一、P21/WAF1蛋白在肝细胞癌中的表达及DNA含量分析的意义（论文文献综述）
匡彦蓓[1]（2021）在《p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究》文中研究说明放射治疗是治疗癌症的一种常用手段,超过50%的癌症患者需要采用放疗技术进行治疗。放疗不仅可以单独作为一种治疗策略来缩小肿瘤体积,也经常与手术切除以及化学药物治疗联合应用,来达到最佳的治疗效果。因此,放疗是一种非常重要的癌症治疗手段。随着对放疗研究的深入,越来越多的证据表明,放疗失败的主要原因之一是肿瘤乏氧微环境。肿瘤乏氧微环境会造成肿瘤细胞的葡萄糖代谢途径重编程,即原本占代谢主导地位的线粒体氧化磷酸化过程被抑制,而糖酵解途径被增强。代谢途径的改变可以满足肿瘤细胞快速增殖所需的大量能量和代谢物质,并且通过多种途径增加肿瘤的辐射抗性。因此,本研究的目的在于筛选与肿瘤乏氧及辐射敏感性相关的分子标志物,并探究该分子标志物增强乏氧肿瘤辐射抗性的分子机制,为乏氧肿瘤的放射治疗提供新的理论依据。胶质瘤是常见的颅内肿瘤,其中胶质母细胞瘤是最致命的肿瘤之一。高级别胶质瘤患者预后差的主要原因是肿瘤的抗药性和辐射抗性强,治疗后极易复发,随后造成患者死亡。胶质瘤是常见的以乏氧为特征的实体肿瘤,其乏氧程度和肿瘤恶性程度密切相关,肿瘤内部氧分压越低的胶质瘤恶性程度越严重。因此,胶质瘤复发的主要原因之一是乏氧肿瘤微环境增强了胶质瘤的辐射抗性,在放疗后仍有一些肿瘤细胞未被清除,造成复发。因此,本研究以胶质瘤细胞作为实验材料来研究乏氧增强肿瘤细胞辐射抗性的机制。我们首先利用生物信息学分析胶质瘤患者肿瘤组织中的基因表达情况,筛选出一部分与胶质瘤发生发展具有密切关系的蛋白分子。随后在胶质瘤细胞中验证了待选分子中p21蛋白在乏氧处理后表达量显着升高,即p21可以参与胶质瘤细胞对乏氧处理的应答。然后通过克隆存活实验,发现p21能够增强胶质瘤细胞在乏氧条件下的辐射抗性。实验过程中还发现调控p21可以改变乏氧条件下细胞培养基的酸化程度,因此推测p21很有可能参与乏氧条件下糖酵解途径的调控。通过检测胶质瘤细胞培养基中一定时间内乳酸的产量以及细胞对葡萄糖的摄入量,我们证实p21的确参与了糖酵解途径的调控。通过Real-time PCR技术和免疫印迹杂交技术,我们发现p21能够在乏氧条件下上调Glut1和LDHA来促进胶质瘤细胞在乏氧条件下的糖酵解。后续的实验也证明p21调控的糖酵解途径的确能够增强胶质瘤细胞在乏氧条件下的辐射抗性。因此,p21在乏氧条件下通过促进胶质瘤细胞的糖酵解途径增强肿瘤的辐射抗性。在分子机制方面,我们通过双荧光素酶报告基因系统验证了p21在乏氧条件下的表达升高是由于乏氧诱导因子HIF-1α直接结合在其启动子上并激活其转录。有趣的是,我们还发现被HIF-1α转录激活的p21能够反过来促进HIF-1α的转录,并且是乏氧条件下HIF-1α转录所必需的。因此,HIF-1α与p21之间存在着相互作用的正反馈调节回路。众所周知,HIF-1α是调控糖酵解途径的重要分子,HIF-1α能够与Glut1和LDHA的启动子结合并激活其转录。所以,HIF-1α与p21之间的正反馈调节回路能够增强乏氧条件下胶质瘤细胞内的糖酵解途径。为了验证上述在细胞和分子水平得到的结论,我们构建了能够稳定过表达p21的胶质瘤细胞用于动物实验。动物实验的结果表明,过表达p21可以增强胶质瘤的辐射抗性。通过对瘤体进行免疫组化染色,发现p21过表达的肿瘤中,HIF-1α、Glut1和LDHA的表达量均高于对照组。动物实验的结果与细胞水平的结果一致,因此我们得出结论:在胶质瘤中,p21与HIF-1α之间相互作用的正反馈调节回路通过促进糖酵解途径增强了乏氧导致的辐射抗性。
陈艳[2]（2021）在《FOXG1在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖迁移的作用研究》文中认为目的:肺癌在全球范围内高发,也是我国发病率最高的恶性肿瘤之一,且男性高发,起源于支气管粘膜或腺体。虽然针对肺癌的早期诊断和早期治疗已有一定成果,但肺癌的侵袭性使得治疗效果不理想。因此,提高肺癌的治疗效果、延长患者的生存时间、寻找新的治疗靶点已成为研究热点,主要以深入探索肺癌发病机制及其分子生物学机制为手段。FOXG1（Forkhead box G1）是一个在进化上高度保守的转录因子,在大脑中高表达,主要参与调节神经细胞的增殖和分化,其异常表达会引起神经系统相关疾病,如雷特综合征、以及其他自闭症谱系障碍疾病。近年来,关于FOXG1在肿瘤中的研究逐渐增多。已有研究表明,FOXG1的异常表达与神经胶质瘤、乳腺癌、卵巢癌,以及肝癌的发生发展密切相关,但是有关FOXG1与肺癌的相关性研究目前很少。本课题首先通过数据库和临床标本分析了FOXG1在肺癌中的表达水平及临床意义,进一步探讨了FOXG1对肺癌细胞增殖、凋亡、以及迁移能力的影响,为阐明肺癌发生的分子机制提供理论依据。方法:1利用TCGA和Oncomine在线数据库下载与FOXG1表达谱相关肺腺癌、肺鳞癌和小细胞肺癌的临床数据进行统计分析。2收集小细胞肺癌的临床标本,免疫组织化学分析FOXG1的表达。3 Cell Counting Kit-8实验测定过表达FOXG1对A549细胞增殖的影响。4 Transwell和伤口愈合实验研究过表达FOXG1对A549细胞迁移的影响。5流式细胞术检测过表达FOXG1对A549细胞的周期以及细胞凋亡的影响。6 Western blot分析过表达FOXG1对细胞周期负调控蛋白p21WAF1/CIP1、PI3K/AKT信号通路相关蛋白、以及上皮-间充质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白的表达影响。结果:1基于TCGA数据库数据,差异表达分析显示FOXG1在肺腺癌和肺鳞癌中都呈现高表达;总生存期分析显示,在肺腺癌患者中,FOXG1高表达的无复发生存期低于低表达患者;Oncomine数据库分析显示,在小细胞肺癌中FOXG1表达增高。2免疫组织化学显示,FOXG1在小细胞肺癌中的表达高于癌旁组织。3 CCK8实验结果显示,A549-FOXG1细胞的OD值高于A549-NC细胞,提示过表达FOXG1使A549细胞的增殖能力增强。4 Transwell实验结果显示,过表达FOXG1使A549细胞的迁移能力增强。5流式细胞检测结果显示,过表达FOXG1使A549细胞的S期细胞占比减少,并且细胞凋亡率降低。6 Western blot结果,分析提示过表达FOXG1后p21WAF1/CIP1表达显着降低;PI3K/AKT信号通路中PTEN、p53和BAX蛋白表达降低;EMT标志蛋白E-catenin、αE-catenin和Vimentin表达升高,但是β-catenin和N-cadherin表达下调。结论:1数据库分析结果显示FOXG1在不同病理类型的肺癌组织中表达高于正常组织。进一步对临床标本分析表明,FOXG1在小细胞肺癌中的表达高于癌旁组织。2过表达FOXG1能够促进A549细胞的增殖。FOXG1能够下调p21WAF1/CIP1的表达从而加快细胞周期进程;FOXG1可以通过调控PTEN-PI3K/AKT信号通路抑制细胞凋亡。3过表达FOXG1对A549细胞的迁移有一定的促进作用,但并不是通过EMT途径来调控的。
刘翔宇[3]（2020）在《miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究》文中认为背景:卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其发病率低于宫颈癌、子宫内膜癌,但卵巢癌的病死率显着高于另外两种肿瘤。在过去十年中卵巢癌的治疗方法虽有所发展,但由于早期阶段卵巢癌患者没有明显的症状,患者就诊时多已发生肿瘤的局部播散及远处转移,故卵巢癌患者的5年总生存率仍然较低,仅为30%-40%。卵巢癌的发生和发展是一个多阶段的过程,近年来,越来越多的研究表明micro RNA（miRNA）在卵巢癌的进展和转移等过程中发挥重要的调节作用,参与了肿瘤细胞增殖、凋亡、血管生成、迁移、侵袭和转移等过程,其中miR-195-5p被证实与多种肿瘤有关,但在卵巢癌中的作用及机制鲜有报道。目的:本研究旨在探究miR-195-5p能否调控卵巢癌的恶性生物学行为,进而深入分析可能的分子机制,即miR-195-5p通过调节下游靶基因影响卵巢癌的增殖、转移,从而为卵巢癌的治疗提供新策略,为卵巢癌提供新的预后预测指标。方法:1、收集天津医科大学附属肿瘤医院2017年10月至2018年12月之间卵巢癌患者行手术切除的上皮性卵巢癌组织标本共50例,同时收集正常卵巢组织标本50例,并培养正常卵巢细胞系（IOSE80）、卵巢癌细胞系（SKOV3、OVCAR3、A2780、ES-2）,通过实时定量PCR（q RT-PCR）技术观察、分别比较miR-195-5p在卵巢癌组织与正常卵巢组织、卵巢癌细胞系与正常卵巢细胞系中的表达情况。2、在miR-195-5p表达水平相对低的SKOV3细胞系中利用慢病毒构建稳定过表达miR-195-5p的细胞株,在miR-195-5p表达水平相对高的A2780细胞系中转染miR-195-5p inhibitor抑制内源性miR-195-5p表达,采用MTT、克隆形成、Ed U等细胞学实验观察miR-195-5p对卵巢癌细胞系增殖能力的影响;采用Transwell、划痕实验等方法观察miR-195-5p对卵巢癌细胞迁移能力的影响;通过流式细胞学技术,分析卵巢癌细胞系中过表达miR-195-5p后细胞周期的分布特点;通过小鼠体内成瘤实验,观察过表达miR-195-5p后小鼠体内移植瘤的生长情况。3、采用生物信息学方法预测miR-195-5p调控的靶基因,采用双荧光素酶报告系统分析miR-195-5p与其潜在靶基因--细胞分裂周期相关蛋白4（Cell Division Cycle-Associated protein 4,CDCA4）的靶向调控关系。q RT-PCR方法检测miR-195-5p和CDCA4在miR-195-5p过表达卵巢癌细胞系及对照组中的表达,同方法对比miR-195-5p和CDCA4在miR-195-5p低表达卵巢癌细胞系及对照组中的表达。Western Blotting方法检测miR-195-5p过表达/低表达卵巢癌细胞系中CDCA4的表达水平。在SKOV3细胞中采用Western Blotting方法检测miR-195-5p过表达组、miR-195-5p及CDCA4均过表达组、control三组中cyclin D1、p16的表达,细胞功能学实验明确三组细胞增殖能力的差异。4、q RT-PCR技术检测上皮性卵巢癌组织中miR-195-5p的表达水平、免疫组化方法检测卵巢癌组织中CDCA4的表达水平,分析miR-195-5p、CDCA4表达水平与卵巢癌临床病理学特征的关系;采用Kaplan-Meier法进行生存分析。结果:1、miR-195-5p在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中的表达下调卵巢癌组织中miR-195-5p的表达显着低于在正常卵巢组织中的表达,差异有统计学意义（P<0.001）,与卵巢正常细胞系（IOSE80）相比,miR-195-5p在卵巢癌细胞系中的表达均降低,差异有统计学意义（P<0.01）。2、miR-195-5p抑制卵巢癌细胞的增殖、迁移体外实验显示,过表达miR-195-5p可抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移;流式细胞学检测结果显示miR-195-5p的过表达可使细胞周期阻滞在G1期,减慢了其细胞周期进程。体内实验表明:过表达miR-195-5p的小鼠种植瘤,其体积及重量较对照组均降低。3、在卵巢中CDCA4是miR-195-5p的靶基因Starbase数据库显示CDCA4是miR-195-5p的潜在靶基因,继而使用双荧光素酶报告系统发现CDCA4 3’-UTR的活性能被miR-195-5p降低,进一步结合使用位点突变技术发现miR-195-5p结合位点突变的CDCA4 3’-UTR活性不能被miR-195-5p降低。卵巢癌细胞系中CDCA4的表达水平与miR-195-5p呈负相关,miR-195-5p通过对CDCA4的调节作用抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移,过表达CDCA4后可逆转miR-195-5p对卵巢癌细胞的抑制增殖作用。4、miR-195-5p、CDCA4表达水平与卵巢癌临床病理学特征的关系miR-195-5p在卵巢癌中的表达水平与有无淋巴结转移、组织学分级、FIGO分期有关,CDCA4在卵巢癌中的表达与病灶大小、组织学分级有关,miR-195-5p高表达的卵巢癌患者预后较好,CDCA4高表达的卵巢癌患者预后更差,miR-195-5p、FIGO分期是上皮性卵巢癌患者的独立预后因素。结论:上述研究表明:miR-195-5p在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中呈下调表达,miR-195-5p能够抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移能力,并且证实miR-195-5p可下调其靶基因CDCA4的表达从而抑制卵巢癌细胞的增殖、使细胞周期阻滞在G1期。在卵巢癌组织中miR-195-5p、CDCA4的表达与卵巢癌的组织学分级、生存状况等呈现显着的相关性。综上所述,miR-195-5p/CDCA4轴提供了一种解释卵巢癌疾病进展的机制,可成为卵巢癌诊断、治疗的潜在靶点,为卵巢癌临床治疗提供理论依据。
丁俊[4]（2020）在《SOCS1通过P21-CyclinD1/CDK4调控细胞周期抑制肝细胞癌进展的机制研究》文中研究说明【研究背景与实验目的】肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是全球性的健康问题,具有发病率高,死亡率高的特征,严重威胁人类的健康。孤立的小肝癌通常首选外科手术治疗,五年存活率可达50%以上。但肝癌发病隐匿,患者确诊时一般已达中晚期,仅有部分患者有机会接受肝移植,仍有许多患者需要接受传统化疗或近年新兴的基因治疗、靶向药物治疗和免疫治疗。众所周知,传统化疗药物的选择性低,毒副作用强;免疫治疗更是对实体肿瘤,尤其是肝细胞癌的疗效不佳。除此之外,接受手术治疗后的患者仍有70%以上的概率出现肝内播散或是肝外转移,使得肝癌的术后复发成为困扰医务工作者的另一大难题。近年来,随着诸如索拉菲尼和伊马替尼等靶向药物的加入,传统肝癌治疗的方式被拓宽到局部结合系统治疗,肝癌的药物治疗正被逐步优化。基于肿瘤是一种多基因改变和信号通路传导异常的疾病,更多的生物分子有望成为治疗靶点,且亟待研究,以此提高肝癌患者的治疗效果和总体生存。细胞因子信号传导抑制因子1（Suppressors of cytokine signaling 1,SOCS1）基因是SOCS蛋白家族中的一员,所有成员在结构上十分相似,均具有N末端区域、SH2区和SOCS盒结构域,可分别参与到信号蛋白的磷酸化过程和靶蛋白的泛素-蛋白酶体途径中。SOCS1在多种肿瘤中被报道为抑癌因子,并在肝癌中存在异常甲基化,但其在肝癌中的具体作用机制研究仍旧局限,尤其是针对肝癌细胞周期调控的机制值得探索。【研究内容与方法】本研究拟通过两部分实验阐释SOCS1在肝癌中的作用和机制:1.明确SCSO1在人肝癌组织及癌旁正常组织和肝癌细胞系中的表达水平,结合临床病理数据统计分析SOCS1对肝癌诊断和预后评估的价值。（1）运用Oncomine国际数据库收集SOCS1在正常肝脏、肝硬化组织和肝癌组织中的m RNA表达量,分析比较正常组与异常组的表达水平差异;（2）运用实时荧光定量聚合酶链式反应检测SOCS1在159例肝细胞癌患者的肝癌组织及匹配癌旁正常组织的m RNA表达水平;（3）运用免疫组织化学染色法检测SOCS1在90例肝细胞癌患者的肝癌组织及匹配癌旁正常组织的蛋白表达水平;（4）选取正常肝脏细胞系QSG-7701和七种肝癌细胞系（SMMC-7721、HPEG2、HEP3B、HUH7、HCC-LM3、MHCC-97H和SK-HEP-1）验证SOCS1在细胞系中表达趋势与肝癌组织的一致性;（5）运用Kaplan–Meier生存分析和log-rank检验分析SOCS1表达与肝细胞癌患者预后的关系;运用卡方检验分析SOCS1表达与患者临床病理数据的相关性。2.探索SOCS1在肝细胞癌细胞周期调控中的作用和机制,寻找肝癌增殖进展的理论依据,发掘肝癌治疗的新型潜在靶点。（1）使用慢病毒转染,构建稳定过表达SOCS1的SMMC-7721、HCC-LM3和MHCC-97H人肝癌细胞株,蛋白质印迹实验验证过表达效率;（2）使用高通量测序技术分析转录组基因差异表达,富集SOCS1潜在影响的信号通路;运用CCK-8、流式细胞术周期检测和Ed U实验检测SOCS1对肝癌细胞周期的具体作用,并锁定关键调控节点采用蛋白质印迹实验印证;（3）使用稳定过表达SOCS1的SMMC-7721细胞株和对照组细胞建立裸鼠异种移植肿瘤,观察SOCS1在体内对肿瘤生长的影响;运用免疫组织化学染色,进一步验证上述所得关键调控蛋白的表达水平;（4）结合测序结果,分析差异表达蛋白的调控途径。分离提取细胞质和细胞核蛋白,检测核内关键蛋白表达水平;加入放线菌酮药物检测蛋白降解半衰期;运用Co-Immunoprecipitation（Co-IP）实验证实蛋白互做中的结合关系;过表达关键调控分子的表达量,观察其对下游信号通路的逆转;运用STRING蛋白互做数据库分析所得蛋白是否存在确切关联。【结果】1.肝癌细胞系、肝癌组织中SOCS1的m RNA和蛋白质表达水平较之正常肝癌细胞系和癌旁正常组织低表达（P<0.0001）;2.SOCS1与临床病理数据分析发现,SOCS1的表达水平与肿瘤大小相关（P=0.02）,且高表达SOCS1患者组较之低表达组拥有更高的无瘤生存率（P=0.0042）和总体生存率（P=0.0265）;3.高通量测序分析差异基因并富集信号通路,发现SOCS1与细胞周期和泛素化途径存在相关性,提示肝癌中可能存在SOCS1调控细胞周期关键分子的泛素化修饰从而抑制肝癌细胞增殖的信号通路;4.过表达SOCS1后,SMCC-7721,HCC-LM3和MHCC-97H的细胞扩增速率显着下降（P<0.0001）;HCC-LM3和SMCC-7721细胞株的细胞周期阻滞在G1期（P<0.05）,S期细胞占比显着减少（P<0.005）,MHCC-97H细胞株并未观察到明显的周期阻滞;Ed U实验证实HCC-LM3和SMCC-7721两种细胞株在过表达SOCS1后存在细胞周期的G1-S期转化阻滞;5.细胞周期G1期的关键调控分子Retinoblastoma（Rb）的磷酸化水平在SOCS1过表达后显着下调,阻断细胞周期进展。另一关键调控分子Cyclin D1蛋白质表达水平升高,其上游P21和P27的蛋白质表达水平下调;6.体内实验中,过表达SOCS1的SMCC-7721细胞株生长受到明显抑制,成瘤大小显着小于对照组（P<0.001）;肿瘤组织切片运用免疫组织化学染色证实关键调控蛋白分子差异表达与上述结果一致;7.SOCS1过表达后P21和P27的转录水平未受到明显改变,通过MG-132药物的时间梯度实验,提示P21存在泛素化修饰的可能,并通过Co-IP证实P21受泛素化调节,进而影响Cyclin D1/CDK4复合体在细胞核内稳定性;8.分离提取细胞质和细胞核蛋白后运用蛋白质印迹检测,发现SOCS1过表达后核内发挥作用的Cyclin D1蛋白总量下调,包含了更多失活的Phospho-Cyclin D1,无法正常结合CDK4;9.过表达SOCS1后的稳定转染细胞株,再经P21的过表达,可以将上述细胞周期信号通路的差异表达逆转,减少Cyclin D1在核内的失活量,利于稳定Cyclin D1/CDK4复合体;10.Co-IP实验进一步证实CDK4所能结合的Cyclin D1蛋白量在SOCS1过表达后显着减少;SOCS1与泛素连接酶E3复合体中的Ring-box 1（RBX1）存在结合关系,可募集泛素转移酶E2促进靶标蛋白经泛素-蛋白酶体途径降解。【结论】1.SOCS1在肝癌细胞和患者肝癌组织中低表达,且与肿瘤大小存在相关性。2.通过高通量测序分析和实验论证,在肝癌中发现SOCS1可以有效调控P21-Cyclin D1/CDK4-Rb细胞周期信号通路。3.SOCS1在肝癌中有明确的抑癌作用,通过细胞周期阻滞可以抑制肝癌的发展,在细胞周期信号网络中发挥了重要作用,可能作为潜在靶点治疗肝癌。
李璐[5]（2019）在《HPV E6/E7通过IFI16/p53通路调控宫颈上皮细胞生物学功能的机制研究》文中指出研究背景:宫颈癌是世界范围内常见的女性恶性肿瘤,每年有超过50万的新增病例,其中超过26万的患者死于宫颈癌。宫颈癌的发生和发展是一个复杂的生物学过程,涉及多种因素和步骤。目前已经证明,高危型人乳头瘤病毒（Human papillomavirus,HPV）,如 HPV16、18、33、52 和 58 型等,是其主要的致病因素。其中,HPV16、18是最常见最致癌的高危型HPV,导致超过75%的子宫颈癌病例。高危型HPV E6和E7基因的不受控表达,在功能上相当于p53和pRb基因突变,会导致细胞永生化、遗传不稳定、遗传突变的积累以及由此产生的恶性转化。E6和E7癌蛋白在被感染的宫颈上皮细胞中的表达所导致的细胞生物学功能的改变以及涉及到的具体的分子机制一直是科研人员研究的热点。干扰素诱导蛋白 16（Interferon-inducible protein16,IFI16）是 HIN-200（The Interferon（IFN）-inducible p200-protern）家族成员之一。IFI16 蛋白具有家族成员共有的结构基序,N末端的PYRIN结构域（PYRIN domain,PYD）以及C末端包含两个相对保守的约200个氨基酸的HIN结构域。PYD常见于细胞死亡相关蛋白,如热蛋白（PYRIN）,凋亡相关斑点样蛋白（ASC）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase）,也被称为PAAD/DAPIN结构域,已发现在IFI16的N末端存在PYD,表明IFI16可能在细胞凋亡调控过程中发挥关键作用。IFI16蛋白中的PYD是同型蛋白质-蛋白质相互作用的结构域,其允许IFI16与其他蛋白的相互作用,包括BRCAI、pRb、p53、E2F以及NF-K B等。HIN结构域含有两个联系的寡核苷酸/寡糖结合折叠（Oligonucleotide/oligosaccharide-binding folds,OB-folds）,其允许IFI16结合单链或双链DNA。此外,在HIN结构域还含有pRb结合区域和p53结合区域。与其他家族成员相比,IFI16具有更加广泛的功能:1)IFI16可以作为双链DNA感受器,引起针对某些病原体或破碎细胞的免疫反应;2)参与损伤组织或肿瘤形成过程中的血管形成;3)作为促炎蛋白,在自身免疫系统疾病中发挥作用;4)参与细胞增殖、细胞凋亡、细胞衰老和细胞周期的调控。与此同时,IFI16与癌症发生相关的证据也正在积累。目前,已经发现了 IFI16在肝细胞癌、头颈部肿瘤、乳腺癌和口腔鳞状细胞癌等9种人类实体瘤中的作用;然而很少有研究报道IFI16与宫颈癌以及HPV感染的相关性。有研究表明,IFI16在乳腺癌中表达下调,其表达还与头颈部鳞状细胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC）的等级呈显着负相关,并与HNSCC的生长、凋亡、血管生成和炎症密切相关。另外有研究表明,前列腺上皮细胞中IFI16基因的组蛋白去乙酰酶依赖性转录沉默有利于前列腺癌的发展。与IFI16在乳腺癌、HNSCC和前列腺癌中的抑癌作用相反,有研究人员在睾丸癌和化学抗性上皮卵巢癌组织中发现了 IFI16蛋白的表达明显上调,但目前并没有相关的功能和机制研究。此外,IFI16与p53之间的相互作用也持续得到研究人员的关注。有研究表明,IFI16可以在DNA损伤、电离辐射或者氧化应激等状态下激活p53的表达,影响p53下游靶蛋白的表达以及p53介导的细胞凋亡和周期调控,从而影响肿瘤的发生和发展。目前已经明确,高危型HPV E6蛋白主要通过影响p53的表达,调控p53介导的细胞周期和细胞凋亡,从而诱导宫颈癌的发生。有研究表明,在与E6配合的复合物中,细胞泛素连接酶E6-associated protei n（E6AP）靶向p53,对其进行泛素化和降解,从而导致HPV诱导的宫颈癌。E6以一种未知的机制作为E6AP强有力的激活剂发挥功能。尽管有研究表示E6AP的LxxLL基序可以与E6结合,引起构象变化,使E6能够与p53结合,但人们对肪蛋白与p53之间具体的作用机制仍然不甚清楚。第一部分:IFI16在宫颈癌组织中的表达水平及意义研究目的:研究IFI16在宫颈癌组织和其他肿瘤中的表达水平及其与临床病理特征的相关性分析。研究方法:1.使用GEPIA在线工具分析基于TCGA和GTEx数据库中9,736个肿瘤和8,587个正常样本的RNA测序表达数据,分析IFI16在泛肿瘤中的表达水平以及和预后的关系。检索PUBMED数据库中IFI16在各肿瘤中的研究现状。2.免疫组化检测:使用宫颈癌组织芯片进行免疫组织化学检测,检测宫颈癌和癌旁组织中IFI16的表达水平,以及IFI16的表达与各种临床病理特征的相关性。研究结果:1.GEPIA分析结果显示,在数据库的31种肿瘤中,IFI16在胆癌（CHOL）等11种肿瘤中表达上调,在嫌色细胞癌（KICH）等4种肿瘤中表达下调。生存分析发现,在肾透明细胞癌（KIRC）,肾乳头状细胞瘤（KIRP）,低级胶质瘤（LGG）中,IFI16低表达的患者预后好（P<0.05）,同时我们发现在数据库提供的31种肿瘤数据中,IFI16在宫颈癌（CESC）中表达水平最高。2.在PUBMED中,我们检索了 IFI16肿瘤研究相关的文献,检索结果显示,IFI16与多种肿瘤发生相关。体外实验中,IFI16在前列腺细胞和甲状腺髓样癌细胞,乳腺癌,头颈鳞状癌细胞中发挥抑癌基因的作用,在淋巴瘤、Wilms肾细胞癌及肝细胞癌中IFI16的过表达会促进肿瘤细胞的增殖,而对于IFI16在宫颈癌中的研究仍少有报道。3.免疫组化结果显示,在宫颈癌组织中,IFI16的阳性表达率为67.7%,而在癌旁组织中,IFI16的阳性表达率仅为12.9%,有显着差异（p<0.01）。进一步的病理特征分析统计结果显示,IFI16的表达水平与肿瘤的大小和患者的年龄无明显统计学相关性（p>0.05）,但是与肿瘤分化程度相关。在低分化肿瘤组织中,IFI16的表达明显高于中分化肿瘤组织,差异具有统计学意义（p<0.05）。研究结论:在TCGA和GTEx数据库中,IFI16在11种肿瘤中表达上调,在4种肿瘤中表达下调。所有肿瘤中,IFI16在宫颈癌中表达最高。文献检索显示IFI16与多种肿瘤发生密切相关,而在宫颈癌中尚少有报道。IFI16在宫颈癌组织中较癌旁组织高表达,且表达水平与肿瘤分化程度密切相关,在低分化肿瘤组织中呈高表达趋势。第二部分:HPV18 E6E7通过下调IFI16的表达影响人宫颈上皮永生化细胞（H8细胞）的生物学功能研究目的:构建过表达HPV-ME7蛋白的H8稳转株细胞,并探究HPV E6/E7通过抑制IFI16的表达影响H8细胞生物学功能。研究方法:1 从pcDNA3.1-HPV18-E6 和 pcDNA3.1-HPV18-E7质粒中分别扩增出 HPV18 E6和E7基因,将E6,E7基因经重叠PCR（OVERLAP PCR）扩增连接后再克隆到穿梭质粒pLVX-mCMV-ZsGreenl-Puro上,以空载体为对照,使用重组质粒进行慢病毒包装。慢病毒感染H8细胞后使用嘌呤霉素筛选H8-E6E7稳转株细胞,利用荧光观察以及PCR检测两种方法鉴定稳转株。2利用CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验和细胞凋亡实验,检测E6E7表达对细胞增殖、克隆形成能力、迁移、侵袭和细胞凋亡的影响,3利用western blot实验检测H8细胞中HPV-E6E7的过表达对IFI16蛋白表达的影响。4分别在野生型（WT）H8细胞和H8-E6E7细胞中上调IFI16的表达,利用CCK8实验和克隆形成实验检测过表达IFI6对两种细胞增殖的影响,利用流式细胞仪和western blot检测过表达IFI16对细胞凋亡的影响,探究HPV-E6E7是否通过调控IFI16的表达来影响H8细胞的生物学功能。研究结果:1.通过荧光观察以及PCR检测,成功的筛选出稳定表达HPV-E6E7蛋白的H8稳转株细胞。2.CCK8实验结果显示,H8-E6E7细胞的增殖速率明显高于对照组H8-WT细胞。在培养72h后,H8-E6E7细胞的OD值显着高于H8-WT细胞的OD值（P<0.05）。细胞克隆实验结果显示,H8-E6E7细胞的克隆形成数目和克隆大小明显高于对照组 H8-WT 细胞（K0.05）。3 Transwell实验检测发现,在相同时间内,H8-E6E7细胞完成迁移和侵袭的细胞数目都明显高于对照组H8-WT细胞。统计分析结果表明,H8-WT细胞完成迁移的细胞数目为63±4个,完成侵袭的细胞数目为73±6个;而H8-E6E7细胞完成迁移的细胞数目为140±14个,完成侵袭的细胞数目为168±13个;两者的差异具有统计学意义（P<0.05）。4流式细胞仪检测结果表明E6E7的过表达抑制了 H8细胞的凋亡。对照组H8-WT细胞的凋亡比例为7.65%±0.95%,而H8-E6E7细胞的凋亡比例显着降低,仅为 1.86%±0.33%（P<0.05）。western blot 的实验结果显示,H8 细胞中 E6E7的过表达能够促进抗凋亡蛋白Bcl2的表达,同时会抑制促凋亡蛋白Bax和Caspase-3 的表达。5.H8细胞中HPV E6E7的过表达下调了细胞内IFI16的表达。H8-WT细胞中IFI16 mRNA的表达水平显着高于H8-E6E7细胞（p<0.01）,是H8-E6E7细胞中IFI16 mRNA表达水平的20倍以上。蛋白表达趋势与mRNA表达趋势一致:H8-WT细胞中IFI16的蛋白表达水平显着高于H8-E6E7细胞（p<0.01）,是H8-E6E7细胞中IFI16蛋白表达水平的5倍左右。6.CCK8实验结果表明,IFI16的过表达能够抑制H8细胞的增殖。同时,过表达IFI16能够部分抵消E6E7蛋白表达对细胞增殖的促进作用,四个实验分组中,细胞的增殖速率为:H8-E6E7>H8-E6E7+IFI16>H8-WT>H8-WT+IFI16,实验结果差异显着,具有统计学意义（K0.05）。克隆形成实验中,各组实验结果与CCK8实验结果一致,四组细胞的克隆形成数目为:H8-E6E7>H8-E6E7+IFI16>H8-WT>H8-WT+IFI16,结果差异具有统计学意义（P<0.05）。7.IFI16的过表达能够影响细胞内凋亡相关蛋白的表达。H8细胞中过表达IFI16抑制了凋亡抑制蛋白Bcl2的表达,上调了促凋亡蛋白Bax和Caspase3的表达。在E6E7过表达的H8细胞中,上调IFI16的表达能够减弱E6E7引起的抗凋亡作用。研究结论:在H8细胞中,过表达E6E7后,能够促进细胞的增殖和克隆形成能力,细胞的转移能力增强,同时细胞的抗凋亡能力增加,E6E7蛋白的过表达使永生化的宫颈上皮细胞获得了肿瘤细胞的特性。E6E7的上调会抑制IFI16mRNA和蛋白的表达。H8细胞中IFI16的上调会减弱E6E7引起的促细胞增殖和抗凋亡能力,IFI16起到抑癌基因的作用。第三部分:IFI16参与调控H8细胞内p53的表达研究目的:通过研究H8细胞中IFI16与抑癌基因p53之间的关系,探究IFI16参与调控H8细胞增殖和凋亡的分子机制。研究方法:1.使用蛋白结合预测工具STRING在线预测IFI16的结合蛋白,挑选p53蛋白进行后续验证。2.将pcDNA3.1-IH16-FLAG和pcDNA3.1TP53-HIS质粒共转染到H8细胞中,48h后收集细胞总蛋白,进行蛋白免疫共沉淀实验,检测IFI16和p53蛋白的结合。3.分别在H8细胞和H8 E6E7细胞中过表达IFI16基因,Westernblot检测IFI16过表达后对p53蛋白表达量的影响。4.在H8细胞中过表达IFI16,分别在实验组和对照组中加入放线菌酮,抑制新蛋白的合成,分别在0,1,2,4,6h收集蛋白,Westernblot检测p53的表达,探究IFI16的表达对p53蛋白稳定性的影响。研究结果:1.免疫共沉淀实验结果显示,在H8细胞中过表达的IFI16和p53蛋白能够互相结合。2.Westernblot实验结果显示,在H8细胞中,过表达E6E7能够降低p53蛋白的表达（p<0.05）;上调IFI16后,两组细胞中p53的蛋白表达量均上升（p<0.05）。3.蛋白降解实验结果显示,IFI16过表达组中P53蛋白的降解速率较对照组明显减慢,说明IFI16的表达有利于P53蛋白的稳定性。研究结论:在宫颈上皮H8细胞中,IFI16可以上调p53的表达,E6和E7蛋白可能通过抑制IFI16表达来降低p53水平发挥促癌作用。IFI16可以与H8细胞内的P53蛋白相结合,维持P53蛋白的稳定性,增加细胞内P53蛋白的积累,可能通过此途径来发挥抑癌作用。研究意义:本研究首先通过免疫组化方法发现IFI16在宫颈癌组织中较癌旁组织高表达,且表达水平与肿瘤分化程度相关。然后通过慢病毒感染的方法成功构建了 HPV-E6E7稳定高表达的H8细胞株,使细胞的增殖,转移,抗凋亡能力增强,使细胞具有了肿瘤细胞的特性。后续实验结果证明了 E6E7的过表达会抑制IFI16mRNA和蛋白的表达,而H8细胞中IFI16的上调会减弱E6E7引起的促细胞增殖和抗凋亡能力,表明IFI16起到了抑癌基因的作用;这种作用可能是通过和抑癌基因P53蛋白结合,增加其稳定性而实现的,而HPV-E6E7的促癌作用可能是通过下调IFI16-P53蛋白的表达来实现的。本研究中我们发现了 IFI16与HPV感染、宫颈上皮细胞癌变和p53表达之间的相关性,探索了高危型HPV在宫颈癌发生中可能具备的新的分子机制,为宫颈癌的防治提供了新的思路和理论途径。
何彬[6]（2019）在《HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究》文中研究表明背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）的发病率在我国高居恶性肿瘤的第四位,死亡率更是高居第三位。我国每年新发肝癌46.6万,每年因肝癌死亡42.2万,两者均占全世界总数的50%以上。肝细胞癌具有起病隐匿、早期诊断困难、肝切除术后容易复发转移和晚期治愈率低等特点,对我国乃至全球人民的健康造成极其严重的危害。因此,早期肿瘤标志物的寻找、个体化精准诊断和治疗的实施、预后复发转移预警标记物的确立是目前肝癌诊治中亟需解决的问题。目的1.比较HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌与相应癌旁组织中的表达差异,分析HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝癌患者临床病理特征及预后之间的相关性,从而验证HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌中作为新型分子标志物的潜在价值。2.明确JNJ-26481585对肝癌细胞体外增殖和体内成瘤的抑制作用,并利用细胞和分子生物学技术探讨JNJ-26481585抑制肝癌细胞增殖的机制,进一步探究JNJ-26481585促进肝癌细胞G0/G1期阻滞及诱导肝癌细胞凋亡的具体机制。3.明确JNJ-26481585与Sorafenib联合应用可以呈协同方式,抑制肝癌细胞体外增殖和体内成瘤,进一步探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用在体内外协同抑制肝癌细胞增殖的分子机制。4.探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。方法1.使用蛋白免疫印迹、免疫组织化学实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝细胞癌组织和对应癌旁组织中的表达水平,评价HDAC1、HDAC2、HDAC4在这两种组织中的表达差异。根据免疫组织化学评分结果,分析111例肝细胞癌组织中IHEDAC1、HDAC2、HDAC4的表达水平与临床病理特征及预后之间的相关性。2.使用实时荧光定量PCR实验评估HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞QSG-7701中mRNA的表达水平。3.通过CCK-8细胞活力检测、平板克隆形成、EDU实验,评估JNJ-26481585对肝癌细胞增殖的抑制作用。利用流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡,探究JNJ-26481585对肝癌细胞周期、凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的作用。4.利用流式细胞术检测AKT抑制剂MK2206 2HCL对JNJ-26481585诱导细胞周期的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞周期阻滞的分子机制。5.利用流式细胞术检测Caspase抑制剂Z-VAD-FMK对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探索JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。6.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585诱导细胞凋亡的分子机制。7.利用CompuSyn软件计算JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后的联合指数（Combination Index,CI）,明确 JNJ-26481585 与 Sorafenib 联合应用呈协同方式,并且确定两药联合应用的最佳搭配浓度。8.利用流式细胞术检测细胞凋亡,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对肝癌细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验评估JNJ-26481585对细胞凋亡相关蛋白的作用。9.利用流式细胞术检测JNK抑制剂SP600125对JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后诱导细胞凋亡的影响,利用蛋白免疫印迹实验探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。10.在裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型中,评估JNJ-26481585在体内抑制肝癌细胞生长以及与Sorafenib联用后抑制肝癌细胞增殖的作用。11.利用HE染色法检测裸鼠HCC-LM3皮下移植瘤模型体内重要脏器的组织形态学变化,探究JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠的毒副作用。12.利用免疫组化检测裸鼠瘤体组织的磷酸化JNK、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP、Ki67的蛋白表达情况;通过Tunel染色检测瘤体肿瘤细胞的凋亡情况;从而在体内探索JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后协同促进细胞凋亡的分子机制。结果1.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平在肝癌组织中要高于相应癌旁组织。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,即HDAC1在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,门静脉血管就越容易被肿瘤侵犯,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度;HDAC2在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,组织学分化程度就越差;HDAC4在肝细胞癌组织中的表达量越高,肝细胞癌患者肿瘤就越大,TNM分期就越高以及更低的组织学分化程度。3.HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的表达水平与肝细胞癌患者术后总体生存率存在着密切关系,即低表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显长于高表达患者。4.HDAC1、HDAC2、]HEDAC4在肝癌细胞系中的mRNA表达水平要高于正常肝细胞。5.JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而诱导肝癌细胞周期阻滞。6.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP、Bax 的表达,抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-2、Survivin的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。7.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外均能够协同抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡。8.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。9.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。结论1.HDAC1、HDAC2、HDAC4 在肝癌组织显着高表达,HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达与肝细胞癌患者临床病理特征存在密切关系,高表达HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白的患者术后总体生存时间要明显短于低表达患者。2.HDAC1、HDAC2、HDAC4对患者预后具有预警价值,未来有希望作为肝细胞癌术后新型预警分子标记物。3.JNJ-26481585通过调控PIBK/AKT通路,下调磷酸化AKT,上调p21,促进周期相关蛋白的表达,从而促进肝癌细胞的周期阻滞。4.JNJ-26481585通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化JNK,促进促凋亡蛋白的表达,抑制抗凋亡蛋白的表达水平,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。5.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后在体内体外通过调控JNK/c-jun通路,激活磷酸化 JNK,促进促凋亡蛋白 Cleaved-caspase-3、Cleaved-caspase-9、Cleaved-PARP的表达,从而诱导肝癌细胞发生凋亡。6.JNJ-26481585与Sorafenib联合应用后对裸鼠体内重要脏器无明显毒副作用。
柯瑞盛[7]（2019）在《miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究》文中进行了进一步梳理第一章 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床意义及分子功能机制研究背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）主要是以手术切除为主的综合治疗,但大多数患者预后未达到理想预期。因此,改善HCC的早期诊断和预测预后、探索更多有效的治疗方法,是目前临床上急需解决的难题。MicroRNAs（miRNA）在各种恶性肿瘤的进展中起关键作用。表达异常的miRNA具有显着的临床意义,能够调控肿瘤进展的相关过程,表现出改善肿瘤靶向治疗的巨大潜能。本研究从GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中的HCC相关miRNAs差异表达谱,筛选到了在HCC中表达水平显着上调的miR-423,进一步预测了其潜在靶基因为转化生长因子β受体III（Transforming growth factor beta receptor III,TGFBR3）,并结合已有文献报道,本研究推测miR-423可能是通过调控TGFBR3来影响PI3K/AKT通路发挥其在肝癌中的功能。本项目的研究结果将丰富肝癌中功能miRNA的种类,为该疾病的提供一种新的生物标记物及潜在治疗靶点。目的:本研究通过临床研究、功能研究及分子机制研究,评估miR-423-5p和TGFBR3在肝细胞癌中的临床意义,以及肝细胞癌进展中的生物学功能和分子机制。方法:先从GEO数据库四个不同的数据集中筛选得到了在HCC中表达异常的miR-423,并用生物信息学预测其靶基因为TGFBR3,Kaplan Meier-plotter数据库分别分析miR-423和TGFBR3与肝癌患者的预后关系,FunRich软件分析miR-423-5p和TGFBR3可能涉及了PI3K/AKT信号通路。再用生物信息学分别分析了miR-423-5p和TGFBR3在GEO和TCGA数据库的HCC相关数据中的表达水平和临床意义,使用LinkedOmics数据库分别对miR-423-5p和TGFBR3在HCC中行表达关系分析和GSEA分析,用在线STRING数据库构建TGFBR3的蛋白-蛋白互作（PPI）网络,并分析TGFBR3基因在人体肿瘤中可能涉及的KEGG信号通路。再回顾性收集本中心132例肝癌患者的组织标本和临床预后信息,使用定量实时PCR（qRT-PCR）用于评估miR-423-5p和TGFBR3的表达。通过ROC曲线分析,Kaplan-Meier生存曲线分析和多因素Cox回归分析等统计方法分别评估miR-423-5p和TGFBR3的临床意义。体外细胞实验研究miR-423-5p和TGFBR3对HCC细胞中细胞生物行为的影响:MTT实验法检测HCC细胞增殖能力,Transwell法观察HCC细胞迁移及侵袭能力,流式细胞术测HCC细胞凋亡情况;体内实验通过构建裸鼠成瘤模型检测miR-423-5p和TGFBR3不同表达对肿瘤生长的影响。双荧光素酶报告基因实验和蛋白质免疫印迹实验（Western Blot,WB）验证HCC中miR-423-5p和TGFBR3之间的表达调控关系。WB实验评估分子机制研究中PI3K/AKT通路涉及的关键蛋白质水平,并用分别用MTT法,Transwell小室法,流式细胞术等检测在HCC细胞中miR-423-5p和TGFBR3是否通过PI3K/AKT通路影响细胞生物学行为。结果:通过对4个GEO数据集中分析筛选,我们寻找HCC中关键基因miR-423,miR-423在GEO数据库（GSE22058）/TCGA数据库总均为高表达。Kaplan Meier-plotter数据库分别结果表明miR-423高表达的HCC患者预后不良（P<0.05）,在GSE20594数据集中miR-423高表达与HCC患者BCLC分期,血管侵犯显着相关（P<0.05）。LinkedOmics数据库结果提示TCGA中miR-423表达与HCC患者的年龄、种群、病理分级、肿瘤T分期、肿瘤N分期、总体生存预后均显着相关（n=375例,P<0.05）。GSEA分析结果显示miR-423可能参与HCC发生发展的细胞周期,DNA复制,癌症相关miRNA,p53信号通路等肿瘤发展相关生物学活动。miR-423-5p在HCC组织和细胞系中的表达均显着上调。在132例HCC患者中,miR-423-5p可以用作诊断生物标志物来区分HCC组织和非癌组织。高表达的miR-423-5p与患者的淋巴结转移,TMN分期及生存预后较差等均显着相关。HCC细胞中表达上调的miR-423-5p在体外可促进HCC细胞增值,迁移侵袭和抑制细胞凋亡,并于体内可促进肝癌生长。GEPIA,Kaplan Meier-plotter和CCLE数据库结果显示TGFBR3在人类不同肿瘤中主要呈现低表达,与多种肿瘤的不良预后相关。TGFBR3蛋白的PPI网络分析也富集得到TGFBR3蛋白参与多种癌症发生和进展相关的KEGG通路。生物信息学分析提示HCC中TGFBR3可能是miR-423-5p靶基因,在LinkedOmics数据库中低表达的TGFBR3与miR-423-5p表达呈负相关。TGFBR3在HCC组织和细胞系中的表达显着降低。我们通过双荧光素酶报告实验和蛋白质免疫印迹实验证明了miR-423-5p在HCC中靶向负调控TGFBR3,miR-423-5p过表达可抑制TGFBR3的表达。低表达的TGFBR3与132例HCC患者的TMN分期,淋巴结转移和生存预后较差均具有显着相关。肝癌细胞中TGFBR3过表达在体外具有抑制HCC细胞增值,迁移侵袭和促进凋亡作用,并且在体内可以抑制肿瘤生长。miR-423-5p上调表达可激活PI3K/AKT信号通路影响HCC细胞的生物学活动。表达上调的TGFBR3能够拮抗逆转miR-423-5p过表达的生物学功能及其对PI3K/AKT信号通路的激活作用。结论:miR-423-5p和TGFBR3的表达异常均可作为HCC患者两种候选诊断和预后的生物标志物。在HCC中,高表达的miR-423-5p可能通过靶向负调控抑制TGFBR3表达,从而激活了PI3K/AKT信号通路活性来促进HCC增殖,转移侵袭等恶性进展。抑制miR-423-5p表达或增强TGFBR3表达的治疗策略可能有助于改善HCC预后并且可作为肝癌潜在的治疗靶标。第二章 HNRNPA1在HBV相关肝细胞癌中的临床价值及分子机制研究背景:由于乙型肝炎病毒（HVB）感染率较高,使得中国每年新发HCC患者占到全世界新发病例总数的55%。然而,根治性切除和肝移植等综合多种治疗的预后仍未达到满意预期。根据报道,约有30%HCC患者的AFP为阴性,发现其他敏感肿瘤生化标志并研究其分子机制,对于HCC患者尤为重要。大量研究表明,HNRNPA1在人类多种恶性癌症中表达异常且参与肿瘤的进展及预后。HNRNPA1在HBV阳性HCC中的功能作用研究相对较少,本研究结合生物信息学分析希望可以了解HNRNPA1与HBV阳性HCC（HBV-HCC）患者临床预后之间的关系,并探讨HNRNPA1在HBV-HCC中的分子机制,为HCC的早期及时干预和个性化治疗提供新防治思路和的治疗靶点。目的:探讨HNRNPA1表达在HBV阳性肝细胞癌（HCC）中的临床价值,并初步对HNRNPA1在HCC细胞中表达及潜在分子功能进行研究。方法:本研究先利用GEPIA、TCGA、GEO等数据库对HNRNPA1基因在肝细胞癌和正常肝组织中表达进行生物信息学分析,并预测了HNRNPA1表达与肝细胞癌预后的关系。再用逆转录-定量聚合酶链反应法（RT-q PCR）和免疫组织化学法（IHC）验证HCC中HNRNPA1表达,进一步验证HNRNPA1表达与HCC患者预后的关系。再从Linked Omics和c Bio Portal数据库筛选与HNRNPA1共表达基因,DAVID 6.7数据库对HNRNPA1共表达基因进行GO和KEGG分析,用STRING数据库来构建HNRNPA1共表达蛋白-蛋白间的互作网络（PPI网络）,并用Cytoscape软件对PPI网络进行可视化处理。最后在HBV相关的HCC细胞中,用双荧光素酶报告实验和蛋白质免疫印迹实验分析HNRNPA1分别与mi R-22和EGFR信号通路的关系。结果:通过综合分析了来自GEPIA,GEO和TCGA等数据库的数据,结果发现HNRNPA1表达在HBV阳性HCC样品中显着性增高,该结果通过本中心的RT-q PCR和IHC实验验证得到支持。在GSE14520数据集和151例HBV-HCC患者中的生存分析显示HNRNPA1高表达患者的总体存活率显着降低。在GSE14520数据集中高表达的HNRNPA1对HBV相关HCC患者具有一定的预后诊断应用意义。此外,GO和KEGG分析均证明HNRNPA1共表达基因参与翻译,核糖核蛋白复合物生物合成和组装,核糖体生物发生,RNA加工,RNA剪接等。可视化后的PPI网络显示了HNRNPA1与SNRPD1、SNRPD2、POLR2H和RBMX等共表达并存在直接作用。基因组富集分析（GSEA）显示了HNRNPA1可能通过细胞周期和WNT信号传导途径等影响HCC进展。生物信息学预测到了mi R-22基因可能是HNRNPA1上游调控mi RNA,Linked Omics数据库提示了mi R-22低表达与HNRNPA1高表达在HCC中表达关系为负相关,荧光素酶报告实验结果也提示HNRNPA1基因在HBV-HCC中是mi R-22的下游直接靶基因,在mi R-22过表达的HBV-HCC细胞中HNRNPA1表达降低。蛋白质免疫印迹实验结果表明HNRNPA1可能在HBV相关的HCC中通过EGFR信号通路起到癌基因的作用。结论:HCC组织中的HNRNPA1高表达作为癌基因起作用,与HCC术后复发率较高相关。HNRNPA1的表达上调与HBV相关HCC切除术患者的不良预后相关,可以作为HBV相关HCC患者预后的生物学标志物。SNRPD1,SNRPD2,POLR2H和RBMX等蛋白与HNRNPA1蛋白可能存在直接相互作用,并且表达均与HNRNPA1呈现正相关,可能影响HNRNPA1的功能。在HBV相关的HCC中,HNRNPA1是mi R-22的直接负调节靶标,并且HNRNPA1可以通过EGFR信号传导途径充当癌基因,可以作为HBV阳性HCC患者的潜在治疗靶点。
陈天驰[8]（2019）在《HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的分子机制研究》文中研究说明背景:肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）大约占肝癌的75%,是一种病死率很高的恶性肿瘤。虽然针对肝细胞癌的治疗方法较多,但根治性的治疗手段仍旧是手术切除和肝移植。目前,HCC患者术后的高复发率和死亡率是导致患者术后五年总生存率偏低（仅为18%）的重要原因。要提高HCC的治疗效果,除了医疗诊治技术手段的不断提升,了解该疾病的发生发展机制并找出合适的干预治疗靶点亦十分重要。同时,肝癌的众多生物学功能中,肿瘤细胞不受控制地增殖是肝细胞癌进展的重要原因之一。综上,研究HCC增殖过程中的关键分子机制有望为该疾病的治疗提供新的理论基础及治疗策略。目的:本课题旨在研究HJURP分子促进肝细胞癌增殖的分子机制,并在肝癌细胞系和临床大样本中验证该分子的表达水平并探究其临床意义。首先,从体外构建HJURP稳定敲低及过表达的细胞模型,其次,在体外和体内水平上验证该分子能够调控肝癌细胞增殖的生物学功能,最终,深入阐明HJURP抑制p21表达的具体信号通路及分子机制。材料与方法:1、从浙江大学医学院附属第一医院肝胆胰外科收集219对肝癌及匹配的癌旁组织标本,从医院病历系统中统计相关的临床病理信息,利用实时荧光定量PCR、免疫组织化学的方法检测HJURP分子在HCC组织及癌旁组织的表达水平,分析HJURP与临床病理特征及HCC患者预后的相关性;2、从Oncomine数据库中提取HJURP分子在肝癌及癌旁组织中的表达数据,进行统计分析;3、通过慢病毒转染对肝癌细胞系HCC-LM3,Huh7进行转染,构建稳定敲低细胞株,用MHCC-97H细胞构建HJURP过表达细胞株,运用CCK-8、流式细胞周期检测、克隆形成及裸鼠皮下成瘤实验来验证HJURP促进肝细胞癌增殖的生物学功能,并用western免疫印迹实验检测细胞周期G1期相关的关键蛋白;4、在HJURP稳定转染的细胞模型中,运用western免疫印迹、免疫荧光验证HJURP调控抑癌分子p21的核浆穿梭,利用蛋白质免疫共沉淀技术检测p21的泛素化水平,并用免疫组织化学的方法在组织标本中证实HJURP与p21的表达呈负相关;5、在HJURP稳定转染的肝癌细胞株中,运用western免疫印迹实验通过信号通路的抑制剂及激活剂验证HJURP通过抑制MAPK/ERK1/2和激活AKT/GSK3β信号通路从而调控p21的出核及泛素化降解;6、通过功能回复实验证实HJURP促进p21泛素化降解的关键E3泛素化连接酶为SKP2。结果:1、在219对肝癌临床标本中,免疫组织化学及实时定量荧光PCR的结果证实HJURP在肿瘤组织中的表达水平显着高于癌旁组织,且74.54%的肿瘤组织中HJURP呈现高表达趋势。同时,western免疫印迹的结果提示,在6种常见的肝癌细胞系中,HJURP的表达也比正常肝细胞系高;2、体外和体内实验表明,HJURP敲低明显降低肝癌细胞的CCK-8吸光度和克隆形成、裸鼠皮下成瘤的能力,且引起肝癌细胞的G1期阻滞。在过表达HJURP后,肝癌细胞的增殖能力明显增强;3、HJURP促进p21蛋白从细胞核穿梭至细胞浆。同时,HJURP抑制p21发生在翻译后水平上。蛋白质免疫共沉淀的结果证实,HJURP促进p21的泛素化降解,主要是被E3泛素化连接酶SKP2降解;4、HJURP敲低之后,p21主要表达在细胞核内,且p-ERK1/2与p-GSK3β的表达增加,p-AKT的表达降低,HJURP过表达之后,p-ERK1/2与p-GSK3β的表达降低。此外,敲低HJURP之后加入ERK1/2通路抑制剂U0126和AKT通路激动剂SC-79后,p-ERK1/2与p-GSK3β的表达得到回复,且肝癌细胞的增殖能力也能够得到一定程度的回复;5、肝癌临床标本中的免疫组织化学的结果表明,HJURP高表达的标本中有69.5%呈现p21低表达,同时HJURP低表达的标本中有66.7%的标本呈现p21高表达;6、通过对临床标本对应的临床病理数据进行分析,结果提示HJURP高表达患者的总体生存率明显低于HJURP低表达者,且HJURP的高表达与肿瘤的大小及肿瘤的AJCC分期有相关性。结论:1、HJURP在肝癌组织中呈明显高表达,且与肝细胞癌的增殖功能及HCC患者的不良预后相关;2、敲低及过表达HJURP可以分别显着降低和增加肝细胞癌的增殖功能,且HJURP促进p21从细胞核穿梭至胞浆,并被SKP2泛素化降解;3、MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信号通路参与HJURP抑制p21表达的生物学过程,是HJURP促进肝细胞癌增殖的潜在分子机制。
霍奇[9]（2017）在《MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究》文中研究表明大量研究结果显示MDIG基因与人类多种恶性肿瘤（如食管癌、胃癌、结肠癌和肺癌等）的发展及预后相关,但是MDIG在肝细胞癌中的功能及调控机制尚不清楚。本研究中,我们发现在肝细胞癌细胞中过表达IKZF1或干扰IKZF1的表达可以影响MDIG的表达水平,MDIG与IKZF1两者之间的m RNA表达水平呈负相关性。染色质免疫沉淀实验（Ch IP）结果显示,IKZF1直接结合MDIG的启动子区域,在转录水平上调控MDIG的表达。体外功能实验结果显示,MDIG促进肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,稳定干扰MDIG表达抑制肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,裸小鼠肝脏原位成瘤实验结果显示MDIG促进肝细胞癌细胞体内成瘤。体外进一步实验显示,MDIG降低肝细胞癌细胞对药物索拉菲尼（sorafenib）的敏感性。MDIG含有组蛋白去甲基化酶,实验结果显示,肝细胞癌细胞中MDIG影响组蛋白3赖氨酸9三甲基化表达水平（H3K9me3）,H3K9me3在表观遗传上调控p21（CIP1/WAF1）的表达,染色质免疫沉淀实验结果显示,H3K9me3直接结合p21（CIP1/WAF1）的转录区而影响其表达水平。本研究通过免疫组织化学染色对155例原发性肝细胞癌患者临床样本分析,发现MDIG在肝细胞癌中表达高于配对的癌旁组织,MDIG表达与病理组织学分级和乙型肝炎病毒感染呈正相关。研究结果提示,MDIG在肝细胞癌中促进肝细胞癌细胞的增殖,有望作为临床治疗肝细胞癌的一个候选分子靶标。
王颖[10]（2016）在《TPD52基因在原发性肝细胞癌中的表达及作用的初步研究》文中研究说明研究背景及目的原发性肝癌是全球实体瘤中第五位发病和第三位死因的癌症,其中大多数属于肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）。我国在2015年开展癌症统计调查结果显示,肝癌死因顺位高居第三位。可见,肝癌已成为威胁人类健康的主要肿瘤之一。目前,HCC的一线治疗方法是肝切除术和局部射频消融,但其治疗效果常常受到各种因素的限制,例如肝功能衰竭、多病灶、病人自身健康状况等。因此,HCC的多种替代疗法也应运而生,包括选择性动脉内的放射治疗（SIRT）和分子靶向治疗（索拉菲尼）等。HCC对传统的化疗和放疗不敏感,因此患者术后也常加以辅助免疫治疗来缩小残余瘤灶。然而,HCC很容易发生复发,尤其是肝内复发,因此患者只有不足30%的长期生存率。HCC的形成和进展是一个复杂的多基因改变的过程,如相关癌基因的过表达和某些抑癌基因的失活等。因此,深入研究与HCC密切相关的基因并阐明其对HCC的作用,有助于我们了解HCC的发生发展机制,也对提高HCC的诊治水平和预后评估具有重要意义。肿瘤蛋白D52（tumor protein D52,TPD52）在20年前被首次发现。人TPD52长度约为180-200个氨基酸残基,包含了许多顺序结构,如Coil-coil序列,PEST基序等。许多研究表明,TPD52参与调解多种细胞功能,如细胞增殖、生存、DNA修复、胞外分泌以及囊泡运输,但其在恶性肿瘤中的作用仍存在争议。TPD52在多种肿瘤中呈现高表达水平,包括乳腺癌、多发性骨髓瘤、伯基特淋巴瘤、黑色素瘤和卵巢癌等;而在一些肿瘤,如乳突状肾细胞瘤、肾透明细胞瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤和肺癌中的表达是下调的,但关于TPD52在HCC中的表达及诊治意义尚缺乏相关的研究报道。本研究欲通过荧光定量rt-pcr、westernblotting和免疫组织化学染色法检测tpd52在hcc中的表达情况,分析其与hcc肿瘤特征及患者临床参数及预后的关系,并进一步探究tpd52在hcc发生发展中的分子机制,从而为将来肝癌疾病的临床诊断及治疗提供新的理论依据。研究方法采用荧光定量rt-pcr、westernblotting和免疫组化方法检测tpd52在肝癌组织和肝癌细胞中的表达情况,探讨tpd52与hcc肿瘤特征及临床指标的关系,并分析其在患者预后中的作用。通过细胞转染方法,构建过表达/沉默tpd52的hepg2和bel7402细胞株,研究tpd52在p21相关通路上的作用情况。统计方法:秩和检验用于比较tpd52在肝癌组织和癌旁组织中的mrna转录水平及蛋白表达水平差异;卡方检验用于分析tpd52表达水平与临床参数或p21表达水平的关系;生存分析用于比较tpd52高表达组和tpd52低表达组之间总生存期和无病进展生存期的差异;单因素和多因素cox回归分析用于探究tpd52表达水平和临床特征对hcc术后生存的影响。结果1、肝癌组织中tpd52的mrna转录水平（p<0.05）和蛋白表达水平（p=0.039）明显低于癌旁组织;同样地,与正常肝细胞lo2相比,tpd52在肝癌细胞株中mrna转录水平和蛋白表达水平亦明显下调。2、tpd52阳性染色主要位于细胞胞浆和细胞膜中,其在癌旁组织中的表达水平明显比在癌组织中的表达高;相关分析表明tpd52表达水平与tnm分期显着相关（p=0.011）,高表达tpd52的患者总生存期（p=0.007）和无病进展生存期（p=0.019）明显长于低表达者;多因素分析表明tpd52表达水平是患者总生存（p=0.019）和无病进展生存（p=0.019）的独立预测因素。3、肝癌中tpd52和p21的表达呈现正相关关系（r=0.176,p=0.026）,且同时高表达水平的tpd52和p21能明显提高患者总生存期（p=0.012）和无病进展生存期（p=0.013）。4、体外实验证实,过表达tpd52可上调p53、p21和下调mdm2、bcl2及p-gsk-3β的水平;沉默tpd52则可下调p53、p21和上调mdm2、bcl2及P-GSK-3β的水平。由此表明,TPD52可能直接或间接地通过MDM2-p53-p21途径来影响HCC的发生发展。结论TPD52在HCC形成与发展过程中起抑制作用,有可能作为HCC诊治和患者预后评估的标志,也可成为HCC分子靶向治疗的一个新潜在靶点。
二、P21/WAF1蛋白在肝细胞癌中的表达及DNA含量分析的意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、P21/WAF1蛋白在肝细胞癌中的表达及DNA含量分析的意义（论文提纲范文）
（1）p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 胶质瘤的研究进展 |
| 1.1.1 胶质瘤的发生发展 |
| 1.1.2 胶质瘤的治疗现状 |
| 1.2 肿瘤乏氧微环境的研究现状 |
| 1.2.1 肿瘤乏氧微环境 |
| 1.2.2 乏氧肿瘤的代谢重编程 |
| 1.2.3 乏氧肿瘤的辐射抗性 |
| 1.3 p21在肿瘤放疗中的功能多样性 |
| 1.3.1 p21参与电离辐射应答 |
| 1.3.2 p21与细胞周期 |
| 1.3.3 p21与DNA损伤修复 |
| 1.3.4 p21与细胞凋亡 |
| 1.3.5 p21与其他细胞进程 |
| 1.4 研究目的及章节安排 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验设备及仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞培养主要试剂及耗材 |
| 2.2.2 细胞转染主要试剂及耗材 |
| 2.2.3 CCK-8 检测细胞增殖主要试剂及耗材 |
| 2.2.4 免疫印迹杂交主要试剂及耗材 |
| 2.2.5 RNA提取、反转录以及Real-time PCR主要试剂及耗材 |
| 2.2.6 EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.7 胞内葡萄糖摄入量的检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.8 培养基中乳酸产量的检测主要试剂及耗材 |
| 2.2.9 双荧光素酶报告基因实验主要试剂及耗材 |
| 2.2.10 构建稳定过表达p21的U87细胞株主要试剂及耗材 |
| 2.2.11 异种移植小鼠模型的构建及相关动物实验主要试剂及耗材 |
| 2.2.12 本研究所用到的小分子抑制剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 细胞乏氧处理 |
| 2.3.3 细胞辐照 |
| 2.3.4 细胞转染 |
| 2.3.5 克隆存活 |
| 2.3.6 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 2.3.7 免疫印迹杂交 |
| 2.3.8 RNA提取及浓度测定 |
| 2.3.9 RNA反转录和Real-time PCR |
| 2.3.10 EdU(5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)细胞增殖检测 |
| 2.3.11 胞内葡萄糖摄入量的检测 |
| 2.3.12 培养基中乳酸含量的测定 |
| 2.3.13 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.3.14 构建稳定过表达p21的U87细胞株 |
| 2.3.15 异种移植小鼠模型的构建及相关动物实验 |
| 2.3.16 统计学方法 |
| 第3章 胶质瘤乏氧及辐射抗性相关生物标志物的筛选 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 乏氧处理增加胶质瘤细胞的辐射抗性 |
| 3.2.2 对待选生物标志进行生物信息学分析 |
| 3.2.3 检测待选生物标志在乏氧条件下的表达情况 |
| 3.2.4 p21对胶质瘤增殖及辐射敏感性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 乏氧条件下p21通过增强糖酵解途径提高胶质瘤细胞的辐射抗性 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 乏氧条件下p21对糖酵解途径的影响 |
| 4.2.2 p21通过调控Glut1和LDHA影响糖酵解途径 |
| 4.2.3 乏氧条件下Glut1和LDHA对胶质瘤增殖的影响 |
| 4.2.4 乏氧条件下Glut1和LDHA对胶质瘤辐射敏感性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 p21与HIF-1α间的相互正反馈调节回路 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.2.1 HIF-1α与p21的表达成正相关 |
| 5.2.2 乏氧条件下HIF-1α直接转录激活p21 |
| 5.2.3 乏氧条件下HIF-1α通过p21上调Glut1和LDHA |
| 5.2.4 乏氧诱导的p21促进HIF-1α的转录 |
| 5.2.5 HIF-1α能够调控Glut1和LDHA的表达 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 体内实验验证HIF-1α/p21信号轴增强胶质瘤辐射抗性 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验结果 |
| 6.2.1 稳定过表达p21的U87细胞株的构建 |
| 6.2.2 p21过表达增强胶质瘤的辐射抗性 |
| 6.2.3 过表达p21增强胶质瘤内的糖酵解途径 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（2）FOXG1在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖迁移的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 1 肺癌概述 |
| 1.1 非小细胞肺癌 |
| 1.2 小细胞肺癌 |
| 2 FOXG1与肿瘤 |
| 2.1 FOXG1与神经胶质瘤 |
| 2.2 FOXG1与其他肿瘤 |
| 3 数据库的介绍 |
| 4 立项依据 |
| 实验材料 |
| 1 菌株、质粒、细胞株 |
| 1.1 实验菌株和质粒 |
| 1.2 实验细胞 |
| 2 主要实验仪器 |
| 3 主要实验试剂 |
| 4 其它一次性材料 |
| 5 主要试剂的配制 |
| 实验方法 |
| 1 TCGA数据库表达数据下载 |
| 1.1 从TCGA数据库提取数据 |
| 1.2 TCGA临床数据下载 |
| 1.3 数据预处理 |
| 2 从Oncomine数据库提取数据 |
| 3 免疫组织化学染色 |
| 4 细胞培养 |
| 5 质粒制备 |
| 5.1 重组质粒转化 |
| 5.2 质粒的少量制备 |
| 5.3 质粒的大量制备 |
| 5.4 质粒纯化 |
| 5.5 菌株保存 |
| 6 慢病毒侵染建立稳定细胞株 |
| 6.1 慢病毒包装 |
| 6.2 慢病毒侵染细胞 |
| 6.3 嘌呤霉素筛选建立稳定细胞株 |
| 7 DAPI染核 |
| 8 细胞计数 |
| 9 Real-time PCR |
| 9.1 mRNA的提取 |
| 9.2 mRNA的纯度验证及测定 |
| 9.3 逆转录 |
| 9.4 Real-time PCR检测样本中FOXG1的表达量 |
| 10 蛋白质免疫印迹 |
| 10.1 细胞总蛋白的提取 |
| 10.2 BCA法测蛋白浓度 |
| 10.3 蛋白变性 |
| 10.4 Western blot检测FOXG1蛋白表达 |
| 11 CCK8方法检测细胞的增殖 |
| 12 流式细胞术 |
| 12.1 流式细胞数检测细胞凋亡 |
| 12.2 PI单染发流式细胞术检测细胞周期 |
| 12.3 流式细胞仪操作 |
| 13 细胞迁移实验 |
| 13.1 Transwell |
| 13.2 伤口愈合实验 |
| 14 统计学分析 |
| 实验结果 |
| 1 FOXG1在肺癌中表达增高 |
| 1.1 TCGA数据库中显示FOXG1在肺腺癌和肺鳞癌中高表达 |
| 1.2 Oncomine数据库显示FOXG1在SCLC中高表达 |
| 1.3 免疫组织化学染色结果显示FOXG1在SCLC中高表达 |
| 2 FOXG1在不同肺癌细胞中均有表达 |
| 3 过表达FOXG1 A549细胞系的建立和检测 |
| 4 过表达FOXG1促进A549细胞的增殖 |
| 5 过表达FOXG1能够促进A549细胞的周期进程 |
| 6 过表达FOXG1能够抑制A549细胞的凋亡 |
| 7 过表达FOXG1对A549细胞迁移能力的影响 |
| 讨论 |
| 1 FOXG1在肺癌中的高表达 |
| 2 FOXG1对肺癌细胞A549细胞周期的影响 |
| 3 FOXG1对肺癌细胞A549细胞凋亡的影响 |
| 4 FOXG1对肺癌细胞A549细胞迁移能力的影响 |
| 5 FOXG1对肺癌细胞A549细胞迁移能力的影响 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 转录因子FOXG1与肿瘤的相关性研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（3）miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、miR-195-5p在上皮性卵巢癌组织、细胞系中的表达 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 1.1.3 主要仪器设备 |
| 1.1.4 常用实验试剂的配制 |
| 1.1.5 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 miR-195-5p在卵巢癌组织中表达下调 |
| 1.2.2 miR-195-5p在卵巢癌细胞、正常卵巢细胞中的表达情况 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、miR-195-5p对卵巢癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要仪器设备 |
| 2.1.4 常用实验试剂的配制 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 体外细胞学验证miR-195-5p对卵巢癌细胞增殖及迁移能力的影响 |
| 2.2.2 体内动物学实验验证miR-195-5p对卵巢癌增殖的影响 |
| 2.2.3 miR-195-5p对卵巢癌细胞周期的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、miR-195-5p与 CDCA4 作用关系研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 研究物品 |
| 3.1.3 研究方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 CDCA4是miR-195-5p下游调控靶基因 |
| 3.2.2 miR-195-5p通过对CDCA4 的调节作用来抑制卵巢癌细胞的增殖能力 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 四、miR-195-5p、CDCA4 与卵巢癌临床病理特征、预后的关系 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 研究对象 |
| 4.1.2 临床资料 |
| 4.1.3 随访 |
| 4.1.4 研究物品 |
| 4.1.5 研究方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 miR-195-5p、CDCA4 在上皮性卵巢癌组织中的表达与卵巢癌患者临床病理因素的关系 |
| 4.2.2 miR-195-5p、CDCA4 表达水平与上皮性卵巢癌患者预后的关系 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 细胞周期调控与上皮性卵巢癌 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）SOCS1通过P21-CyclinD1/CDK4调控细胞周期抑制肝细胞癌进展的机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 SOCS1作为肝细胞癌辅助诊断生物标志物的研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SOCS1 在肝细胞癌组织和正常肝脏组织中的m RNA表达数据采集 |
| 3.2 SOCS1 在我院肝细胞癌患者肝组织中的m RNA表达水平检测 |
| 3.3 SOCS1在肝细胞癌患者肝脏组织中的蛋白表达水平检测 |
| 3.4 SOCS1 在肝癌细胞系中的m RNA表达水平检测 |
| 3.5 SOCS1在肝癌细胞系中的甲基化程度 |
| 3.6 肝细胞癌组织中SOCS1表达水平与患者临床病理特征和长期生存的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 第二部分 SOCS1调控细胞周期信号通路对肝癌细胞增殖的影响和机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 SOCS1在特定肝癌细胞系中的外源性过表达 |
| 3.2 SOCS1在体外实验中抑制肝癌细胞增殖能力并在体内抑制成瘤能力 |
| 3.3 SOCS1 通过泛素化P21 影响Cyclin D1/CDK4 复合体从而抑制肝癌细胞增殖 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 参考文献 |
| 综述 SOCS蛋白家族在癌症信号通路中的机制和临床应用前景 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（5）HPV E6/E7通过IFI16/p53通路调控宫颈上皮细胞生物学功能的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号及英文说明 |
| 前言 |
| 第一部分: IFI16在宫颈癌组织中的表达水平及意义 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分: HPV18 E6E7通过下调IFI16的表达影响人宫颈上皮H8细胞生物学功能 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分: IFI16参与调控H8细胞内p53的表达 |
| 研究背景 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 全文总结 |
| 研究的创新性和不足 |
| 综述 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
（6）HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HDACs在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平明显升高 |
| 2.2 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达水平与肝细胞癌患者临床病理特征的相关性 |
| 2.3 HDAC1、HDAC2、HDAC4蛋白在肝细胞癌组织中表达差异与肝细胞癌患者术后长期生存的相关性 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585抗肝癌的作用机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 HDAC1、HDAC2、HDAC4在肝癌细胞系和正常永生化肝细胞(QSG-7701)中的表达水平分析 |
| 2.2 JNJ-26481585能够抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.3 JNJ-26481585能够抑制肝癌细HDAC1、HDAC2、HDAC4的表达 |
| 2.4 JNJ-26481585能够阻滞肝细胞癌细胞周期进程 |
| 2.5 JNJ-26481585能够促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.6 JNJ-26481585通过调控PI3K/AKT和JNK/c-jun通路来影响细胞周期和凋亡 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HDAC抑制剂JNJ-26481585协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 1 实验材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 JNJ-26481585与Sorafenib联用能够协同抑制肝癌细胞增殖 |
| 2.2 JNJ-26481585与Sorafenib联用通过调控JNK促进肝癌细胞凋亡 |
| 2.3 JNJ-26481585与Sorafenib联用对裸鼠成瘤能力的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（7）miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床意义及分子功能机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 第一节 miR-423-5p在肝细胞癌中的临床价值及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节 miR-423-5p靶基因筛选及TGFBR3表达在肝癌中的临床价值及功能研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三节 miR-423-5p在肝癌进展中分子作用机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第一章 全章结论 |
| 第一章 文献综述 MicroRNA-423在人类癌症中的调节机制和功能作用 |
| 第二章 HNRNPA1在HBV阳性肝细胞癌中的临床价值及分子机制研究 |
| 前言 |
| 实验材料及方法 |
| 第一节 HNRNPA1在HVB阳性肝癌肝切除患者中的预后价值研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二节HNRNPA1在HBV阳性肝细胞癌中的初步分子机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二章 全章结论 |
| 第二章 文献综述 HNRNPA1蛋白在消化系统肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（8）HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的分子机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 HJURP在肝癌细胞和组织中的表达水平及其临床病理意义 |
| 前言 |
| 1 HJURP在临床标本和细胞系中的表达情况及与患者临床病理特征和预后的相关性 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 数据分析统计 |
| 1.4 实验结果 |
| 2 讨论 |
| 3 结论 |
| 第二部分 HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的作用及其分子机制研究 |
| 前言 |
| 1 通过体内和体外实验验证HJURP促进肝癌的增殖 |
| 1.1 验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 统计分析 |
| 1.4 实验结果 |
| 2 HJURP通过抑制p21的表达促进肝癌的增殖 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 3 HJURP通过E3泛素化连接酶SKP2促进p21的泛素化降解 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 4 HJURP通过MAPK/ERK1/2和AKT/GSK3β信号通路促进p21出核 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（9）MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 IKZF1 在肝细胞癌中转录调控MDIG的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 MDIG基因在肝细胞癌中的功能 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 MDIG在肝细胞癌中表观遗传调控p21(CIP1/WAF1)的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MDIG在肝细胞癌中差异表达及其临床意义 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（10）TPD52基因在原发性肝细胞癌中的表达及作用的初步研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 序言 |
| 1.1 原发性肝癌流行病学与病因学 |
| 1.2 肿瘤蛋白D52家族 |
| 1.3 p21基因 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 肝癌标本的收集 |
| 2.1.2 主要实验用品与仪器设备 |
| 2.1.3 主要的缓冲溶液、培养基等配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实时荧光定量RT-PCR |
| 2.2.2 免疫印迹法 |
| 2.2.3 免疫组织化学染色法 |
| 2.2.4 细胞瞬时转染 |
| 2.2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 TPD52在肝癌组织和肝癌细胞中的转录和表达情况 |
| 3.1.1 TPD52 mRNA在肝癌组织和肝癌细胞中的转录水平 |
| 3.1.2 TPD52蛋白在肝癌组织和肝癌细胞中的表达水平 |
| 3.1.3 TPD52表达与肝癌患者临床恶性特征的关系 |
| 3.1.4 TPD52表达、各临床病理特征与肝癌患者生存预后的关系 |
| 3.2 TPD52与p21通路的关系 |
| 3.2.1 TPD52与p21的关系 |
| 3.2.2 TPD52与相关通路蛋白的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 附录 |
| 致谢 |
四、P21/WAF1蛋白在肝细胞癌中的表达及DNA含量分析的意义（论文参考文献）
- [1]p21增强乏氧条件下胶质瘤辐射抗性的机制研究[D]. 匡彦蓓. 中国科学院大学(中国科学院近代物理研究所), 2021(01)
- [2]FOXG1在肺癌中的表达及其对肺癌细胞增殖迁移的作用研究[D]. 陈艳. 大理大学, 2021(09)
- [3]miR-195-5p在卵巢癌中的作用与机制研究[D]. 刘翔宇. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]SOCS1通过P21-CyclinD1/CDK4调控细胞周期抑制肝细胞癌进展的机制研究[D]. 丁俊. 浙江大学, 2020(01)
- [5]HPV E6/E7通过IFI16/p53通路调控宫颈上皮细胞生物学功能的机制研究[D]. 李璐. 山东大学, 2019(03)
- [6]HDAC抑制剂JNJ-26481585单药和协同索拉非尼抗肝癌的作用及机制研究[D]. 何彬. 浙江大学, 2019(03)
- [7]miR-423-5p、HNRNPA1在肝细胞癌中的临床意义及分子机制研究[D]. 柯瑞盛. 福建医科大学, 2019(07)
- [8]HJURP抑制p21表达促进肝细胞癌增殖的分子机制研究[D]. 陈天驰. 浙江大学, 2019(03)
- [9]MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究[D]. 霍奇. 上海交通大学, 2017(05)
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