一、输血传播病毒(TTV)部分基因序列的克隆、表达、活性鉴定及临床病理学、流行病学的研究（论文文献综述）
陈柯[1]（2021）在《两株猪细环病毒的全基因组测序及分析》文中研究表明猪细环病毒（Torque teno sus virus,TTSuV）是一种小型环状单链负性DNA病毒,在猪群中广泛流行,目前有两种不同基因型感染猪群,两种基因型均可通过垂直和水平传播,且体内病毒含量随着年龄的增长有增加趋势。近年来,随着研究者对该病毒不断深入研究发现,TTSuV感染健康动物的比例逐渐增高,病毒自身感染后并不会立即引起疾病发生,但是该病毒会使猪只机体抵抗其他疾病的能力下降。尽管该病毒的致病性尚不能确定,但已有试验表明TTSuV对猪群高致病性病原体具有促进作用,给我国养殖行业造成重大的经济损失。为了解河南地区猪源TTSuV的遗传多样性,本研究对河南某养殖场采集的11份TTSuV组织病料进行PCR检测,将检测阳性的组织进行全基因组扩增,对扩增出的TTSuV全基因组序列进行遗传学分析,在线软件预测分析ORF1蛋白理化性质及基本结构;并将阳性样品进行病毒分离培养。结果发现TTSuV可在Marc145细胞上成功传代培养,为后续更好的了解TTSuV的遗传变异和生长特性提供数据支持,其致病性需进一步研究。使用PCR方法对10份阳性样品进行全基因组扩增,成功扩增出2株TTSuV1全基因组序列,使用生物信息学软件分析显示,2株分离株之间核苷酸相似性仅有86.2%,推导氨基酸相似性为77.7%;2株分离株与TTSuV1参考毒株核苷酸之间相似性在70.3%～96.0%之间,推导氨基酸相似性在56.2%～90.9%之间,与TTSuVk2参考毒株核苷酸之间相似性小于50%。与不同亚型参考毒株共同构建系统发育进化树,发现2株分离株均与TTSuV1c亚型毒株亲缘关系较近,处于同一分支,即2株分离株均为TTSuV1c亚型。基因重组软件分析发现,2株TTSuV1分离株均存在基因重组现象,且重组区域相似,西班牙株G21株为亲本毒株,中国LNJZ株提供重组片段。重组区域位于ORF1与ORF3部分重叠区域,He N1-A9重组位点位于2195～2530 bp,He N1-A11重组位点位于2147～2650 bp。使用Net NGlyc1.0、Net OGlyc3.1和Net Phos2.0等在线软件对2株TTSuV1分离株ORF1蛋白进行结构预测,结果显示,2株分离株ORF1均由648位氨基酸组成,不含有O糖基化位点,二级结构主要由α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲等组成,He N1-A9毒株含有4个糖基化位点和23个潜在的磷酸化位点,而He N1-A11含有1个N糖基化位点和35个潜在的磷酸化位点。对TTSuV1检测阳性的组织病料进行病毒分离,将10份阳性样品分别感染Marc145细胞进行病毒分离培养,He N1-A9毒株盲传至第5代观察到明显细胞病变（CPE）,进行半数组织细胞感染量(TCID50)的测定和动物致病性实验,结果表明,He N1-A9病毒株毒价约为105.0 TCID50,以2 m L 105.0TCID50/m L的TTSuV1病毒液对21 d仔猪进行攻毒,攻毒7 d后采血PCR检测TTSuV1阳性,进行序列测定,确定为He N1-A9毒株。饲养至28 d,未发现任何临床症状,剖检无明显病变。
卢赫[2]（2016）在《猪输血传播病毒Ⅰ型和Ⅱ型双重PCR方法的建立及应用》文中进行了进一步梳理目的针对猪输血传播病毒（PTTV）Ⅰ型和Ⅱ型全基因保守序列,设计2对特异性引物,建立双重PCR方法并对辽宁地区猪群进行感染情况调查,同时对全基因序列进行遗传变异分析,该结果为辽宁地区PTTV分子流行病学研究提供一定的理论依据。方法参照Gen Bank中PTTVI型（GU570202）和PTTVII型（AY823991）的全基因序列,应用Oligo7.0设计了两对特异性引物,在单重PCR的基础上,建立双重PCR检测方法,即同时区别PTTVI和PTTVII两种基因型的感染,并对双重PCR反应条件进行优化,通过特异性、敏感性和重复性试验验证该方法的准确性。利用所建立的PTTV双重PCR检测方法对辽宁地区14个市采集的血液样品进行检测,明确辽宁地区PTTV感染情况。采用PCR分段扩增PTTVI型和PTTVII型的全基因组,将PCR产物分别进行克隆测序,利用DNAMAN6.0软件进行拼接获得全基因组序列,然后用DNAStar 7.1（By Jotun Hein Method）软件将其与国内外分离毒株的基因序列进行同源性比对分析,用MEGA软件中（Neighbor-joining method）构建系统进化树,分析辽宁毒株的遗传变异特点。结果1、针对PTTVI型和PTTVII型保守基因序列,用Oligo 7.0软件设计2对特异性引物,建立了双重PCR检测方法,该方法可以特异性扩增出PTTV 2种不同毒株的目的基因,片段大小差异在100bp以上便于电泳观察,重组质粒标准品检测下限为1.0×105拷贝。2、用建立的双重PCR方法对501份健康猪和非健康猪的血液样品进行检测,结果表明健康猪PTTVI与PTTVII感染率分别为36.44%和60.16%;PTTVI和PTTVII混合感染率为21.46%;非健康猪PTTVI与PTTVII感染率分别为39.76%和63.94%,PTTVI和PTTVII混合感染率为29.25%。3、辽宁毒株TTV1-LNJZ和TTV2-LNSY基因全长分别为2894 bp和2804bp,Gen Bank登陆号分别为KT968712、KU156681,两个基因型均有4个开放阅读框（ORFs）,与国内外20个PTTVI型毒株进行比较,其同源性为58.5%96.4%,与国内外20个PTTVII型毒株进行比较,其同源性为70.5%96.7%。结论1、本研究成功构建了PTTV双重PCR检测方法,该方法具有快速、准确、敏感等优点。2、辽宁地区PTTVI型和PTTVII型均有感染,并且感染率较高,健康猪和非健康猪PTTVI型感染率分别为36.44%和39.76%;健康猪和非健康猪PTTVII型感染率分别为60.16%和63.94%。3、辽宁毒株TTV1-LNJZ和TTV2-LNSY全基因序列与国内外毒株的同源性分别为58.5%96.4%、70.5%96.7%。其中TTV1-LNJZ毒株与1p毒株（AY823990.1）遗传进化关系最近;TTV2-LNSY毒株与TTV2XYF7毒株（JX535334.1）遗传进化关系最近。
李凯[3]（2014）在《江西省猪群中三种小DNA病毒的分子流行病学研究》文中研究说明近年来，猪群中新发病原不断，特别是小DNA病毒直接或间接地给养猪业造成了巨大的经济损失。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type2, PCV2）、猪输血传播病毒（Porcine torque sus tenovirus, TTSuV）及猪博卡病毒（Porcine bocavirus, PBoV）都是小DNA病毒，其基因组序列全长在1.7kb-5.9kb之间。在研究我省PCV2、TTSuV和PBoV分子流行病学中，根据PCR引物设计原则，运用现代分子生物学技术，本实验目的在于建立能同时检测出猪圆环病毒2型（PCV2）和猪博卡病毒（PBoV）的两重PCR检测方法及猪输血传播病毒1型（TTSuV1）和猪输血传播病毒2型（TTSuV2）之间的多重套式PCR检验方法。分别通过对各个单项PCR的引物浓度、最佳退火温度等实验条件进行不断优化，建立起最优的检测体系。对江西省23个地区2013年采集的疑似圆环病毒2型感染的各阶段同一病猪的肺、脾脏、淋巴结及小肠组织121份进行PCV2和PBoV两重PCR检测，共检出PCV2阳性病料数为79份，阳性率为65.29%，PBoV阳性病料数为68份，阳性率为56.2%，PCV2和PBoV混合感染数为59份，感染率为48.67%。对江西省9个地区的67份血液样品和相应组织样品进行了检测，结果表明猪群中TTSuV1和TTSuV2感染总阳性率分别为55.22%和65.67%，二者的混合感染率为41.79%。34份样品表现为PCV2和TTSuV1的混合感染，占样品总数的50.75%；42份样品表现为PCV2和TTSuV2的混合感染，占62.69%；另外，还有28份样品为三重感染，占41.79%。同时，还在试验中建立了一种用于快速检测PCV2的环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）检测方法，该方法比传统PCR灵敏度高出100倍，且对PCV2有很高的特异性。分别使用传统PCR方法和LAMP方法对121份疑似PCV2样品进行检测，结果表明：LAMP方法的检出率为65.29%，与传统PCR方法检出率相同，PCR方法和LAMP方法检测样品的阳性符合率为100%。最后，根据GenBank上公布的序列设计一对PCV2全基因序列扩增的背对背引物，经过扩增测序后获得到了9条PCV2全基因序列，通过对这9株PCV2江西省地方流行毒株全基因序列核苷酸及蛋白序列分析及制作遗传进化树，结果显示：9株PCV2江西省地方流行毒株中，有8株基因组序列全长为1767bp，1株全基因组序列全长为1768bp。同源性分析结果表明，9株PCV2之间的核苷酸同源性为94.7%-99.8%，将这9株全基因序列与GenBank己发表的27株PCV2分离株基因组序列比较，发现其同源性为94.3%-99.8%；遗传进化树显示9株PCV2江西分离株主要分为3种基因型，其中九江株（JJ-JX-CN）、高安株（GA-JX-CN）、新建株（XJ-JX-CN）、南昌株（NC-JX-CN）和宜春株（YC-JX-CN）这5株与AF055394（英国株）同属于PCV2b亚型，亲缘关系较近；吉安株（JA-JX-CN）、抚州株（FZ-JX-CN）和上饶株（SR-JX-CN）与AY181946（中国株）同属于PCV2d亚型，形成一个大分支。赣州株（GZ-JX-CN）与AB426905（日本株）参考株同属于PCV2a亚型；分析这9株PCV2的ORF2核苷酸及其所推导的氨基酸序列与参考株同源性，发现分别为91.2%-99.9%和80.3%-100%，存在较大的变异可能。而分析其ORF1和ORF3核苷酸及其所推导的氨基酸序列与参考株同源性，发现分别为96.9%-100.0%和97.8%-99.7%，97.1%-100%和96.2%-100%，变异程度较小。这对及时更好地了解PCV2在及其对江西地区的流行和进化情况，提供了理论依据及参考意义。
张洪兵[4]（2014）在《昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究》文中指出输血传播病毒（Torque teno virus, TTV）是一种无囊膜的单股负链DNA病毒,关于其病毒分类尚有争议,目前该病毒归于圆环病毒科（Circoviridae）指环病毒属（Anellovirus）。该病毒发现于1997年,一位日本学者采用差异显示分析法（representational difference analysis, RDA）在一例心脏手术输血后发生急性感染的非甲-庚型肝炎病人进行血清分析时发现的,被称为输血传播病毒。研究发现TTV可感染人和多种动物,且在人群中的感染率很高。输血传播病毒呈世界性分布,它的基因组有高度的变异性,在人与动物中的流行状况也不尽相同,而目前国内的研究尚缺乏对更多不同地区的人类输血传播病毒流行病学的研究数据,这就包括病毒的基因型别和感染率。此外,无论是体内实验还是体外实验,输血传播病毒的研究进展都较为缓慢,尤其是病毒在健康人群的流行病学。因此,为了了解该病毒的分子流行病学特点,和全基因组特征,以及为输血传播病毒所可能带来的疾病提供科学的防控依据,本实验对昆明市体检人群血清样品开展了输血传播病毒感染的分子流行病学研究。本研究中,提取昆明市体检人群血清中的病毒基因组,根据GenBank上发表的TTV标准株序列（AB008394）,并参考相关文献,设计合成针对TTV核苷酸序列较为保守的非编码区（Untranslated Region, UTR）的引物,建立了用于检测人TTV的巢式PCR方法。对昆明市某高校体检人群的224份血液样品进行了检测,检测到了151份,结果表明体检人群中TTV的感染率达到了67.41%。依据国外已经发表的研究,针对输血传播病毒核苷酸序列变异率比较大的开放阅读框1（Open Reading Frame one, ORF1）设计并合成了N22区引物,同时合成了输血传播病毒第四基因群（Group4,G4）和第五基因群（Group5,G5）的分型引物,对上一步扩增较好的样品120份进行分型实验。以PCR方法对鉴定引物筛选为阳性的血清样品进行基因分型。对其中PCR扩增效果较好的样品进行序列测定与分析,建立系统进化树。分型结果表明,N22区引物扩增出了21份,占实验样品的17.5%,以G4引物扩增了50份样品,检测出了13份阳性,比例为26%,G5引物扩增了50份,检出24份,阳性率为48%。大部分毒株与TTV Gla型相符合,而进化关系稍远的有可能是基因变异造成成的。设计并合成了五对引物,对TTV全基因组进行克隆与序列测定,并进行了序列拼接,建立了此株病毒的系统进化树,分析了氨基酸的同源性。系统进化分析表明此毒株属于TTV1a型。核苷酸同源性与氨基酸同源性分析表明与TTV1a型的相似度最高。以上研究结果表明,输血传播病毒在昆明市体检人群中的检出率为67.41%,由此推断此病毒在昆明还是有着较高的流行率：基因分型和系统进化分析表明,昆明的优势流行株还是TTV的G1a型。本实验对昆明市体检人群输血传播病毒的分子流行病学作了较为系统的调查研究,以上研究结果为输血传播病毒在体检人群中的流行状况和基因型别提供了参考依据,为输血传播病毒的进一步研究打下了坚实基础。
陈轶雯[5]（2013）在《广东TTSuVs流行病学调查与TTSuV2 ORF1抗原性分析》文中进行了进一步梳理输血传播病毒（Transfusion transmitted virus, TTV）是一种小的,无囊膜的,单股环状负链的人畜共患DNA病毒,TTV的发现是于1997年底由NiShizawa运用代表性差异分析技术（Representational difference analysis）从一名非甲一庚型肝炎病人的血清中克隆得到的病毒DNA片段,随后,人们在非灵长类以及猪、牛、羊、犬,猫、家禽等多种家养及野生动物体内也发现了TTV的感染。猪源TTV （TTSuVs）在世界范围内广泛检出,引起人们的极大关注。目前TTSuVs的诊断主要依赖DNA的检测,由于猪源TTV具有潜在的危害,因此对其抗原性进行分析是非常必要的。本实验利用基因重组技术将TTSuV2ORF2基因克隆至原核表达系统中,制备获得了具有生物学活性的重组Cap蛋白,并进行了免疫原性研究,主要研究内容如下：1、为了解广东省猪群中猪输血传播病毒（TTSuVs）的感染情况,本研究采用Nest-PCR方法对广东省7个不同地区规模化猪场抽检采集的159份育肥猪血清进行检测。结果表明,TTSuVs的两个种TTSuV1和TTSuV26（?）阳性检出率分别为54.72%和35.22%,二者的共感染率为29.56%,说明TTSuVs在广东猪群中有较为广泛的传播。挑选Nest-PCR检测TTSuV1和TTSuV2为阳性的样品,分别在病毒保守区设计引物,扩增病毒基因,并对比分析通过PCR扩增获得的TTSuVs结构蛋白编码区ORF1与NCBI上其它已发表的不同属种TTVsORF1序列的进化关系和同源性。结果表明猪TTV与人、犬、猫、猴的TTVs处在进化树的不同分枝,具有很大差异；本次研究获得的TTSuV1ORF1序列与国内多株已发表的TTSuV1ORF1序列同源性为72%-75%；获得的TTSuV2ORF1序列与现有测序的多株TTSuV2的ORF1序列同源性为88%-97%。2、以本实验室保存的TTSuV2-GDIMA1为模板设计引物,进行ORF1序列的PCR扩增、克隆及测序。通过对TTSuV2ORF1蛋白的抗原性,信号肽,跨膜区,亲疏水性和二级结构进行预测分析,将TTSuV2ORF1截短成VP1、VP2两个片段,分别将这两片段连入pET-21b载体并通过大肠杆菌系统进行表达。通过蛋白纯化,切胶回收获得高纯度的目的蛋白。以获得的高纯度ORF1-VP1与ORF1-VP2蛋白为抗原,以血清样品中经Nest-PCR检测TTSuV2呈阳性的样品进行Western Blot检测。结果显示ORF1-VP1与ORF1-VP2的表达产物均为包涵体。Western Blot结果证实,猪对TTSuV2的感染的确产生了抗TTSuV2ORF1的IgG抗体,且两段蛋白均具有抗原性。本研究对TTSuV2ORF1蛋白的生物信息学特性进行了一定的探索,有利于监测TTSuV2的进化情况,为深入研究该病毒的遗传变异和蛋白质功能奠定一定的生物学基础。3、为了分析和筛选TTSuV2ORF1抗原性较好的区域,本试验将通过大肠杆菌表达系统表达出的TTSuV2ORF1-VP1和VP2重组蛋白纯化后作为间接ELISA检测方法的抗原,与Nest-PCR共同检测213份猪血清中抗TTSu V2的IgG抗体和病毒DNA。结果显示Nest-PCR检测呈阴性的部分样本,通过血清学检测呈现出较高抗体水平；而Nest-PCR检测呈阳性的部分血清样品,其抗体水平却相对较低。TTSuV2ORF1-VP1蛋白和VP2蛋白均具有良好反应原性,实验结果预示其中可能存在中和位点。用商品化的ELISA试剂盒检测相同血清中CSFV、PRRSV、PRV、HCV的阳性率分别为84.44%、86.22%、45.33%、68.42%。本试验为进一步研究TTSuV2ORF1抗原表位奠定了基础。
张龙,刘建波,黄立平,郭龙军,危艳武,唐青海,吴洪丽,刘长明[6]（2012）在《抗猪输血传播病毒1型（PTTV1）Cap蛋白单克隆抗体制备及鉴定》文中进行了进一步梳理为表达猪输血传播病毒1型（PTTV1）Cap蛋白用于单抗的制备,以含PTTV1全长基因组的质粒（pMD18-TTV1-SY13）为模板,用高保真PCR法扩增PTTV1-ORF1（1501～2475 nt）编码的Cap蛋白C末端截短序列（324 aa）,引物两端设计了SalⅠ和NotⅠ酶切位点,将PCR产物克隆到pGEX-6P-1载体,构建的重组质粒命名为pGEX-TTV1-ORF--C1。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株后进行诱导表达,获得了含GST标签的PTTV1-rCap重组融合蛋白,经SDS-PAGE电泳分析和Western blot鉴定,目的蛋白获得了高效表达,分子量约为64.0 kDa,以包涵体形式存在。用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用淋巴细胞杂交瘤技术获得了8株稳定分泌抗PTTV1-rCap蛋白的杂交瘤细胞株,依次命名为1H4、1E9、1E11、4G12、5C5、7B8、8C2、8G2,单抗亚类鉴定均为IgG1,轻链为κ型;单抗培养上清效价为400～3200倍,腹水为4.0×105～6.4×106倍;有7株单抗与PTTV1-rCap蛋白产生特异性反应,另1株单抗（1E11）呈阴性,可能针对构象表位。为验证8株单抗与真核表达的Cap蛋白的免疫反应性,将全长与截短的PTTV1-ORFI基因片段克隆到pcDNA3.1/V5-His TOPO表达载体,转染293T细胞进行蛋白表达,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）检测表明,这8株单抗均能够与表达的Cap蛋白产生特异性反应。本研究表达的PTTVl-Cap蛋白及制备的单抗,为该病毒诊断方法的建立及抗原表位的鉴定奠定了基础。
张龙[7]（2012）在《抗猪细环病毒1型Cap蛋白的单克隆抗体制备及鉴定》文中研究表明细环病毒（TorqueTeno virus,TTV）是一种最早发现于非甲-戊型肝炎患者体内的一种新病毒。TTV可以感染多种动物，根据基因组特性，猪源的TTV可以分为2个基因型，即PTTV1和PTTV2。PTTV在世界范围内广泛流行，猪群阳性检测率为30%～100%不等。虽然其致病性仍不清楚，但有报道称，PTTV在PMWS的发生中与PCV2起着协同致病的作用。也有学者认为，PTTV在猪繁殖与呼吸综合征、猪皮炎肾病综合征以及猪戊型肝炎中有一定致病性。鉴于PTTV的高流行性以及潜在的协同致病性，有必要对其进行研究。该病毒体外分离未获成功，病毒检测主要靠PCR的方法，血清学诊断技术的研究滞后。本研究利用原核表达系统表达了PTTV1重组Cap蛋白，并利用纯化的PTTV1重组Cap蛋白制备单克隆抗体，同时利用真核表达系统瞬时表达了全长及C端截短PTTV1-ORF1重组Cap蛋白并对制备的单抗进行了鉴定。以上研究为PTTV感染的流行病学调查、血清学检测方法、抗原表位的研究等方面提供了一定的技术基础。本研究将PTTV1编码Cap蛋白的ORF1-C端截短序列克隆到pGEX-6P-1载体构建重组质粒（pGEX-PTTV1-ORF1-C1），将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株进行融合蛋白的诱导表达。蛋白表达产物经SDS-PAGE电泳分析，可见目的蛋白获得了高效表达，融合蛋白分子量为64.0kDa，以包涵体的形式存在。用抗GST标签蛋白单抗进行Western blot免疫活性鉴定，表达的GST标签与PTTV1-Cap形成的融合蛋白（GST-PTTV1-rCap）能够与抗GST标签蛋白单抗产生特异性免疫反应，证明表达的GST-PTTV1-Cap融合蛋白具有免疫活性。PTTV1-Cap蛋白是病毒主要结构蛋白，为建立检测诊断方法的理想靶抗原，PTTV1-rCap蛋白的成功表达为血清学诊断方法的建立奠定了基础。为了制备抗PTTV1-Cap蛋白的单克隆抗体，用纯化的PTTV1-rCap免疫BALB/c小鼠，采用淋巴细胞杂交瘤技术获得了8株稳定分泌抗PTTV1-rCap蛋白的杂交瘤细胞株，单抗亚类鉴定均为IgG1，轻链为型；单抗培养上清效价为1：400～3200，腹水效价为1:4.0×105～6.4×106；Western blot结果显示，有7株单抗与PTTV1-rCap蛋白产生特异性反应，另1株单抗呈阴性，可能针对构象表位。本研究制备的单抗为血清学诊断方法的建立及抗原表位分析奠定了基础。为进一步鉴定该8株单抗与真核表达重组PTTV1-Cap蛋白的免疫反应性，将PTTV1-ORF1全长及截短序列克隆到真核表达载体（pcDNA3.1/V5-His TOPO），将构建的重组质粒，转染293T细胞，进行蛋白瞬时表达，用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）方法进行鉴定。结果表明，该8株单抗均能与真核表达的重组Cap蛋白特异性反应。本研究利用真核表达系统构建的重组质粒及表达的PTTV1重组Cap蛋白，为进一步研究重组质粒DNA免疫评价试验及建立检测该病毒的IPMA方法奠定了基础。IPMA方法由于具有特异性好、敏感性高、实验结果易于判断等优点而在猪病的检测中得到了广泛的应用。本研究利用真核表达系统将构建的全长PTTV1-ORF1重组质粒转染293T细胞，进行蛋白瞬时表达，并用多聚甲醛固定细胞作为检测抗原，建立了一种用于检测PTTV1血清抗体的IPMA方法，对来自黑龙江、吉林、河北、上海、山东等地9个猪场送检的100份血清样品进行检测，结果表明PTTV1抗体阳性血清为82份，阴性血清为18份，血清抗体阳性率为82%，表明我国猪群中该病感染较为普遍，其临床致病性应引起关注。
张文文[8]（2012）在《猪TTV2ORF1基因的原核表达以及间接ELISA检测方法的建立》文中认为猪TTV（Torque teno virus）又名猪输血传播病毒（transfusion transmitted virus）。属于细环病毒科（Anelloviridae）,壬型细环病毒属（Iotatorquevirus）.从1999年首次证实TTV存在于猪群中,许多学者对猪TTV进行了流行病学调查,发现猪TTV早在1985年就存在于西班牙猪场中,并且已在世界范围内流行。虽然尚未有猪TTV直接致病的报道,但其广泛流行性以及与其他疾病之间的关系已经使之不容忽视。鉴于目前国内对猪TTV的检测方法仍以PCR为主,本实验针对国内流行的TTV2的ORF1的部分基因进行了表达,并以获得的纯化蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法,为该病毒提供了血清学检测手段,同时为建立标准化检测试剂盒以及疫苗的研制奠定了基础。1猪TTV2ORF1的部分基因在大肠杆菌BL21中的克隆与表达本研究根据Genbank中已发表的猪TTV2的ORF1基因序列设计了两对引物。以提取的TTV2DNA为模板,通过PCR的方法分别扩增出1206bp和855bp两个片段,将这两个扩增片段分别插入克隆载体pMD18-T,测序验证正确。然后分别将两个克隆质粒以及表达载体pcold同时用Xhol和HindⅢ进行双酶切,将酶切后的两段基因分别与酶切后的表达载体进行连接,然后转化入大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot印迹分析,证实两种蛋白在大肠杆菌中均得到了高效表达,分子量分别约为52KD和39KD。2重组蛋白的纯化以及多克隆抗体的制备表达的两种蛋白均以包涵体的形式存在,因此在纯化过程中需进行超声破碎,然后用镍柱进行纯化。将纯化的两种蛋白分别免疫新西兰大白兔。首免时要将抗原与弗氏完全佐剂1：1混匀,并于首免之前耳缘动脉采血作为阴性对照。之后每隔两周免疫一次,并将抗原与弗氏不完全佐剂1：1混匀,共免疫4次。末次免疫7天后对兔进行心脏采血,经Western blot检测在相应位置处有清晰的条带,间接ELISA检测多抗效价达1：12800。3间接ELISA检测方法的建立将纯化得到的pcold-gl蛋白作为抗原包被ELISA板,建立了猪TTV2的间接ELISA检测方法,并确定了间接ELISA检测的最佳条件：抗原最佳包被浓度为1.65μg/ml,血清最佳稀释度为1：160,最佳包被液和封闭液分别为碳酸盐缓冲液和2%脱脂奶粉,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭时间为37℃2h,血清作用时间1h,二抗浓度1：4000,二抗37℃作用30min,TMB显色5mmin。经统计学分析确定阴阳性的临界值为0.248。与其他猪病阳性血清的特异性试验证明该方法特异性好,批内批间重复性试验结果变异系数均小于10%,说明该方法具有较好的重复性。利用该方法对两个猪场352份血清样品进行了检测,阳性率分别为42.7%和7.5%。
赵玲[9]（2011）在《猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析》文中指出根据基因型的不同,参照GeneBank上发表的TTV1（GU570198.1）和TTV2（AY823991.1）的序列,各设计两对巢式引物用于检测TTV1和TTV2。采集生猪血液样品若干份,提取病毒DNA,用巢式PCR技术,扩增出TTV1、TTV2非编码区特异性目的基因片段,将目的片段回收进行克隆测序,以确定为感染TTV1与TTV2病毒。再用阳性TTV DNA为模板,对巢式PCR反应条件进行优化,通过重复性、敏感性、特异性试验来验证该方法的准确性。最后,将优化好的TTV1、TTV2检测方法用于对所采集的127份血清样品进行PCR检测。结果可看出,本研究建立的巢式PCR检测方法重复性、敏感性、特异性较好,适用于临床大规模的检测。针对四川省采集鉴定为TTV1和TTV2阳性的血清样品各两份,参照GeneBank上发表的猪输血性传播病毒1型（TTV1）和2型（TTV2）全基因组核苷酸序列（AB076001.1、GU456386.1）,设计特异性引物,采用巢式PCR的方法扩增TTV1和TTV2全基因组序列,分别进行克隆、测序和拼接,并对其进行遗传进化分析和同源性分析。结果表明,两株TTV1基因组全长分别为2852bp和2917bp；两株TTV2基因组全长分别为为2802bp和2798bp,TTV1-SC1、TTV1-SC2与已公布的TTV1基因组序列相似性分别为81%～95%、82%～94%。TTV2-SC1、TTV2-SC2与已公布的TTV2基因组序列相似性分别为88%-99%、80%-96%。系统进化树分析表明,分离株TTV1-SC1与TTV1 Bj10株（HM633251.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC2与TTV2SH0822／2008株（GU450331.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC1、TTV2-SC2与PTTV2c-VA株（GU456386.1）亲缘关系最近。通过对TTV.ORF1蛋白抗原性分析,疏水性分析和二级结构分析,推测TTV1-SC1-ORF1的抗原表位集中在155aa。173aa、409aa-423aa和470aa-497aa这三个区域之间。TTV1-SC2-ORF1的抗原表位集中在46aa-62aa、169aa-175aa和321aa-337aa这三个区域之间。而TTV2两个毒株的一级结构同源性较高,氨基酸的差异并没有影响到蛋白质的抗原性,推测TTV2.SC1-ORF1和TTV2-SC2-ORF1的抗原表位都集中在268aa-279aa、379aa-390aa、505aa-511aa和517aa-533aa这四个区域之间,这些分析结果是否能说明此区域就是真正的抗原表位,还需实验证实。本研究有利于监测猪TTV1与TTV2的疫源和进化情况,为进一步深入研究病毒形态结构、遗传与变异和基因功能特点奠定一定的生物学基础。
王礞礞[10]（2011）在《猪源TTV：分子流行病学，全长序列分析及感染性分子克隆的构建》文中指出输血传播病毒（Torque teno virus, TTV）是一种小的,无囊膜的,单股环状负链的DNA病毒,目前该病毒被归于圆环病毒科的指环病毒属。TTV是继甲、乙、丙、戊型肝炎病毒之后又发现的一种新型肝炎病毒。该病毒最早是由日本学者于1997年从一例输血后发生急性感染的非甲戊型肝炎病人血清中发现的,因而被称输血传播病毒。调查发现TTV在人群中感染率很高,在猪、牛、羊、猫、狗等多种动物体内也相继发现有TTV的感染。猪源TTV在全世界大部分猪场都具有很高的感染率,引起了人们的广泛关注。目前的流行病学调查显示,猪源TTV和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒共感染可诱发猪的皮肤肾炎综合症,和猪圆环病毒共感染可诱发断奶仔猪代谢综合症,还可能与猪圆环病毒或猪戊型肝炎病毒共同诱发猪的传染性肝炎。由于猪源TTV具有潜在的危害,目前对此病毒的了解非常少,因此对其进行相关的研究是非常必要的。本文根据GenBank上发表的PCV2基因组序列和TTV1和TTV2的非编码区（UTR）序列设计合成引物,分别建立了用于检测PCV2和TTV1、TTV2的PCR及巢式PCR方法。对来自广东、福建和江西等7个省份的258份血液样品和组织样品进行了检测,结果表明猪群中TTV1和TTV2感染总阳性率分别为37.6%和82.6%,二者的混合感染率为34.5%。94份样品表现为PCV2和TTV1的混合感染,占样品总数的36.4%;193份样品表现为PCV2和TTV2的混合感染,占74.8%;另外,还有一些样品为三重感染,占34.5%。挑选部分阳性样品用套式PCR引物扩增出TTV1和TTV2的部分UTR片段,并将扩增出的部分UTR基因与已报道的TTV1和TTV2的UTR序列进行比较分析。分析结果显示本研究获得的TTV1毒株之间的UTR核苷酸同源性为80.8%-98.5%,TTV2毒株之间的UTR核苷酸同源性为94.2%-100%,而与参考株相比同源性分别为82.7%-100%和95.5%-99.1%。本研究从基因水平证实我国猪群中存在TTV的感染,提示我们TTV对猪群是一个不容忽视的新病原,并且确定了猪群中PCV2与TTV1和/或TTV2混合感染情况。从流行病学调查为阳性样品中选取其中病毒滴度高的样品,进行全长序列的扩增,测序过程中发现,在TTV1和TTV2基因组中均存在一段高GC并且有特殊结构的区域,导致测序结果不理想。针对这一问题,分别设计了2对和3对覆盖TTV1和TTV2全长的套式PCR引物,对阳性样品进行扩增,获得了7株全长序列,3株TTV1,4株TTV2。将所得到的TTV序列与GenBank中的10株参考序列进行核苷酸和氨基酸的比对和分析,核苷酸比对结果显示,获得的猪源TTV1和TTV2之间的同源性不到10%,TTV1分离株之间的核苷酸同源性为94.6-96.5%,与参考序列的同源性为61.5-98.3%,TTV2分离株之间的核苷酸同源性为92.4-94.8%,与参考序列之间的同源性为85.4-96.2%。氨基酸比对结果显示,TTV1分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均97.5%以上,但与参考序列的同源性则分成了两种情况,与AB076001和GU456383参考序列的同源性在97.5%以上,而与其他4株参考序列的同源性则不到50%。TTV2分离株的ORF1,2,3的氨基酸同源性均在88.3%以上,而和参考序列的同源性均在80%以上,只与参考序列GU88046 ORF3的同源性出现了低于50%的例外。通过比较分析也发现,TTV三个ORF的氨基酸同源性普遍低于核苷酸的同源性。与此同时,还发现核苷酸同源性大于90%的TTV序列之间,存在高频率的G/A碱基互换,在TTV1的ORF1中,其互换率在40-57.6%之间,ORF2的互换率在50-60%之间,明显高于其他碱基之间的互换率,而在TTV2中核苷酸同源性大于90%的序列只有两株,其ORF1的G/A的互换率为27.7%和42.9%,高于其它碱基的互换,在ORF2中,互换率为60%,明显高于其他碱基的互换率。进一步的研究表明去甲基化能明显减小测序困难,其中对FJ/China/2010/TTV2/2的测序完全正常,对FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列进行了GC岛、DNA二级结构的预测和甲基化水平分析,结果表明,在FJ/China/2010/TTV2/2的难测区和高GC区均存在复杂的茎环结构,但没有GC对的甲基化。对猪源TTV2中的假想蛋白ORF1,ORF2进行原核表达,由于ORF1 N端含有大量疏水氨基酸,因此对ORF1进行了截短,即ORF1a,表达结果显示ORF1a为包涵体,ORF2为可溶性蛋白。通过包涵体纯化和谷胱甘肽亲和层析（GST）纯化获得高纯度的可溶性重组蛋白,将纯化的ORF1a蛋白和ORF2蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,ELISA效价可达1:6000。另外,分别将TTV2的ORF1,ORF2和ORF3克隆到真核表达载体3×Flag中,构建了重组的真核表达质粒3×FLAG-ORF1,ORF2和ORF3。将其转染细胞,通过自制抗体的间接免疫荧光（IFA）试验证明了自制抗体的有效性,且通过3×FLAG标签抗体的IFA对三个假想蛋白进行了细胞定位,结果显示ORF1蛋白是核定位的,ORF2蛋白分布在整个细胞,ORF3蛋白主要集中在核浆中,在核仁的外围尤为明显。由于猪源TTV在猪体内的含量比较低,目前还没有能够支持其复制的细胞系,所以其分子机制和生物学的研究一直受到限制。为了研究猪源TTV的一些关键的分子生物学活性（如转录和复制）,本研究分段扩增了FJ/China/2010/TTV2/2的全长序列,该序列全长2796个核苷酸,与最早分离出的TTV2原型Sd-TTV2p （AY823991）的同源性为85.4%,用该序列构建出了分别含有1.0个,1.3个,2.0个全长基因组的载体为pSK的质粒。通过将构建质粒转染PK15细胞,48h后的Northern Blot实验,验证了三个主要阅读框的存在和ORF3剪切的发生;通过基于酶切的Southern Blot实验进行了病毒复制的研究,没有检测到构建质粒在PK15细胞中的复制;用自制ORF1a,ORF2抗体,通过间接免疫荧光实验检测构建质粒的蛋白表达情况,在72h后能够用ORF1a抗体检测到ORF1的蛋白表达,但ORF2抗体没有检测到荧光。Northern Blot和IFA试验证明了我们所构建的猪源TTV感染性分子克隆的可行性。这些实验为研究TTV的分子生物学机制搭建了平台,也为找到可以培养TTV的细胞系奠定了基础。
二、输血传播病毒(TTV)部分基因序列的克隆、表达、活性鉴定及临床病理学、流行病学的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、输血传播病毒(TTV)部分基因序列的克隆、表达、活性鉴定及临床病理学、流行病学的研究（论文提纲范文）
（1）两株猪细环病毒的全基因组测序及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪细环病毒的研究进展 |
| 1.2 猪细环病毒病原学特点 |
| 1.3 猪细环病毒的基因组结构功能 |
| 1.4 猪细环病毒流行病学特点 |
| 1.5 猪细环病毒的理化特性 |
| 1.6 猪细环病毒致病特性 |
| 1.7 猪细环病毒含量分布 |
| 1.8 猪细环病毒的潜在应用价值 |
| 1.9 猪细环病毒细胞培养特性 |
| 1.10 生物学诊断 |
| 1.10.1 病原学检测 |
| 1.10.2 血清学检测 |
| 1.11 全基因组研究 |
| 1.12 研究目的及意义 |
| 第二章 猪细环病毒全基因组克隆测序及分析 |
| 2.1 主要实验材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验室常用溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 临床病料与处理 |
| 2.3.2 病毒总基因组提取 |
| 2.3.3 引物设计及合成 |
| 2.3.4 猪细环病毒RT-PCR检测 |
| 2.4 猪细环病毒全基因组序列扩增 |
| 2.4.1 全基因组引物设计与合成 |
| 2.4.2 猪细环病毒阳性样品基因组提取 |
| 2.4.3 猪细环病毒全基因组序列扩增 |
| 2.4.4 阳性PCR产物回收纯化 |
| 2.4.5 目的片段的连接 |
| 2.4.6 目的基因转化 |
| 2.4.7 重组菌株PCR鉴定 |
| 2.4.8 猪细环病毒全基因组序列分析 |
| 2.4.9 ORF1 序列生物信息学分析 |
| 2.5 结果与分析 |
| 2.5.1 样品检测结果 |
| 2.5.2 TTSuV全基因组扩增结果 |
| 2.5.3 优化克隆转化过程 |
| 2.5.4 TTSuV全基因组序列拼接 |
| 2.5.5 TTSuV全基因组相似性分析 |
| 2.5.6 基因重组分析 |
| 2.5.7 ORF1 蛋白理化性质预测分析 |
| 2.5.8 ORF1 蛋白二级结构预测 |
| 2.6 结论与讨论 |
| 第三章 猪细环病毒分离及仔猪致病性试验 |
| 3.1 主要实验试剂 |
| 3.2 主要试验仪器 |
| 3.3 实验材料 |
| 3.4 猪细环病毒分离培养 |
| 3.4.1 实验材料 |
| 3.4.2 细胞复苏 |
| 3.4.3 细胞传代培养 |
| 3.4.4 细胞冻存 |
| 3.4.5 6 孔板培养细胞 |
| 3.4.6 病毒分离 |
| 3.4.7 96 孔板培养细胞 |
| 3.4.8 半数组织感染量(TCID_(50))的测定 |
| 3.4.9 动物致病性试验 |
| 3.5 结果与分析 |
| 3.5.1 病毒分离培养 |
| 3.5.2 分离株毒价测定 |
| 3.5.3 动物致病性试验 |
| 3.6 结论与讨论 |
| 第四章 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 本研究涉及所有参考毒株信息 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）猪输血传播病毒Ⅰ型和Ⅱ型双重PCR方法的建立及应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 附录 文献综述 猪输血传播病毒的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附图 |
（3）江西省猪群中三种小DNA病毒的分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 圆环病毒 2 型分子生物学研究进展 |
| 1 病原学及分子流行病学研究 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 PCV 流行病学调查 |
| 2 PCV2 致病机理 |
| 2.1 PCV1 和 PCV2 的分子生物学差异分析 |
| 2.2 PMWS 的病原学分析 |
| 2.3 PMWS 致病机理的细胞及分子免疫学分析 |
| 3 PCV2 诊断技术研究进展 |
| 3.1 抗原检测 |
| 3.2 抗体检测 |
| 4 PCV2 疫苗的研究进展 |
| 第二章 猪输血传播病毒研究进展 |
| 1 研究概述 |
| 2 TTSuV 的研究现状 |
| 2.1 TTSuV 基因组 |
| 2.2 TTSuV 流行病学调查 |
| 2.3 TTSuV 感染特点 |
| 2.4 TTSuV 传播途径 |
| 2.5 TTSuV 致病性研究 |
| 2.6 TTSuV 检测方法 |
| 第三章 猪博卡病毒的研究进展 |
| 1 病原学发展简介 |
| 2 分子特征 |
| 3 流行病学研究 |
| 3.1 分布特点 |
| 3.2 流行感染特点 |
| 3.3 分子流行病学研究方法 |
| 4 研究展望 |
| 第四章 环介导等温扩增技术概述 |
| 1 LAMP 扩增原理 |
| 2 LAMP 的特点 |
| 2.1 快速性和高效性 |
| 2.2 灵敏度高 |
| 2.3 特异性高 |
| 2.4 检测方便 |
| 2.5 操作简单 |
| 2.6 RT-LAMP |
| 3 LAMP 的不足 |
| 4 LAMP 技术的应用 |
| 下篇 实验研究 |
| 第五章 PCV2和PBOV两重 PCR 检测方法的建立与临床样品的检测分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 临床样品及病料的采集 |
| 1.4 引物合成 |
| 1.5 病料预处理 |
| 1.6 DNA 的提取 |
| 1.7 扩增目的片段 |
| 1.8 产物电泳 |
| 1.9 胶回收 |
| 1.10 T-A 克隆目的片段 |
| 1.11 重组质粒的 PCR 鉴定 |
| 1.12 扩增片段测序分析 |
| 1.13 优化单项 PCR |
| 1.14 多重 PCR 条件优化 |
| 2 结果 |
| 2.1 单项 PCR 引物浓度及退火温度的确定 |
| 2.2 多重 PCR 反应条件的优化及确定 |
| 2.3 PCV2 及 PBoV 江西地区的流行病学调查 |
| 2.4 产物序列分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第六章 TTSUV1 和 TTSUV2 多重套式 PCR 检测的建立及临床样品检测分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器设备 |
| 1.3 引物合成 |
| 1.4 病料样品的预处理 |
| 1.5 DNA 的提取 |
| 1.6 目的片段的 PCR 扩增 |
| 1.7 胶回收 |
| 1.8 T-A 克隆目的片段 |
| 1.9 PCR 鉴定重组质粒 |
| 1.10 单项套式 PCR 条件的优化 |
| 1.11 建立多重套式 PCR 检测方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 单项套式 PCR 引物浓度及退火温度的确定 |
| 2.2 多重 PCR 反应条件的优化及最终反应条件 |
| 2.3 TTSuV1、TTSuV2 及 PCV2 江西地区的流行病学调查 |
| 2.4 多重套式 PCR 产物的序列分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第七章 猪圆环病毒 2 型江西分离株全基因组的克隆、测序及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 PCV2 全基因组临床样品的 PCR 扩增 |
| 2.2 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.3 PCV2 江西分离株全基因组分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 3.1 引物设计 |
| 3.2 PCV2 全基因组核苷酸序列比较 |
| 3.3 PCV2 江西分离株的遗传进化分析 |
| 3.4 PCV2 江西分离株 ORF2 和 ORF3 核苷酸及其编码氨基酸序列分析 |
| 3.5 PCV2 的 ORF3 蛋白的功能研究 |
| 第八章 猪圆环病毒 2 型 LAMP 检测方法的建立及临床样品检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病料来源 |
| 1.2 引物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 总 DNA 的提取 |
| 1.6 LAMP 反应体系优化 |
| 2 结果 |
| 2.1 最佳镁离子浓度 |
| 2.2 最佳内外引物比 |
| 2.3 最佳扩增温度 |
| 2.4 最佳扩增时间 |
| 2.5 扩增产物酶切结果 |
| 2.6 LAMP 和 PCR 灵敏性试验结果 |
| 2.7 特异性分析结果 |
| 2.8 可视性观察结果 |
| 3 临床样品的检测结果 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 小结 |
| 4.2 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 插图和附表清单 |
| 英文缩略词索引 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 输血传播病毒概述 |
| 1.1.1 TTV病毒理化及生物学特性 |
| 1.1.2 TTV所属科属 |
| 1.2 输血传播病毒基因组及其重要蛋白研究进展 |
| 1.2.1 TTV基因组特点 |
| 1.2.2 TTV的蛋白质 |
| 1.2.3 TTV基因群 |
| 1.3 输血传播病毒可能的致病性 |
| 1.3.1 肝损伤 |
| 1.3.2 肺部疾病 |
| 1.3.3 血液学疾病 |
| 1.3.4 特发性炎症性肌病 |
| 1.3.5 免疫学状况 |
| 1.3.6 系统性红斑狼疮 |
| 1.4 输血传播病毒在人体组织的分布 |
| 1.5 输血传播病毒传播途径 |
| 1.5.1 血液传播 |
| 1.5.2 粪-口途径传播 |
| 1.5.3 母婴垂直传播 |
| 1.5.4 飞沫传播 |
| 1.5.5 性传播 |
| 1.6 输血传播病毒流行状况 |
| 1.7 输血传播病毒检测方法 |
| 1.8 本研究的目的和意义 |
| 第二章 昆明体检人群TTV分子流行病学调查 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 血清样品PCR检测 |
| 2.2.2 重组质粒双酶切鉴定 |
| 2.2.3 重组质粒序列测定与分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 检测体系的评价 |
| 2.3.2 对检测结果的分析 |
| 2.3.3 由输血传播病毒感染所引发的思考 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 输血传播病毒变异分析 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 分型引物PCR检测 |
| 3.2.2 序列测定及分析 |
| 3.2.3 同源性及遗传进化分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 分型引物的设计 |
| 3.3.2 TTV基因型的特点 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 输血传播病毒全基因组序列分析 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 TTV全基因组分段扩增结果 |
| 4.2.2 各片段重组质粒双酶切鉴定 |
| 4.2.3 序列拼接 |
| 4.2.4 系统进化树分析 |
| 4.2.5 同源性分析 |
| 4.2.6 重组事件分析 |
| 4.2.7 TTV结构蛋白疏水性及抗原表位分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 全文总结 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A 攻读硕士期间发表论文目录 |
（5）广东TTSuVs流行病学调查与TTSuV2 ORF1抗原性分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 猪输血传播病毒的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 TTV的理化特性 |
| 1.2 TTV的分类 |
| 1.3 TTV的结构功能 |
| 2 TTSuV_s的传播方式与传播途径 |
| 3 TTSuV_s的流行病学调查 |
| 4 TTV的致病性 |
| 5 TTV的检测方法 |
| 5.1 套式PCR |
| 5.2 多重PCR |
| 5.3 荧光定量PCR |
| 5.4 滚环复制 |
| 5.5 血清学诊断方法 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第一章 广东TTSuV_s流行病学调查及其主要抗原编码区进化分析 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 样品采集 |
| 1.2 菌株,质粒与试剂 |
| 1.3 血清样品DNA的提取 |
| 1.4 TTSuV_1与TTSuV_2的PCR诊断 |
| 1.5 结果鉴定与数据统计 |
| 1.6 TTSuV_sORF1的扩增与同源性分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 样品的PCR检测结果 |
| 2.2 TTSuV_s检测结果统计分析 |
| 2.3 TTSuV_sORF1的同源性分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第二章 广东一株TTSuV_2ORF1的生物信息学特性分析及其蛋白表达 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 样品 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 TTSuV_2 ORF1的序列分析 |
| 1.4 TTSuV_2 ORF2基因的扩增、纯化及回收 |
| 1.5 原核表达载体pET21b-ORF1-VP1与pET21b-ORF1-VP2的构建和鉴定 |
| 1.6 重组质粒的诱导表达和纯化 |
| 1.7 包涵体膜蛋白的洗涤 |
| 1.8 重组表达蛋白的回收与纯化 |
| 1.9 Western-blotting检测重组蛋白 |
| 2 结果 |
| 2.1 序列分析 |
| 2.2 目的片段的获得 |
| 2.3 重组表达质粒的构建和鉴定 |
| 2.4 重组蛋白的诱导表达和可溶性分析 |
| 2.5 重组表达蛋白的回收与纯化 |
| 2.6 Western-blotting检测重组蛋白的表达 |
| 3. 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 间接ELISA检测方法对TTSuV_2 ORF1抗原表位的筛选与分析 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 血清样本中病毒DNA的和抗TTSuV_2抗体的检测 |
| 1.4 商品化ELISA试剂盒检测血清样本中其它病毒的阳性率 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 抗原与血清 |
| 2.2 血清样本中病毒DNA的和抗TTSuV_2抗体的检测 |
| 2.3 商品化ELISA试剂盒检测血清样本中其它病毒的阳性率 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（7）抗猪细环病毒1型Cap蛋白的单克隆抗体制备及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 分类 |
| 1.1.2 形态结构与理化特性 |
| 1.1.3 细胞嗜性及培养特性 |
| 1.1.4 流行病学调查 |
| 1.2 TTV 分子生物学 |
| 1.2.1 PTTV 基因组特征 |
| 1.2.2 TTV 编码蛋白特性 |
| 1.3 PTTV 诊断技术的研究进展 |
| 1.3.1 病原学诊断方法 |
| 1.3.2 血清学诊断方法 |
| 1.3.3 电镜技术 |
| 1.4 研究目的和意义 |
| 第二章 PTTV1-Cap 蛋白的原核表达与免疫活性鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 引物设计 |
| 2.1.5 目的基因片段扩增及产物回收纯化 |
| 2.1.6 原核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1.7 目的蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 分析 |
| 2.1.8 表达产物存在形式的检测及纯化 |
| 2.1.9 表达产物 Western blot 鉴定 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 PCR 扩增及重组质粒鉴定 |
| 2.2.2 融合蛋白的 SDS-PAGE 检测 |
| 2.2.3 表达产物的可溶性分析 |
| 2.2.4 融合蛋白的鉴定 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 抗 PTTV1-rCap 蛋白单克隆抗体的制备 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验动物及试剂 |
| 3.1.2 重组 PTTV1-Cap 蛋白表达纯化 |
| 3.1.3 单克隆抗体的制备 |
| 3.1.4 单克隆抗体的鉴定 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 单抗亚类的鉴定 |
| 3.2.2 单抗效价测定 |
| 3.2.3 单抗反应特性鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 PTTV1-rCap 蛋白真核表达与单克隆抗体鉴定 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.1.4 引物设计 |
| 4.1.5 目的基因片段扩增 |
| 4.1.6 真核表达重组质粒的构建 |
| 4.1.7 真核表达重组质粒的鉴定 |
| 4.1.8 重组质粒瞬时转染 293 T 细胞 |
| 4.1.9 IPMA 方法检测重组蛋白表达及单抗鉴定 |
| 4.1.10 临床血清样品的 IPMA 检测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 目的基因的 PCR 扩增 |
| 4.2.2 重组质粒菌落 PCR 结果 |
| 4.2.3 重组质粒酶切鉴定 |
| 4.2.4 IPMA 鉴定融合蛋白 |
| 4.2.5 真核表达的 Cap 蛋白与制备的单抗的反应活性鉴定 |
| 4.2.6 临床血清样品 IPMA 检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）猪TTV2ORF1基因的原核表达以及间接ELISA检测方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 病原学 |
| 2.1 猪TTV的分类与理化性质 |
| 2.2 猪TTV的基因型 |
| 2.3 猪TTV的基因组结构与特征 |
| 3 TTV的流行病学调查 |
| 3.1 流行范围 |
| 3.2 不同猪群流行情况 |
| 3.3 传播方式 |
| 3.4 致病性 |
| 4 TTV的检测方法 |
| 5 目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 猪TTV2 ORF1基因的原核表达及多克隆抗体的制备 |
| 摘要 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体和菌株 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 目的基因的克隆 |
| 2.2.2 重组质粒pMD18-T-g1和pMD18-T-g2的构建与鉴定 |
| 2.2.3 重组表达质粒pcold-g1和pcold-g2的构建与鉴定 |
| 2.2.4 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.5 重组蛋白的纯化 |
| 2.2.6 Western blot检测 |
| 2.2.7 多克隆抗体的制备 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 目的片段的扩增 |
| 2.3.2 克隆载体的酶切鉴定结果 |
| 2.3.3 重组表达质粒的酶切鉴定结果 |
| 2.3.4 重组蛋白的诱导表达结果 |
| 2.3.5 表达条件的优化 |
| 2.3.6 重组蛋白的可溶性检测结果 |
| 2.3.7 重组蛋白的纯化结果 |
| 2.3.8 Western blot检测 |
| 2.3.9 多克隆抗体制备 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 第三章 猪TTV2间接ELISA检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 抗原 |
| 3.1.2 血清及酶标抗体 |
| 3.1.3 主要试剂与仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 间接ELISA检测方法的操作步骤 |
| 3.2.2 抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定 |
| 3.2.3 抗原包被条件的确定 |
| 3.2.4 封闭条件的确定 |
| 3.2.5 抗原抗体反应条件的确定 |
| 3.2.6 临界值的确定 |
| 3.2.7 特异性试验 |
| 3.2.8 重复性试验 |
| 3.2.9 临床样品的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 抗原最佳包被浓度和抗体最佳稀释度的确定 |
| 3.3.2 抗原包被条件的确定 |
| 3.3.3 封闭条件的确定 |
| 3.3.4 抗原抗体反应条件的确定 |
| 3.3.5 间接ELISA临界值的确定 |
| 3.3.6 特异性试验 |
| 3.3.7 重复性试验 |
| 3.3.8 临床样品的检测 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| ABSTRACT |
| 全文总结 |
| 附录 常用试剂的配制 |
| 致谢 |
（9）猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 目录 |
| 第一章 输血性传播病毒的研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 TTV的理化性质 |
| 1.2 TTV DNA的结构和功能 |
| 1.3 TTV的分型 |
| 2 流行病学 |
| 2.1 人的TTV感染 |
| 2.2 灵长类动物的TTV感染 |
| 2.3 猪的TTV感染 |
| 3 致病性 |
| 4 检测方法 |
| 4.1 TTV分子生物学的检测方法 |
| 4.2 TTV分型的检测 |
| 4.3 TTV的其他检测方法 |
| 4.3.1 血清免疫学法 |
| 4.3.2 原位杂交法 |
| 5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 病料与载体 |
| 1.2 主要试剂及溶液配制 |
| 1.2.1 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PCR引物的设计 |
| 2.2 病毒总DNA的抽提 |
| 2.3 PCR扩增 |
| 2.4 目的基因的克隆 |
| 2.4.1 PCR产物目的DNA片段的回收 |
| 2.4.2 连接 |
| 2.4.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备 |
| 2.4.4 重组质粒的转化 |
| 2.5 阳性菌的鉴定 |
| 2.6 目的基因的序列测定 |
| 2.7 PCR扩增条件的优化 |
| 2.8 特异性实验 |
| 2.9 敏感性实验 |
| 2.10 重复性实验 |
| 2.11 TTV1、TTV2 PCR检测方法的临床应用 |
| 3 实验结果与分析 |
| 3.1 病料PCR扩增产物电泳结果 |
| 3.2 特异性试验鉴定结果 |
| 3.3 敏感性试验鉴定结果 |
| 3.4 重复性试验鉴定结果 |
| 3.5 PCR的临床应用的鉴定结果 |
| 3.5.1 采用PCR进行检测 |
| 3.5.2 TTV1、TTV2的感染情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于引物设计 |
| 4.2 关于TTV1、TTV2病毒的确定 |
| 4.3 关于敏感性试验、特异性试验和重复性试验 |
| 4.4 关于PCR方法的临床应用 |
| 第三章 猪输血性传播病毒1型(TTV1)和2型(TTV2)全基因组的克隆与序列分析 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 试剂与仪器 |
| 1.2 病料 |
| 2 方法 |
| 2.1 TTV1与TTV2全基因组的克隆 |
| 2.1.1 病毒基因组DNA的提取 |
| 2.1.2 TTV1与TTV2全基因组的PCR扩增 |
| 2.1.3 PCR产物的克隆与序列测定 |
| 2.2 TTV1和TTV2全基因组的生物信息学分析 |
| 2.2.1 TTV1和TTV2基因组核苷酸序列同源性分析和进化树分析 |
| 2.2.2 TTV1和TTV2基因组核苷酸重复高变序列分析 |
| 2.3 TTV1和TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测 |
| 2.3.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性预测分析 |
| 2.3.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析 |
| 2.3.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白二级结构预测 |
| 2.3.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 TTV1、TTV2全基因组的PCR扩增 |
| 3.2 PCR产物的克隆及测序 |
| 3.3 TTV1、TTV2全基因组序列的拼接 |
| 3.4 TTV1、TTV2全基因组的序列分析 |
| 3.4.1 TTV1、TTV2全基因组同源性分析与进化树 |
| 3.4.2 TTV1、TTV2基因组核苷酸高变缺失序列分析 |
| 3.5 TTV1、TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测 |
| 3.5.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性分析 |
| 3.5.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析 |
| 3.5.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白的二级结构预测 |
| 3.5.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测 |
| 3 讨论 |
| 3.1 关于全基因组克隆 |
| 3.2 关于序列分析 |
| 3.3 关于ORF1蛋白分析 |
| 结论 |
| 1 TTV1和TTV2 PCR检测方法的建立 |
| 2 TTV1与TTV2全基因组克隆与序列分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 附录一 TTV1和TTV2全基因组测序结果 |
（10）猪源TTV：分子流行病学，全长序列分析及感染性分子克隆的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 TTV 的发现 |
| 1.1.1 病毒的发现历史和方法 |
| 1.1.2 正在出现的病毒 |
| 1.1.3 TTV 病毒的出现 |
| 1.1.4 TTV 天然存在的证据 |
| 1.1.5 TTV 的分类过程 |
| 1.1.6 TTV 的感染性 |
| 1.1.7 猪源TTV |
| 1.2 人TTV 目前的研究现状 |
| 1.2.1 人TTV 的基因组结构 |
| 1.2.2 人TTV 的转录 |
| 1.2.3 人TTV 阅读框分析 |
| 1.2.4 人TTV 的结构 |
| 1.2.5 TTV 复制的机制 |
| 1.2.6 序列的变异性 |
| 1.2.7 人TTV 的流行情况和传播方式 |
| 1.2.8 TTV 的细胞嗜性 |
| 1.2.9 人TTV 和疾病的关系 |
| 1.3 猪源TTV 目前的研究现状 |
| 1.3.1 猪源TTV 的分子生物学特征 |
| 1.3.2 猪源TTV 的分类 |
| 1.3.3 猪源TTV 的遗传变异 |
| 1.3.4 猪源TTV 的流行 |
| 1.3.5 猪源 TTV 的传播方式 |
| 1.3.6 猪源TTV 的致病性 |
| 1.4 反向遗传学 |
| 1.5 目的意义 |
| 第二章 猪源 TTV1、TTV2 与 PCV2 的流行病学调查 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 菌株、质粒与试剂 |
| 2.1.3 病料的处理 |
| 2.1.4 病毒DNA 的提取 |
| 2.1.5 检测引物的设计 |
| 2.1.6 TTV1，TTV2 和PCV2 的检测 |
| 2.1.7 TTV1 和TTV2 部分UTR 基因的扩增 |
| 2.1.8 TTV1 和TTV2 部分UTR 基因的克隆 |
| 2.1.9 序列测定 |
| 2.1.10 序列分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 采集样品的TTV 的PCR 检测结果 |
| 2.2.2 采集样品的 PCV2 的 PCR 检测结果 |
| 2.2.3 TTV1 和TTV2 部分UTR 基因序列分析 |
| 2.2.4 采集样品TTV 检测结果统计分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 猪源TTV1、TTV2 的全长序列分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品 |
| 3.1.2 DNA 的提取 |
| 3.1.3 TTV1 与TTV2 全长基因组的扩增，克隆和测序 |
| 3.1.4 序列分析 |
| 3.1.5 甲基化分析实验 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 TTV1 和TTV2 分段扩增的结果 |
| 3.2.2 测序结果 |
| 3.2.3 猪源 TTV 的基本结构分析 |
| 3.2.4 猪源 TTV 的阅读框分析 |
| 3.2.5 TTV1,2 的全长基因组的变异性分析 |
| 3.2.6 TTV1,2 的全长核苷酸比对和阅读框的氨基酸比对 |
| 3.2.7 TTV1 和 TTV2 的碱基变异率分析 |
| 3.2.8 猪源 TTV 的 GpG 在线查找和甲基化分析 |
| 3.2.9 FJ/2010/China/TTV2/2 难测区和高 GC 区的二级结构预测 |
| 3.2.10 TTV 全长进化树分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 猪源TTV2 蛋白表达，抗体制作及细胞定位 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 毒株、血清、菌株与载体 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 TTV2 中主要阅读框的预测 |
| 4.2.2 TTV2 ORF1 的抗原性分析 |
| 4.2.3 引物设计与合成 |
| 4.2.4 原核重组表达质粒的构建和鉴定 |
| 4.2.5 重组菌的诱导表达和纯化 |
| 4.2.6 表达产物的SDS-PAGE 分析 |
| 4.2.7 ORF1a，ORF2 蛋白抗血清的制备 |
| 4.2.8 真核重组表达质粒的构建和鉴定 |
| 4.2.9 真核质粒转染后的间接免疫荧光 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 ORF1，ORF1a，ORF2，ORF3 基因的获得 |
| 4.3.2 原核重组质粒的鉴定 |
| 4.3.3 重组蛋白ORF1a 和ORF2 的表达和纯化 |
| 4.3.4 重组蛋白ORF1a, ORF2 的多抗血清的ELISA 效价测定 |
| 4.3.5 真核重组质粒的鉴定 |
| 4.3.6 真核质粒转染细胞后的间接免疫荧光 |
| 4.4.讨论 |
| 第五章 猪源TTV2 感染性克隆的构建和鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 病毒和细胞 |
| 5.1.2 试验试剂和主要仪器设备 |
| 5.1.3 TTV1.0,1.3,2.0 个全长质粒的构建 |
| 5.1.4 TTV2 转录的研究 |
| 5.1.5 TTV2 复制的研究 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 TTV2 FJ/China/2010/TTV/2 的各片段的PCR 扩增结果 |
| 5.2.2 TTV2 1.0，1.3，2.0 个全长的鉴定 |
| 5.2.3 Northern Bot 杂交的结果 |
| 5.2.4 Southern Blot 杂交结果 |
| 5.2.5 间接免疫荧光的结果 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、输血传播病毒(TTV)部分基因序列的克隆、表达、活性鉴定及临床病理学、流行病学的研究（论文参考文献）
- [1]两株猪细环病毒的全基因组测序及分析[D]. 陈柯. 南阳师范学院, 2021(11)
- [2]猪输血传播病毒Ⅰ型和Ⅱ型双重PCR方法的建立及应用[D]. 卢赫. 锦州医科大学, 2016(05)
- [3]江西省猪群中三种小DNA病毒的分子流行病学研究[D]. 李凯. 江西农业大学, 2014(02)
- [4]昆明市体检人群输血传播病毒分子流行病学研究[D]. 张洪兵. 昆明理工大学, 2014(01)
- [5]广东TTSuVs流行病学调查与TTSuV2 ORF1抗原性分析[D]. 陈轶雯. 南京农业大学, 2013(08)
- [6]抗猪输血传播病毒1型（PTTV1）Cap蛋白单克隆抗体制备及鉴定[A]. 张龙,刘建波,黄立平,郭龙军,危艳武,唐青海,吴洪丽,刘长明. 中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第十二次人兽共患病学术研讨会暨第六届第十四次教学专业委员会论文集, 2012
- [7]抗猪细环病毒1型Cap蛋白的单克隆抗体制备及鉴定[D]. 张龙. 中国农业科学院, 2012(10)
- [8]猪TTV2ORF1基因的原核表达以及间接ELISA检测方法的建立[D]. 张文文. 南京农业大学, 2012(01)
- [9]猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析[D]. 赵玲. 四川农业大学, 2011(04)
- [10]猪源TTV：分子流行病学，全长序列分析及感染性分子克隆的构建[D]. 王礞礞. 中国农业科学院, 2011(11)