性的研究 |
| 4.4.6 CRISPR-rLFTS检测实际样本中miRNA-31 的研究 |
| 4.4.7 CRISPR-rLFTS用于miRNA-31 检测的稳定性研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 全文结论及展望 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（4）云南省间日疟患者G6PD基因编码区突变与伯氨喹服用人群溶血发生的相关性初步分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语中英对照表 |
| 1.前言 |
| 1.1 疟疾的流行现状 |
| 1.2 G6PD基因突变现状 |
| 1.3 G6PD突变基因型与伯氨喹溶血 |
| 1.4 本课题研究目的及研究意义 |
| 2.实验材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与实验试剂 |
| 2.1.1 主要实验仪器 |
| 2.1.2 主要实验试剂/试剂盒 |
| 2.1.2.1 基因组DNA提取试剂 |
| 2.1.2.2 PCR扩增试剂 |
| 2.1.2.3 电泳试剂 |
| 2.1.2.4 引物合成 |
| 2.1.2.5 基因测序 |
| 2.1.3 试剂配制 |
| 2.2 研究对象及样本采集 |
| 2.2.1 伯氨喹诱发溶血判断标准 |
| 2.2.2 研究对象分布及样本制作 |
| 2.2.3 病例样本来源诊断标准及使用流程 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 实验前准备 |
| 2.3.2 滤纸血样本中人基因组DNA提取 |
| 2.3.3 人基因组DNA引物设计及PCR扩增基因组DNA反应条件 |
| 2.3.4 目的基因片段PCR扩增 |
| 2.3.5 PCR产物进行水平式琼脂糖凝胶电泳分离人基因组DNA |
| 2.4 数据分析处理 |
| 2.4.1 目的基因PCR扩增产物的序列分析 |
| 2.4.2 实验结果的统计学分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 样本信息 |
| 3.1.1 G6PD基因c DNA链的样本信息 |
| 3.2 G6PD基因外显子exon2~13 编码区的PCR扩增 |
| 3.3 G6PD基因c DNA序列的多态性分析 |
| 3.3.1 G6PD基因c DNA序列的突变类型及其构成比分析 |
| 3.3.2 G6PD基因c DNA序列的位点多态性分析 |
| 3.3.3 G6PD基因c DNA序列的不同单倍型分析 |
| 3.3.4 G6PD基因c DNA序列的不同基因型分析 |
| 3.4 G6PD基因外显子exon2~13 编码区的多样化选择效应 |
| 3.5 G6PD基因c DNA序列位点突变与出现伯氨喹诱发溶血的关联性 |
| 3.6 G6PD基因外显子exon10~13 的样本信息 |
| 3.7 G6PD基因外显子exon10~13 编码区的PCR扩增 |
| 3.8 G6PD基因外显子exon10~13 编码区核苷酸序列的多态性分析 |
| 3.8.1 G6PD基因外显子exon10~13 编码区的位点多态性分析 |
| 3.8.2 G6PD基因外显子exon10~13 编码区的不同单倍型分析 |
| 3.8.3 G6PD基因外显子exon10~13 编码区的不同基因型分析 |
| 3.9 外显子exon10~13编码区的多样化选择效应 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（5）中缅边境疟疾无症状感染者流行病学特征研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1. 研究背景及依据 |
| 2. 研究目的 |
| 3. 研究内容 |
| 4. 研究路线 |
| 参考文献 |
| 第一部分 疟疾无症状感染水平横断面研究 |
| 第一章 不同检测方法对疟疾无症状感染检出率的比较研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 疟疾无症状感染水平横断面研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 小结 |
| 第二部分 疟疾无症状感染者流行病学特征及影响因素研究 |
| 第一章 中缅边境无症状感染者人群流行病学特征研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 宿主TLR基因多态性对疟疾无症状感染影响研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 疟原虫抗性分子标记多态性特征研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 小结 |
| 第三部分 疟疾无症状感染持续时间队列研究 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 小结 |
| 研究总结 |
| 附录 |
| 附录1 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 附录2 横断面研究调查问卷 |
| 附录3 队列研究调查问卷 |
| 综述 疟疾无症状感染者流行病学特征及其影响因素研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）基于RPA和ECL的生物气溶胶核酸检测方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 常见的空气气溶胶态病原体 |
| 1.1.1 病毒 |
| 1.1.2 细菌 |
| 1.2 气溶胶病原体采样方法研究进展 |
| 1.2.1 传统采样方法 |
| 1.2.2 新型采样技术 |
| 1.3 FTA技术原理及应用 |
| 1.4 空气气溶胶病原体检测方法 |
| 1.4.1 细胞培养菌落计数法 |
| 1.4.2 免疫检测法 |
| 1.4.3 分子核酸检测法 |
| 1.4.4 其它检测技术 |
| 1.4.5 空气病原体采样检测的难点 |
| 1.5 恒温扩增技术介绍及应用 |
| 1.5.1 环介导等温扩增技术 |
| 1.5.2 重组聚合酶扩增技术 |
| 1.6 电化学发光(ECL)原理及应用 |
| 1.6.1 湮灭式ECL |
| 1.6.2 共反应物式ECL |
| 1.7 本课题研究意义及技术路线 |
| 1.7.1 研究意义 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 第二章 基于FTA卡的生物气溶胶采样系统构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 气溶胶采样系统构建 |
| 2.3.2 含HBV基因质粒的大肠杆菌培养、质粒提取及浓度测定 |
| 2.3.3 FTA卡采集气溶胶HBV质粒及样本洗脱 |
| 2.3.4 引物设计 |
| 2.3.5 FTA卡HBV质粒样本检测 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 气溶胶发生器相关特性表征 |
| 2.4.2 FTA卡采样效果评估 |
| 2.4.3 FTA卡HBV质粒检测结果 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 基于重组聚合酶扩增和纸基电化学发光的核酸检测方法 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 三联吡啶钌标记引物 |
| 3.3.2 重组聚合酶扩增反应参数优化 |
| 3.3.3 纸基电化学发光检测扩增核酸 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 三联吡啶钌标记引物及表征 |
| 3.4.2 重组聚合酶扩增反应相关条件优化结果 |
| 3.4.3 链霉亲和素磁珠对电化学发光检测的影响 |
| 3.4.4 纸基电化学发光响应特性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 基于FTA—RPA—ECL方法检测HBV血清样本 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 基于FTA-RPA-ECL方法检测HBV血清样本 |
| 4.3.2 基于实时荧光定量PCR方法检测HBV血清样本 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 纸基电化学发光响应特性 |
| 4.4.2 HBV血清样本检测结果分析 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、不足与展望 |
| 三、本论文的创新之处 |
| 四、本研究应用价值 |
| 参考文献 |
| 攻读博士/硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（7）利用CRISPR/Cas9技术建立删除Pfhrp2基因恶性疟原虫参考虫株及其对快速诊断试剂的影响研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 研究背景及意义 |
| 研究目标 |
| 研究内容及技术路线 |
| 第一阶段 |
| 第二阶段 |
| 第三阶段 |
| 第一部分 删除hrp2基因恶性疟原虫参考虫株的建立及验证 |
| 1 目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 删除hrp2基因恶性疟原虫L2图片 |
| 3.2 测序结果 |
| 3.3 恶性疟原虫3D7、L2虫株WB试验 |
| 3.4 Southem blot结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 对以HRP2为基础的RDTs的评价研究 |
| 1 目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 RDTs检测结果 |
| 3.2 评分结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 组氨酸富集蛋白2和组氨酸富集蛋白3无细胞表达和验证 |
| 1 目的 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组蛋白质的表达 |
| 3.2 Western blot结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 1 删除hrp2基因恶性疟原虫参考虫株的建立及验证 |
| 2 对以HRP2为基础的RDTs的评价研究 |
| 3 组氨酸富集蛋白2和组氨酸富集蛋白3无细胞表达和验证 |
| 结论 |
| 1 删除hrp2基因恶性疟原虫参考虫株的建立及验证 |
| 2 对以HRP2为基础的RDTs的评价研究 |
| 3 组氨酸富集蛋白2和组氨酸富集蛋白3无细胞表达和验证 |
| 文献综述 |
| 综述一 恶性疟原虫HRP2/3蛋白、国际标准品及RDTs性能测试 |
| 1 HRP2/3蛋白简介 |
| 2 RDTs简介 |
| 3 恶性疟原虫诊断试剂用国际标准品的建立 |
| 4 RDTs性能测试简介 |
| 综述二 基因编辑技术及其在疟原虫研究中的应用 |
| 1 背景 |
| 2 基于工程化核酸酶的基因编辑技术 |
| 3 Crispr/Cas9基因编辑技术 |
| 4 Crispr/Cas9基因编辑技术在疟原虫研究中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1 HRPⅡ-L2-3-2质粒完整序列 |
| 2 pUF1-BSD-Cas9质粒完整序列 |
| 作者简介及发表的文章 |
| 导师简介 |
| 致谢 |
（8）新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 病毒的结构 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 致病机理、临床症状和病理变化 |
| 1.5 检测方法 |
| 1.6 疫苗 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第2章 新疆巴州尉犁县哨兵动物血清学检测 |
| 2.1 建立监控群 |
| 2.2 血清学检测 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 新疆巴州尉犁县哨兵动物BTV的分离 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 新疆巴州尉犁县哨兵动物牛源BTV分离株的鉴定 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 新疆巴州尉犁县哨兵动物牛源BTV分离株的全基因组测序 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（9）大熊猫输血基础研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 大熊猫血液生理及红细胞体外保存研究 |
| 第一节 前言 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究目的 |
| 三、实验设计 |
| 第二节 实验材料及试剂 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析及讨论 |
| 第三章 大熊猫红细胞免疫血液学特性研究 |
| 第一节 前言 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究目的 |
| 三、实验设计 |
| 第二节 实验材料及试剂配方 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析和讨论 |
| 第四章 大熊猫红细胞膜蛋白功能特性研究 |
| 第一节 前言 |
| 一、研究背景 |
| 二、研究目的 |
| 三、实验设计 |
| 第二节 实验材料及试剂配方 |
| 第三节 实验方法 |
| 第四节 实验结果 |
| 第五节 分析及讨论 |
| 第五章 总结 |
| 第一节 全文总结 |
| 第二节 未来展望 |
| 附录 |
| 附录1、本研究使用主要仪器设备 |
| 附录2、主要缩写列表 |
| 附录3、大熊猫临床检测用血样小样冻存方案建立 |
| 附录4、抗大熊猫及亚洲黑熊IgG抗体制备 |
| 附录5、亚洲黑熊交叉配血表 |
| 附录6、大熊猫、亚洲黑熊膜蛋白质谱鉴定结果 |
| 附录7、大熊猫带3 蛋白编码基因(SLC4A1)进化树总表 |
| 附录8、大熊猫及亚洲黑熊红细胞膜差异蛋白分析结果 |
| 附录9、大熊猫与亚洲黑熊红细胞计数(单位体积平均红细胞数目)/红细胞压积对比 |
| 附录10、大熊猫及亚洲黑熊血液非麻醉及麻醉采集 |
| 综述:大熊猫输血研究进展 |
| 一、大熊猫临床输血医疗进展 |
| 二、大熊猫输血医学基础研究现状 |
| 三、大熊猫输血未来展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（10）疟原虫分子诊断新方法及恶性疟富组氨酸蛋白2基因（Pfhrp2）多态性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 引言 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 疟疾的危害与发病机制 |
| 1.1.1 疟原虫分类及分布 |
| 1.1.2 疟原虫生活史 |
| 1.1.3 疟疾的发病机制 |
| 1.2 疟疾的治疗及预防 |
| 1.3 疟疾的诊断 |
| 1.3.1 病原学诊断 |
| 1.3.2 免疫学诊断 |
| 1.3.3 分子生物学诊断 |
| 1.4 疟原虫诊断技术发展现状 |
| 1.4.1 三种主要疟疾诊断手段优劣 |
| 1.4.2 PCR技术的临床应用 |
| 1.4.3 临床使用RDT遇到的问题 |
| 1.5 本研究目的和意义 |
| 2 疟原虫滤纸血样品聚合酶链式反应(FP-PCR)检测方法的建立与评估 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验试剂及主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 镜检 |
| 2.2.2 样品PCR反应模板的准备 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 PCR反应体系及条件 |
| 2.2.5 FP-PCR检出限 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 FP-PCR方法的检出限 |
| 2.3.2 204例疑似病人诊断结果 |
| 2.3.3 FP-PCR方法的评估 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 疟原虫滤纸血样品复式聚合酶链式反应(multi-FP-PCR)检测方法的建立与评估 |
| 3.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验试剂及主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 镜检 |
| 3.2.2 引物设计 |
| 3.2.3 复式滤纸血样PCR方法(Multi-FP-PCR)的建立 |
| 3.2.4 Multi-FP-PCR方法的评估 |
| 3.2.5 数据分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 Multi-FP-PCR方法建立 |
| 3.3.2 Multi-FP-PCR的诊断结果 |
| 3.3.3 Multi-FP-PCR方法的评估 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 恶性疟富组氨酸蛋白2基因(Pfhrp2)多态性分析 |
| 4.1 实验材料和试剂 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 试剂和仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 样品准备 |
| 4.2.2 引物设计 |
| 4.2.3 Pfhrp2和Pfhrp3基因扩增 |
| 4.2.4 Pfhrp2基因阴性样品基因分型 |
| 4.2.5 DNA测序及序列分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 Pfhrp2基因长度及缺失情况 |
| 4.3.2 Pfhrp2缺失与RDT诊断结果之间关系 |
| 4.3.3 Pfhrp2的氨基酸重复单元 |
| 4.3.4 基序的变异类型 |
| 4.3.5 基序排布的多样性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
四、不同血样收集和模板制备方法聚合酶链反应检测疟疾比较（论文参考文献）
- [1]人CYP2D6基因编码区遗传多态与云南省间日疟复发的关联性分析[D]. 黄和荣. 大理大学, 2021(09)
- [2]荧光可视化核酸检测技术及其在动植物病菌快速诊断中应用的研究[D]. 钱程. 浙江大学, 2021(01)
- [3]基于等温扩增技术构建microRNA纳米检测传感器的初步研究[D]. 陈明慧. 天津大学, 2020(01)
- [4]云南省间日疟患者G6PD基因编码区突变与伯氨喹服用人群溶血发生的相关性初步分析[D]. 刘淑萍. 大理大学, 2020(05)
- [5]中缅边境疟疾无症状感染者流行病学特征研究[D]. 王笑笑. 中国疾病预防控制中心, 2020
- [6]基于RPA和ECL的生物气溶胶核酸检测方法研究[D]. 夏舒. 华南理工大学, 2019(01)
- [7]利用CRISPR/Cas9技术建立删除Pfhrp2基因恶性疟原虫参考虫株及其对快速诊断试剂的影响研究[D]. 杨英超. 北京协和医学院, 2019(02)
- [8]新疆牛蓝舌病病毒的分离及全基因组测序[D]. 丁梦玥. 新疆农业大学, 2018(05)
- [9]大熊猫输血基础研究[D]. 赵俸涌. 华东师范大学, 2017(02)
- [10]疟原虫分子诊断新方法及恶性疟富组氨酸蛋白2基因（Pfhrp2）多态性分析[D]. 邢骅. 大连理工大学, 2015(03)