一、硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达（论文文献综述）
井金苗[1]（2021）在《家蝇硫氧还蛋白2单克隆抗体的制备及抗氧化研究》文中进行了进一步梳理家蝇（Musca domestica）为双翅目蝇科蝇属昆虫,繁殖和扩散能力强,是人类所知全球分布最广的昆虫之一,其强大的环境适应能力和抗逆防御系统得到了越来越多研究者的关注。氧化还原系统在生物体抵抗病原或外界环境胁迫过程中,通过调控氧化还原平衡来介导信号传导和抗菌免疫反应。硫氧还蛋白（thioredoxin,Trx）被认为是机体重要的抗氧化组成之一,其抗氧化角色在哺乳动物中有较多研究,但昆虫Trx的抗氧化机制研究较少。本实验对家蝇的一种线粒体特异表达的Trx2（MdTrx2）基因进行了研究,重点关注在重金属等氧化应激诱导物胁迫下MdTrx2对机体和线粒体的保护功能,主要研究结果如下:1.根据转录组信息,克隆获得MdTrx2基因c DNA序列720 bp,包含一个423 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码一条140个氨基酸残基组成的蛋白序列,MdTrx2蛋白含有Trx结构域以及典型的2个半胱氨酸构成的氧化还原活性位点“C-X-X-C”,与人Trx2蛋白具有43.08%序列相似性。在家蝇基因组中共搜索到13个Trx基因,其中MdTrx2的编码蛋白被预测定位于线粒体上。2.利用原核表达系统对家蝇MdTrx2进行了重组表达,体外实验显示纯化的rMdTrx2对胰岛素的二硫键具有还原活性。与空载转化菌株相比,rMdTrx2的重组菌株表现出显着升高的吩嗪硫酸甲酯（Phenazine methosulfate,PMS）耐受能力,证实MdTrx2参与细胞的抗氧化过程。同时利用等温滴定量热法（ITC）测定了rMdTrx2与重金属(Cd2+和Cu2+)结合反应的热力学和动力学参数,结果显示rMdTrx2具有结合重金属Cd2+和Cu2+的能力,结果说明MdTrx2可能在抗重金属胁迫中发挥重要功能。3.利用单克隆抗体技术制备MdTrx2的单克隆抗体,筛选纯化得到4株优良抗体。使用制备的单克隆抗体,通过Western Blot检测了MdTrx2在家蝇不同发育阶段和不同组织中蛋白表达情况,结果表明MdTrx2在家蝇的卵和蛹中没有表达,在羽化后第5天的成蝇表达量最高,表达水平具有明显的发育相关性;MdTrx2在幼虫和成蝇不同组织中均有表达,在家蝇幼虫的肠道和脂肪体,成蝇的马氏管和神经组织中表达量较高。4.通过荧光定量PCR从mRNA水平检测了家蝇MdTrx2在盐酸阿霉素（doxorubicin,DOX）、CdCl2和CuCl2暴露后的表达变化,结果显示MdTrx2在DOX、CdCl2和CuCl2处理后均有显着升高,表明这些条件刺激对MdTrx2基因的转录表达具有促进作用。5.为了进一步分析MdTrx2在抗重金属胁迫过程中的作用机制,通过dsRNA显微注射法成功敲低MdTrx2在家蝇幼虫体内的表达。此时再用重金属Cd2+处理幼虫,与对照组相比,MdTrx2干扰组的存活能力显着降低,同时线粒体复合物I和II的活性也明显受到抑制,推测MdTrx2在维持线粒体氧化还原平衡过程中起到重要作用,在重金属等胁迫条件下,MdTrx2功能缺失会增加氧化应激水平,进而造成线粒体功能损伤,造成复合物I和II的活性降低。总之,该论文证实家蝇MdTrx2在维持线粒体功能稳定性方面发挥重要作用,参与宿主的抗重金属胁迫过程,维持机体氧化还原平衡。
陈芸[2]（2021）在《弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究》文中认为刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生的顶复门原虫,可感染几乎所有温血动物的有核细胞,严重危害人和其他动物的健康。当受到弓形虫感染时,宿主启动天然免疫并激活免疫细胞产生大量活性氧（ROS）,通过诱导氧化应激发挥抗弓形虫作用。弓形虫的抗氧化系统在抵御宿主氧化应激过程中发挥重要作用。但目前对抗氧化系统的研究仍不全面,对抵抗活性氧应激反应中起作用的关键基因仍然知之甚少。本试验利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术筛选并鉴定与抗氧化相关的新基因,并初步探索新基因的生物学功能,为进一步研究弓形虫抵抗氧化应激的作用机制提供依据。为确定H2O2对细胞及弓形虫的最佳作用浓度及时间,本研究用含不同浓度H2O2（100、200、300、400、500、600、800μM）的完全培养基培养Vero细胞,利用CCK-8测定H2O2对Vero细胞的毒性,并通过DCFH-DA荧光探针测定安全浓度下Vero细胞内的活性氧水平,确定了H2O2对Vero细胞的最佳作用浓度为200μM。以RH株,ROP5基因缺失株及TR基因缺失株为试验虫株,评估H2O2对弓形虫活力的影响,以确定H2O2对弓形虫的最佳孵育时间,结果显示30 min为H2O2最佳作用时间。在培养基中添加H2O2,评估H2O2对细胞内弓形虫增殖能力的影响,结果表明200μM H2O2可显着抑制细胞内TR-KO株的增殖。因此以200μM H2O2孵育弓形虫30 min,并在培养基中添加H2O2作为筛选抗氧化相关基因的条件。利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术筛选并鉴定抗氧化基因。本研究通过共转染p Cas9-CAT和p Cas9-decoy至弓形虫RH株体内,成功构建持续表达Cas9的RH/Cas9虫株。将sg RNA质粒文库电转至RH/Cas9虫株,经息疟定筛选后,获得弓形虫基因缺失株库;按照上述筛选条件,利用200μM H2O2筛选与抗氧化功能相关的基因。分析sg RNA的富集与丢失情况,选择5个编码假定蛋白（HPs）的基因进行验证。以RH/Cas9虫株为亲本虫株,构建了5个未知基因的基因缺失株（HPs-KO）,验证其对H2O2的敏感性,并测定各虫株的抗氧化能力、入侵及增殖能力,对小鼠的毒力。结果表明,HPs的缺失均不同程度地增加弓形虫对H2O2的敏感性,且与其他缺失株相比,HP1-KO对H2O2最敏感。各缺失株的抗氧化能力、入侵及增殖能力、对小鼠的毒力均降低于RH株。为进一步研究HP1的功能,构建了HP1的原核表达质粒p ET-32a-HP1,并制备多克隆抗体。利用间接免疫荧光对HP1进行定位分析,并利用鼠多抗体进行Co-IP和质谱分析。以RH株构建HP1基因缺失株（HP1-KO）,并构建HP1互补株（HP1-CO）,利用RNA-seq技术分析HP1缺失对虫体内相关基因表达量的影响。结果表明,HP1定位于弓形虫细胞膜上;质谱结果发现与HP1相关的蛋白主要参与核糖体及多种代谢途径,如糖酵解/糖异生、磷酸戊糖途径、谷胱甘肽代谢等。RNA-seq测序结果表明,与RH株相比,HP1缺失株中有710基因差异表达,其中上调的基因有48个,下调的基因有662个,且差异基因主要富集于细胞过程、代谢过程、催化活性和结合,KEGG分析发现,差异基因主要参与Jak-STAT信号通路、磷脂酰肌醇信号系统、细胞衰老、脂肪酸生物合成等。由上述结果表明HP1主要影响弓形虫的代谢过程,与CAT分解H2O2的能力不同。因此,在HP1-KO株基础上,构建HP1与CAT的双基因缺失株（HP1/CAT-KO）,测定HP1/CAT-KO对H2O2的敏感性,分析其在小鼠体内的增殖情况及对小鼠的毒力。结果表明HP1/CAT-KO对H2O2的敏感性显着高于单缺失株,在小鼠体内的增殖速度显着低于RH株和单缺失株,延长感染小鼠的存活时间。最后,本研究还对CRISPR/Cas9全基因组筛选中发现的AKHP基因进行初步功能研究。生物信息学分析发现AKHP具有典型的2-Cys-Prx的结构域;经定位分析发现该蛋白定位于弓形虫胞质中;利用CRISPR/Cas9基因敲除技术构建了AKHP基因缺失株（AKHP-KO）及互补株（AKHP-CO）,测定不同的虫株的入侵及增殖能力,对H2O2敏感性、抗氧化能力,并通过荧光定量PCR测定AKHP-KO中其他抗氧化基因的m RNA表达情况。结果表明,AKHP-KO的增殖能力显着降低,对H2O2的敏感性显着增加,抗氧化能力降低;与RH株相比,AKHP基因缺失株中Prx2的表达量显着升高。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9全基因组筛选技术成功筛选并鉴定5个未知的抗氧化基因和一个具有典型2-Cys-Prx结构域的AKHP基因,并对两个基因进行初步功能研究,为进一步研究弓形虫抵抗氧化应激的作用机制提供依据
郭亲梦[3]（2021）在《富含二硫键的多肽制备》文中指出富含二硫键的多肽种类众多,具有各种各样的生物学功能,是大自然中的一个资源宝库。与线性多肽相比,二硫键多肽特异性强,稳定性好,具有开发成药物的良好潜力,正确的二硫键配对是其发挥正常生物学功能的前提。尽管采用基因工程方法成功表达了部分含多对二硫键的芋螺毒素、蝎毒素和蜘蛛毒素,但这些富含二硫键多肽毒素的表达和纯化仍较困难。在确定表达与纯化体系时,要求尽可能考虑到所表达多肽的特性、表达情况、实验支出、表达时长、安全性以及所表达的多肽毒素对表达体系本身的影响。由于多肽毒素分子量很小,并富含二硫键,采用非融合的形式表达有时相当困难,一般情况下采用融合表达的形式,既便于表达多肽的检测和纯化,也有利于增强其可溶性和稳定性。结合多肽毒素的性质,在融合Trx、MBP和His等标签的同时,也建议融合分子伴侣,如小分子泛素样修饰蛋白（sumo）不仅能提高多肽的表达量和可溶性,还具有促进多肽正确折叠和抗蛋白酶水解的功能。随着分子生物学技术的不断发展和多肽毒素自身的深入研究,预计新的适合多肽毒素表达与纯化体系会不断出现,多肽毒素基因表达与纯化的发展在多肽毒素结构和功能研究方面发挥作用也越来越大。本文主要在大肠杆菌pET32a/pETDuet两种表达载体中进行了四种含有三对二硫键的芋螺毒素CnⅢC、GⅢB、KⅢA、PⅢA的表达研究。根据基因序列设计引物,使用双酶切的方法将芋螺毒素GⅢB、PⅢA构建到pET32a表达载体中,芋螺毒素CnⅢC、KⅢA构建到pETDuet-1表达载体中。再通过RF-cloning技术将芋螺毒素PⅢA构建到pETDuet-sumo表达载体。将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中,加入IPTG进行诱导表达,四种芋螺毒素均以上清的形式获得了高效表达。对于GⅢB、PⅢA两个小肽,经两次镍柱纯化、酶切去标签,超滤管纯化得到了纯净的目的多肽。对于CnIIIC、KIIIA两个小肽,先镍柱纯化、酶切后经MBP柱纯化,最后经凝胶色谱柱Superdex 75纯化得到了纯净的目的多肽。经质谱鉴定纯化后的多肽分子量与理论分子量一致,电生理实验表明其具有一定的活性。综上所述,我们成功在大肠杆菌中得到了富含三对二硫键且具有活性的四种芋螺毒素CnⅢC、GⅢB、KⅢA、PⅢA,这不仅给其他富含二硫键的多肽制备提供了参考价值,同时也为外源表达系统大规模生产高活性、低成本、安全性高的重组芋螺毒素奠定了基础。富含二硫键多肽大肠杆菌表达体系的成功建立,将大大加快富含二硫键多肽的基础与应用研究。
王曼琦[4]（2021）在《番茄SlPrx应答低氮胁迫的机理分析》文中认为氮（N）是限制植物生长的主要元素之一,氮肥料被广泛用于提高作物产量。减少高氮投入,提高植物的氮肥利用率（NUE）对农业可持续发展至关重要。过氧还蛋白（Peroxiredoxin,Prx）是一类重要的抗氧化酶,具有保护细胞免受过氧化的生理功能,在消除代谢过程中产生的过氧化物方面起着重要作用,是抵御体内过量活性氧（ROS）的第一道防线。本论文主要对番茄过氧还蛋白基因（SlPrx）参与一氧化氮（NO）缓解低氮胁迫的机理及其功能进行研究,取得结果如下:1.研究了外源施加SNP（NO供体）对低氮处理下番茄幼苗的氮代谢系统和SlPrx表达的影响。与对照相比,低氮处理三周后,番茄幼苗植株矮小、根系不发达、生物量下降。0.25 m M低氮胁迫下,番茄根系的ROS和NO含量均显着上升,硝酸盐含量、叶绿素含量、硝酸还原酶（NR）、亚硝酸还原酶（Ni R）和谷氨酰胺合成酶（GS）的酶活性显着下降。与低氮胁迫相比,外源施加100μM SNP,番茄的ROS和NO含量下降,硝酸盐含量,叶绿素含量,NR和GS的酶活性显着上调。与对照相比,低氮胁迫下的番茄SlNRT2.4、SlNR、SlNi R和SlGS2表达量下降。外源施加SNP后,与低氮胁迫相比,SlPrx、SlGrx的表达量显着增加。低氮胁迫后,番茄中S-亚硝基化蛋白增加,S-亚硝基化的SlPrx的蛋白表达量也增加,施加SNP后,S-亚硝基化的SlPrx蛋白表达量进一步增加。以上结果说明低氮胁迫下番茄SlPrx蛋白可能通过发生S-亚硝基化来参与NO缓解低氮胁迫的过程。2.通过原核表达并纯化获得番茄SlPrx蛋白,分析重组蛋白SlPrx在体外清除H2O2以及抗氧化的功能。pET-28a-SlPrx蛋白大小约为29 k D,28℃,0.5 m M IPTG诱导表达8 h为蛋白诱导最佳条件。通过H2O2清除法发现SlPrx重组蛋白具有H2O2清除能力以及过氧还蛋白活性;SlPrx蛋白以剂量依赖性的方式抑制DNA损伤;琼脂扩散法验证了重组SlPrx蛋白在重金属和H2O2胁迫下的抗氧化功能。通过GPS-SNO 1.0预测番茄Prx序列中位于3位和120位的Cystein（Cys）是可能的S-亚硝基化的关键位点,将这两个Cys位点突变为Ser,并进一步获得SlPrx C3S和SlPrx C120S突变体蛋白,发现SlPrx C3S蛋白S-亚硝基化活性降低,表明第3位Cys可能是SlPrx关键的Cys位点。3.通过酵母双杂交（Y2H）、Pull-down实验表明,SlPrx与SlGrx蛋白存在互作。此外,Y2H、Pull-down和免疫共沉淀实验证明SlPrx与硫氧还蛋白（Trxh）存在相互作用。4.构建了植物过表达载体pCAMBIA1301-SlPrx,pCAMBIA1301-SlGrx和基因编辑载体CRISPR-Cas9-p HEE401E-SlPrx、CRISPR-Cas9-p HEE401E-SlGrx,通过农杆菌介导的叶盘法转化番茄,对转基因番茄进行基因组PCR、q RT-PCR、western blot分析,获得了番茄SlPrx的基因编辑番茄植株2棵。SlGrx过表达植株2棵,基因编辑植株2棵。本研究从生理生化和分子水平上,揭示了SlPrx参与番茄应答低氮胁迫的作用机制,有助于丰富我们对蔬菜应答低氮胁迫的机制的认识。
王大为[5]（2020）在《弓形虫硫氧还蛋白的生物学特性及功能研究》文中认为弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种食源性的细胞内寄生的顶复门原虫,宿主类型众多,可以感染包括人在内的接近300种生物,引起严重的人兽共患寄生虫病,呈世界性流行。弓形虫感染对人类健康、畜牧业发展及食品安全方面均带来了巨大的威胁,这就有待于不断寻找有效的疫苗或治疗方法来控制弓形虫感染。顶复门原虫入侵宿主是一个快速而连续的过程,入侵的首要条件是虫体自身的配体能与宿主的相关受体互相结合。实验室前期研究发现肝素类糖胺聚糖分子是疟原虫入侵宿主红细胞的主要受体之一,但其作用机制尚不明确;而作为胞内寄生的弓形虫其相关分子机制也有待研究,且鲜有关于弓形虫肝素结合蛋白质的相关报道。因此本研究将对一种弓形虫肝素结合蛋白质,即弓形虫硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）的生物学特性和功能进行系统性研究。本研究首先对弓形虫Trx的基本生物学信息、结构域等进行分析预测,结果显示弓形虫Trx具有一段信号肽序列,无跨膜区,推测为一种分泌型蛋白质;同时该蛋白质还含有典型的氧化还原基序“-CXXC-”,推测该蛋白质可能在弓形虫体内氧化还原相关过程发挥作用。为了对弓形虫Trx功能进行深入分析,本研究将该蛋白质分别分段构建不同的原核表达载体并进行了融合His标签和GST标签重组蛋白质的表达纯化,同时免疫实验动物获得了特异性多克隆抗体。利用间接免疫荧光实验对其亚细胞定位进行分析,结果显示弓形虫Trx在虫体胞质内广泛分布,而在纳虫空泡内虫体整体荧光强度要高于游离虫体,推测该蛋白质可能参与了虫体自身增殖及与宿主的相互作用等过程;通过荧光定量PCR和Western blot实验对弓形虫Trx的转录水平及表达水平进行分析,结果显示该蛋白在ME49虫株内的转录及表达水平显着高于其在RH株内（P≤0.01）;体外肝素结合实验和细胞黏附实验显示弓形虫Trx可以和肝素分子产生特异性结合,且可以和多种细胞产生明显的黏附作用;体外抗氧化实验结果显示弓形虫Trx对体外氧化损伤的质粒具有显着的保护能力,且对特异性氨基酸位点突变后该蛋白质的抗氧化能力消失,同时虫体还可以在一定程度上抵抗H2O2的氧化作用（P≤0.01）。为了进一步对弓形虫Trx的功能进行研究,研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了弓形虫Trx过表达虫株,通过对比其与野生株的入侵速率、增殖速率、转录和表达水平及氧化还原指标等,结果显示过表达虫株其入侵及增殖速率都显着高于野生株,且其转录及表达水平均显着高于野生株（P≤0.01）;T-AOC含量显着上升（P≤0.01）,ROS和MDA水平显着下降（P≤0.01）。综上所述,本研究发现弓形虫肝素结合蛋白质—弓形虫Trx具有肝素结合能力和细胞黏附能力,同时具有一定的抵抗氧化损伤的能力;过表达虫株其入侵速率及增殖速率都显着提升,且氧化还原指标产生显着的变化。研究结果为揭示弓形虫与宿主细胞的相互作用机制奠定基础,同时也为新型弓形虫疫苗研制及药物靶标的筛选提供一定的参考价值和理论依据。
彭政[6]（2020）在《芽孢杆菌降解羽毛角蛋白关键步骤解析及角蛋白酶的高效表达》文中研究表明角蛋白酶是一种特异性水解角蛋白的蛋白酶,在角蛋白废弃物生物回收中有着重要的应用前景。但目前面临着催化自然角蛋白底物效率较低的困境。本论文主要围绕芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的关键步骤以及角蛋白酶高效表达两方面展开研究,以解决基于角蛋白酶生物转化羽毛角蛋白废物效率低下的问题。主要研究结果如下:（1）利用共培养模式构建人工菌群用于羽毛角蛋白高效降解微生物菌群可以通过菌种之间的分工来分配代谢负担和发挥协同作用,具有有效转化复杂底物的能力和可模块化性。在本研究中,通过分析两株菌降解羽毛角蛋白的体系特征,发现B.licheniformis BBE11-1分泌的角蛋白酶活性低于S.maltophilia BBE11-1,但是细胞外酶系更丰富。基于微生物降解角蛋白的过程是以角蛋白酶为主多因素协同作用的理论基础,开发并优化共培养体系用于羽毛角蛋白降解。结合温度转换策略,在3-L发酵罐中仅48 h后50 g×L-1羽毛的降解率便达到了81.8%,显着地提升了角蛋白酶分泌菌株降解羽毛的效率。（2）解析了半胱氨酸循环代谢过程是芽孢杆菌降解角蛋白的关键步骤半胱氨酸是角蛋白降解的特征产物。在本研究中,通过分析发现半胱氨酸在芽孢杆菌细胞内可通过两步代谢反应产生亚硫酸盐,并且在体外证实亚硫酸盐对角蛋白酶水解羽毛角蛋白具有协同作用。基于此,提出半胱氨酸循环代谢步骤介导了分泌角蛋白酶的芽孢杆菌降解羽毛角蛋白的能力。随后通过构建半胱氨酸代谢和亚硫酸盐转运途径的关键基因缺失菌株,发现突变株△yde D、△Cdo1、△Ast1、△SSU1和△Cdo1△SSU1利用LCys转化产生的亚硫酸盐能力以及降解羽毛角蛋白的能力显着降低。进一步,将角蛋白酶和亚硫酸盐的协同体系植入B.subtilis WB600中并建立代谢模型,通过强化Cdo1和Ast1表达强度,发现菌株BSKer-43-CA和BSKer-566-CA代谢LCys产亚硫酸盐的能力分别提高了69.63%和37.06%,羽毛水解产物中的可溶性蛋白质含量也相应增加35.82%和26.87%。（3）构建并优化了角蛋白酶异源表达系统高活性的角蛋白酶对应着更好的羽毛角蛋白降解能力。在本研究中,通过使用组成型启动子p43可获得活性最高的胞外角蛋白酶Ker Z1。Ker Z1的最适p H和温度分别为10和60℃。利用RBS计算器v2.0预测角蛋白酶翻译水平,发现随着RBS序列移近翻译区域,其对翻译起始效率的影响降低。在-13至-18区域实施饱和突变,筛选获得最佳突变体RBS3的胞外角蛋白酶活性为22600.1 U×m L-1。RBS3在15-L发酵罐中的胞外角蛋白酶活性和生产率分别为426600.3 U×m L-1和15235.7 U×m L-1×h-1。利用角蛋白酶和亚硫酸盐协同水解100 g×L-1羽毛12 h,水解产物中总氨基酸含量达到56.6 g×L-1。（4）工程化前导肽提升角蛋白酶活性前导肽对角蛋白酶的活性表达至关重要。在本研究中,通过逐个截断前导肽二级结构以及前导肽切割位点P1的氨基酸替换证实了前导肽决定了角蛋白酶的胞外活性。通过序列比对和定点突变,得到7个突变体的角蛋白酶活性增加了16%66%。基于三密码子饱和突变,同时修饰了6个位点的氨基酸,利用较小的突变体文库筛选获得最佳突变体2-D12在摇瓶中的角蛋白酶活性达到227300.6 U×m L-1。利用工业化培养基,通过实时控制发酵过程并结合流加补料策略,突变体2-D12在15-L发酵罐中的角蛋白酶活性达到610800.9 U×m L-1,为目前报道的最高水平。2-D12协同亚硫酸盐在12 h内对100g×L-1羽毛的水解率达到90.67%,水解液中的总氨基酸含量为65.8 g×L-1,并包含分子量为1 k Da左右甚至更小的生物活性短肽。
李肖辉[7]（2020）在《转录因子CmtR调控牛分枝杆菌抗氧化适应的信号通路和分子机制研究》文中指出在胞内病原菌感染的过程中,宿主巨噬细胞会瞬间释放出大量的活性氧物质（ROS）来抑制细菌的生长;相应地,病原菌也进化出了自身的抗氧化生长策略。结核分枝杆菌和牛分枝杆菌是最成功胞内病原菌的典型代表,它们具有很强的抗逆（包括抗氧化）生长能力。然而,关于这些分枝杆菌应答和抗氧化适应的信号通路和分子机制目前还十分不清楚。本研究以牛分枝杆菌BCG作为模式菌株,在发现了Cmt R是一个新的氧化信号感应转录因子的基础上,进一步系统解析了Cmt R介导分枝杆菌抗氧化适应的信号通路和分子机制。本论文主要取得了以下几个方面的结果:（1）转录因子CmtR增强分枝杆菌的抗氧化生长能力,而且其24位的半胱氨酸残基在应答以及抗氧化过程中扮演关键作用。通过检测cmt R的不同表达水平对重组BCG菌株在H2O2胁迫下生长的影响,发现在H2O2压力条件下超表达cmtR显着增加了BCG的抗氧化生长能力而敲除该基因则明显降低了BCG的抗氧化生长能力。进一步,RT-q PCR实验分析在H2O2压力条件下分枝杆菌中cmt R基因的表达情况,发现H2O2显着诱导BCG胞内cmt R的表达。氨基酸定点突变实验结合EMSA实验证实:H2O2能够抑制野生型Cmt R蛋白的DNA结合活性,但不影响突变体Cmt R-C24S蛋白的活性;随后,重组BCG菌株的生长曲线实验证实,野生型cmt R基因而非突变基因cmt R-C24S能够互补cmt R敲除菌株对H2O2的抗性表型。（2）CmtR与Zur相互作用激活了esx-3操纵子的表达,并通过Cmt R-Esx3-Zn2+信号通路调控分枝杆菌的抗氧化生长。通过转录组测序比较野生型和cmt R敲除型菌株间基因表达差异,发现Cmt R正调控了VII型分泌系统esx-3操纵子的表达。然而,EMSA实验表明,CmtR不能直接结合esx-3操纵子的启动子。随后,利用SPR、细菌双杂交实验,我们发现Cmt R能够与阻遏子Zur特异性地相互作用。同时,Cmt R特异性地抑制Zur对esx-3操纵子的启动子的结合活性,而且H2O2促进了Cmt R对Zur的抑制作用。进一步,生长曲线以及ICP-OES实验证实:在H2O2胁迫条件下,敲除esx H和互补失去Zn2+结合能力的突变基因esx H（Mut3）均使BCG的抗氧化生长能力以及细菌胞内的Zn2+含量显着降低;相反,互补野生型基因esx H则能够使BCG的抗氧化生长能力以及细菌胞内的Zn2+含量得到回复。当在培养基中补充Zn2+时,Zn2+能够增强野生型BCG菌株的抗氧化能力。同时,在敲除cmt R的菌株中超表达esx H能够增强BCG的抗氧化生长能力。综合上述实验结果,Esx H促进Zn2+的吸收并有利于增强BCG的抗氧化生长能力,且Cmt R调控BCG的抗氧化生长能力是通过激活esx-3操纵子基因esx H的表达来实现的。最后,EMSA结合RT-q PCR实验表明,Zn2+能够抑制Cmt R的DNA结合活性并能够显着诱导BCG胞内cmt R的表达。因此,这些实验结果表明Cmt R通过Cmt R-Zur-Esx3-Esx H-Zn2+信号通路调控分枝杆菌的抗氧化生长能力。（3）CmtR有利于BCG抑制巨噬细胞内ROS的产生以及吞噬溶酶体的成熟,增强分枝杆菌在宿主体内的存活。通过流式细胞仪分析重组BCG菌株感染的巨噬细胞内ROS染料的平均荧光强度,发现cmt R敲除型菌株以及突变体基因cmtR-C24S的互补菌株均会显着增加巨噬细胞内ROS指示剂的平均荧光强度。随后,利用荧光共定位比较感染的巨噬细胞内吞噬溶酶体成熟的早期以及晚期标记物的平均荧光强度,发现cmt R超表达菌株显着降低了吞噬溶酶体成熟标记物的平均荧光强度;相反,cmt R敲除型菌株则明显增加了细胞内标记物的荧光强度。这些实验结果表明,BCG胞内cmt R的表达能够抑制巨噬细胞内ROS产生以及吞噬溶酶体的成熟。进一步,利用不同的巨噬细胞模型,我们发现cmt R的表达增加了BCG的胞内存活。最后,小鼠实验证实:超表达cmt R能够显着增加BCG在感染小鼠肺部的存活,而敲除该基因则使得BCG在感染小鼠肺部的存活明显降低。本研究成功鉴定了一个新的氧化感应子CmtR,系统解析了其调控分枝杆菌抗氧化生长的信号通路和分子机制,进一步发现了它在抵抗宿主巨噬细胞免疫中的作用。这些工作拓展了我们对分枝杆菌抗氧化适应分子机制的认识,也强化了我们对病原与宿主互作机制的了解。
孙红梅[8]（2020）在《桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析》文中研究表明桑树（Morus alba）根系发达,枝繁叶茂,生命力旺盛,具有较强的环境适应性,因此在世界范围内分布广泛。在我国,桑树作为生态防护林选用树种,可起到防沙固土,减少地表径流,保持原生态土壤结构的作用。另一方面,因桑树生长迅速,地上部分生物量大,被应用到自然生态修复系统中,例如修复被重金属污染的土壤、多石的贫瘠荒漠以及戈壁沙漠化区域等。桑树具有顽强的生存能力,源于其所拥有的独特生理特性,近年来在植物遗传学应用领域备受关注,涉及桑树抗逆基因资源挖掘及开发利用等研究。本研究从桑树中克隆得到3个干旱差异表达基因:叶绿体干旱胁迫诱导蛋白编码基因（chloroplast drought-induced stress protein of 32 k Da,Ma CDSP32）,IAA-氨基酸水解酶编码基因（ILR1-5（IAA-amino acid hydrolase ILR1-like 5,Ma ILR1）和抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase,Ma APX2））进行基因克隆、表达分析及基因功能分析,通过对目标序列的生物信息学分析、表达特性分析、转基因植株的抗逆性分析以及在干旱胁迫下的转录组数据分析,实现对目标基因在植物响应环境胁迫条件下分子功能的探索,为在未来以生物技术工程为手段改善植物的环境适应性和在实际生产中发挥桑树品种质资源优势等工作铺垫基石。本研究取得的主要结果如下:1.三个基因的克隆及亚细胞定位桑树中Ma CDSP32、Ma ILR1和Ma APX2基因的编码区长度分别为909 bp、1302 bp和750bp,分别编码303、434和250个氨基酸。预测结果显示,三个编码蛋白的亲水性和稳定性良好。Ma CDSP32编码的蛋白质定位在叶绿体基质中;Ma APX2编码的蛋白酶定位在细胞质内,主要富集在细胞膜和细胞核附近;Ma ILR1编码一个膜蛋白,为分泌型蛋白,定位在细胞膜上。2.三个基因在不同生长条件下的表达模式Ma CDSP32基因主要在桑树成熟叶片中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma CDSP32在15:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma CDSP32表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma ILR1基因主要在幼叶中表达,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;Ma ILR1无明显生物钟表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma ILR1表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。Ma APX2基因在地上部分表达量一致,在桑树不同种间具有表达偏好性,但与基因组倍性无关;一天内,Ma APX2在12:00时达到表达高峰,呈生物钟节律表达规律;非生物胁迫和外源激素可诱导Ma APX2表达水平发生变化,但在叶片和根中表达模式不同。3.Ma CDSP32瞬时表达桑叶的基因功能研究瞬时过表达Ma CDSP32的离体桑叶相比于未转化桑叶,在自然晾干过程中失水量增加。PEG模拟的水分胁迫下,桑叶中Ma MRSB、Ma P5CS、Ma PRX、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平以及ROS的积累量受Ma CDSP32过表达影响发生改变;盐胁迫下,桑叶中Ma WRKY、Makds A、Ma DREB和Ma MAPK基因的表达水平也受到Ma CDSP32过表达影响发生改变。这些结果表明Ma CDSP32会影响胁迫相关基因的表达水平,并参与植物非生物胁迫应答过程。4.Ma CDSP32在转基因烟草中的基因功能研究Ma CDSP32稳定转化烟草获得的转基因株系（OE-2和OE-7）与野生型烟草相比,在自然晾干过程其离体叶片失水量增加。转基因烟草对干旱敏感性增加,叶片中ROS积累和MDA含量增加,多种抗氧化酶活性降低,脯氨酸和可溶性糖积累减少;但复水后转基因植株的生长恢复能力增强,ROS积累减少,MDA含量减少,多种抗氧化酶活性增强,脯氨酸和可溶性糖积累增加。胁迫期间,转基因植株中Nt CAT、Nt ADC2、Nt LEA5和Nt MSRB基因的表达水平相对野生型发生改变。此外,Ma CDSP32通过促进转基因烟草种子和幼苗中Nt MSRB表达上调,减少ROS积累,显着增加了种子在渗透胁迫下的萌发率和幼苗生长。在盐胁迫下,叶绿素含量在Ma CDSP32转基因植株中增加,而在野生型植株中减少。这些结果揭示Ma CDSP32主要是通过参与氧化还原途径调节植物的抗逆性。5.Ma CDSP32在转基因拟南芥中的基因功能研究Ma CDSP32转基因拟南芥株系（OE-3和OE-9）与野生型拟南芥和At CDSP32突变拟南芥株系（mt-1和mt-2）相比,在干旱胁迫期间OE株系萎蔫较严重,ROS积累和MDA含量较多,SOD、POD和APX抗氧化酶活性较低。但OE株系相比野生型和突变体株系,在复水后成活率较高。在干旱和盐胁迫下,植株中不同Ma CDSP32或At CDSP32表达水平会影响At SOD、At POD、At CAT、At PRX、At APX2和At GR基因的表达水平。盐胁迫处理后,突变体株系的叶绿素含量相比野生型和OE株系降低。在渗透胁迫下OE拟南芥种子的萌发率较野生型和突变体种子显着增加。此外,OE拟南芥株系出现早花现象,其中At SOC1基因表达较野生型和突变体显着上调。这些结果表明Ma CDSP32主要是通过参与逆境应答的氧化还原途径影响植物的逆境生理和种子萌发过程,且Ma CDSP32通过影响At SOC1基因表达参与植物开花时间调节。6.Ma CDSP32过表达烟草干旱胁迫转录组学分析转基因烟草的转录组数据分析显示,在干旱处理期间,OE与WT株系差异表达基因主要集中在催化活性、核酸结合转录、转录因子活性、光合作用相关膜组件、糖类代谢进程和肽链内切酶调节因子酶活性等生理过程方面;复水后,OE与WT株系差异表达基因主要集中在高分子生物合成、氮化合物生物合成、催化活性和水解酶活性等生理过程方面。进一步分析发现,这些差异表达基因在苯丙素的生物合成、光合作用-触角蛋白、角质素,软木脂和蜡质的生物合成、核糖体和光合系统的固碳作用等通路中上调基因最多;这些差异表达基因在内质网蛋白加工、半乳糖代谢、倍半萜和三萜生物合成和脂肪酸延伸等通路中下调基因最多。此外,与WT株系相比,OE株系中在半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径、淀粉和糖类代谢途径、油菜素类固醇代谢途径、植物激素信号传导代谢途径和光合元件固碳作用代谢途径,以及抗氧化酶活性、脯氨酸合成代谢和糖合成代谢等方面所涉及的差异表达基因均出现干旱期间下调而复水后上调的变化趋势。推测这些差异表达基因是Ma CDSP32基因在干旱期间和复水后参与调节植物抗旱性相互作用的关键位点。综上,本研究得到的主要结果表明,桑树中的干旱持续表达基因Ma CDSP32通过参与植物抗逆过程中的ROS代谢调节过程,增强了植株的抗旱性,揭示了Ma CDSP32参与提高植物旱后恢复能力的分子机制。这项研究为桑树品种质资源优势的开发利用筛选了基因资源,为以分子生物技术手段改善植物的环境适应性和生存能力提供了新思路。
杭奕[9]（2020）在《单增李斯特菌谷氧还蛋白介导的抗氧化应激及感染机制研究》文中提出单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌,属革兰氏阳性胞内寄生菌,是一种重要的食源性人兽共患病原微生物。单增李斯特菌可在氧化等极端环境中生存,该抗氧化特性在其感染宿主过程中不可或缺。细菌中主要包含两套重要的巯基依赖性氧化还原系统,即硫氧还蛋白（Thioredoxin,Trx）和谷氧还蛋白（Glutaredoxin,Grx）系统。已知单增李斯特菌Trx系统在细菌抗氧化应激生物学过程中发挥至关重要的作用,但其中是否存在Grx系统尚未得知。通过生物信息学方法预测分析,单增李斯特菌含有一个Grx同源蛋白,该蛋白由lmo2344基因编码,并含有硫氧还蛋白家族（Thioredoxin family）保守的双半胱氨酸CXXC活性基序,但其生物学功能尚不得知。因此,本研究将结合分子生物学、应激生物学、细胞生物学等手段,重点探究单增李斯特菌Grx参与细菌抗氧化应激及介导细菌毒力过程中发挥的生物学功能和意义。研究结果如下:硫氧还蛋白家族成员属氧化还原蛋白,故采用经典胰岛素二硫键还原试验并进行酶活分析。单增李斯特菌Grx体外重组蛋白能够以DTT为电子供体催化还原胰岛素（氧化型,含二硫键）,具备该家族蛋白还原酶特性。单增李斯特菌缺失grx后,细菌生长分裂能力未受影响,但细菌菌体显着变小（**P<0.01）。基于此结果,我们在普通BHI培养基中添加不同种类氧化剂,进行氧化应激点板试验。缺失grx后细菌在金属离子Cu2+、Cd2+和巯基特异性氧化剂肼（diamide）应激条件下相较于野生株生存能力显着增强。细胞感染试验结果表明,缺失grx菌株相较于野生株在巨噬细胞J774A.1存活及增殖能力显着增强（*P<0.05;**P<0.01）;在肠上皮细胞Caco-2中黏附与侵袭能力显着增强（*P<0.05;**P<0.01）;在成纤维细胞L929中侵袭及胞内增殖能力显着增强（**P<0.01）,但细胞间迁移能力无明显变化。小鼠脏器增殖试验结果表明,细菌缺失grx后相较于野生株在肝脏和脾脏两个靶器官中的定殖能力显着增强（*P<0.05;**P<0.01）,在小鼠模型中毒力增强。为进一步探索缺失grx后细菌抗氧化应激及毒力显着增强的原因,在4 m M巯基特异性氧化剂肼应激条件下,我们对李斯特菌野生株EGD-e和grx缺失株进行全基因转录组测序。grx缺失株中细菌抗氧化应激相关基因lmo0722、qox A、qox B、gr以及毒力相关基因inl A、inl B、opu CA、opu CB、opu CC、opu CD等基因的转录水平相较于野生株均显着上调。采用实时荧光定量PCR、荧光报告系统和蛋白质免疫印迹技术（Western Blot）验证转录组数据,该结果更直观表明Grx参与抗氧化应激及细菌毒力调控。凝胶电泳迁移试验（EMSA）结果说明Grx间接调控lmo0722、qox A/B、gr、opu CA/B/C/D、inl A/B基因。综上所述,本研究以单增李斯特菌谷氧还蛋白Grx为研究对象,首次探索Grx在氧化应激环境以及在宿主内感染和生存过程中发挥的抗氧化应激及毒力调控功能。本研究为完善包括李斯特菌在内的重要食源性病原菌的抗氧化应激生存及感染机制奠定了关键基础,且对于深入完善人兽共患病原菌的防控策略和保障公共卫生具有重要意义。
齐琪[10]（2020）在《番茄硫氧还蛋白（SlTrxh）参与NO缓解硝酸盐胁迫的机理分析》文中提出次生盐渍化是我国设施土壤存在的问题之一,严重影响蔬菜的生长和品质,并与农业的可持续发展息息相关。其中,NO3-是设施土壤中含量最多的阴离子。NO是植物生长发育和逆境胁迫响应中重要的信号分子。研究表明,S-亚硝基化是NO发挥生物活性的主要机制之一。硫氧还蛋白（Trx）系统（包括Trx,Trx还原酶（NTR））是植物体内主要的去亚硝基化系统,参与胁迫下生物体内NO介导的蛋白亚硝基化、去亚硝基化的氧化还原调节。本论文主要对番茄硫氧还蛋白基因（SlTrxh）参与NO缓解硝酸盐机理进行研究,取得结果如下:1.研究了外源施加SNP（NO供体）硝酸盐处理下对番茄幼苗的表型、抗氧化系统和SlTrx表达的影响。与对照相比,硝酸盐处理一周后,番茄幼苗根系不发达、植株矮小、生物量下降。100μM SNP溶液时番茄的生长状态较好,与对照幼苗长势最接近。150 mM硝酸盐胁迫下,番茄根系的ROS、MDA和NO含量均显着上升,抗氧化物酶（SOD、POD、CAT）活性显着升高。外源施加100μM SNP,与硝酸盐胁迫相比,ROS、MDA和NO含量下降,CAT和POD活性显着增加。与正常处理相比,硝酸盐胁迫下的番茄硫氧还蛋白系统的关键基因SlTrxh、番茄Trx还原酶B（SlNTRB）、以及番茄硫氧还蛋白过氧化物酶（SlTpx）的基因表达量升高。外源施加SNP后,与硝酸盐胁迫相比,SlTrxh、SlTpx的表达量显着增加。硝酸盐胁迫后番茄中S-亚硝基化蛋白增加,S-亚硝基化的SlTrxh和SlNTRB的蛋白表达量也增加,硝酸盐溶液中施加SNP后S-亚硝基化的SlTrxh蛋白表达量进一步增加。以上结果说明硫氧还蛋白（Trx）系统参与NO缓解硝酸盐胁迫的过程。2.通过原核表达、纯化番茄SlTrxh、SlNTRB和SlTpx蛋白,分析Trx系统的去亚硝基化活性。通过GPS-SNO 1.0预测番茄Trxh序列中位于54位的Cys是可能的S-亚硝基化的关键位点,将该Cys位点突变为Ser,并进一步获得SlTrxC54S突变体蛋白,发现其胰岛素还原活性降低。通过NO供体（GSNO）使BSA发生S-亚硝基化后,生物素转化实验表明,完整的硫氧还蛋白系统可以使其去亚硝基化,而SlTrxC54S不具有去硝基化酶活性。3.获得SlTrxh、SlTpx和SlNTRB过表达转基因烟草,对SlTrxh进行了抗性功能分析。硝酸盐胁迫后的过表达SlTrxh烟草的发芽率、根长高于WT,H2O2和O2-含量低于WT。对幼苗进行硝酸盐处理后发现SlTrxh的过表达转基因烟草长势更好,ASA/DHA和GSH/GSSG比值和NTR活性高于WT,而MDA、H2O2含量低于WT,表明SlTrxh过表达转基因烟草的硝酸盐胁迫抗性增加。此外,甲基紫精（MV）处理过表达SlTrxh的烟草,发现其对氧化胁迫的耐受性增强。4.通过酵母双杂交实验、Pull-down实验和免疫共沉淀,证明了番茄的Trxh与S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（GSNOR）存在蛋白相互作用。从生理生化和分子水平上,揭示了SlTrxh参与番茄应答硝酸盐胁迫的作用机制,有助于丰富我们对蔬菜应答次生盐渍化的机制的认识。
二、硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达（论文提纲范文）
（1）家蝇硫氧还蛋白2单克隆抗体的制备及抗氧化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 硫氧还蛋白简介 |
| 1.2 硫氧还蛋白生物学功能 |
| 1.3 氧化应激与抗氧化系统 |
| 1.4 昆虫中的硫氧还蛋白 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.1 实验动物及细胞株 |
| 2.1.2 质粒、菌种及引物 |
| 2.1.3 主要实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Trx基因的生物信息学分析 |
| 2.2.2 MdTrx2 的原核表达 |
| 2.2.3 rMdTrx2 的纯化及活性检测 |
| 2.2.4 MdTrx2 促进宿主菌对PMS的耐受 |
| 2.2.5 rMdTrx2 的金属结合活性 |
| 2.2.6 动物免疫方案 |
| 2.2.7 单克隆抗体的制备 |
| 2.2.8 筛选阳性杂交瘤细胞 |
| 2.2.9 单克隆抗体的纯化 |
| 2.2.10 单克隆抗体的特性鉴定 |
| 2.2.11 MdTrx2 在家蝇发育和组织中的表达分析 |
| 2.2.12 MdTrx2 在不同胁迫条件下的表达分析 |
| 2.2.13 MdTrx2 干扰后在重金属镉刺激条件下家蝇幼虫的存活率及线粒体活性分析 |
| 第三章 实验结果与讨论 |
| 3.1 MdTrx2 基因的克隆与序列分析 |
| 3.2 MdTrx2 的原核表达及蛋白活性分析 |
| 3.3 MdTrx2 促进宿主菌对PMS的耐受 |
| 3.4 rMdTrx2 的金属结合活性 |
| 3.5 MdTrx2 单克隆抗体的制备及特性鉴定 |
| 3.6 MdTrx2 在家蝇发育和组织中的表达模式 |
| 3.7 MdTrx2 在不同胁迫条件下的表达模式 |
| 3.8 MdTrx2 对家蝇幼虫抵抗重金属Cd~(2+)的影响 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的科研成果 |
（2）弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 弓形虫概述 |
| 1.1.1 弓形虫与弓形虫病 |
| 1.1.2 弓形虫的生活史 |
| 1.1.3 弓形虫的基因型和毒力 |
| 1.2 弓形虫入侵宿主细胞的机制 |
| 1.3 宿主对弓形虫的识别及免疫应答作用 |
| 1.4 弓形虫的主要毒力因子及逃逸机制 |
| 1.5 弓形虫的氧化还原系统及研究进展 |
| 1.6 CRISPR/Cas9基因敲除技术在弓形虫研究领域的应用 |
| 1.6.1 CRISPR/Cas9 的工作原理 |
| 1.6.2 CRISPR/Cas9 基因敲除技术在弓形虫上的研究进展 |
| 1.6.3 基于CRISPR/Cas9 系统高通量筛选技术 |
| 1.7 选题的目的意义 |
| 第二章 氧化应激模型的建立 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验试剂与耗材 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 Vero细胞的复苏及培养 |
| 2.1.4 弓形虫的培养 |
| 2.1.5 CCK-8 测定Vero细胞的活力 |
| 2.1.6 细胞内ROS水平的测定 |
| 2.1.7 H_2O_2对弓形虫的影响 |
| 2.1.8 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 2.1.9 数据分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 H_2O_2对Vero细胞形态的影响 |
| 2.2.2 H_2O_2对Vero细胞活力的影响 |
| 2.2.3 H_2O_2对细胞内ROS水平的影响 |
| 2.2.4 体外孵育时间对弓形虫活力的影响 |
| 2.2.5 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 RH/CAS9 株的构建及敲除效率的验证 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验试剂与耗材 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试剂配制 |
| 3.1.4 质粒pCas9-CAT和 pCas9-decoy的扩大培养及提取 |
| 3.1.5 RH/Cas9 虫株的构建 |
| 3.1.6 RH/Cas9 虫株的PCR鉴定 |
| 3.1.7 pU6-sgSAG1-DHFR质粒的构建及鉴定 |
| 3.1.8 SAG1 缺失株的构建 |
| 3.1.9 RH/Cas9 株敲除效率的PCR鉴定 |
| 3.1.10 间接免疫荧光鉴定RH/Cas9 株敲除效率 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 RH/Cas9 虫株的PCR鉴定 |
| 3.2.2 pU6-sgSAG1-DHFR质粒的构建 |
| 3.2.3 pU6-SAG1-DHFR质粒的鉴定 |
| 3.2.4 RH/Cas9 虫株敲除效率的验证 |
| 3.2.5 间接免疫荧光验证RH/Cas9 虫株的敲除效率 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 抗氧化相关基因的筛选及鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验试剂与耗材 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 Vero细胞的准备 |
| 4.1.4 质粒文库的准备 |
| 4.1.5 RH/Cas9 虫株的准备 |
| 4.1.6 弓形虫基因缺失株库的构建 |
| 4.1.7 H_2O_2筛选弓形虫抗氧化相关基因 |
| 4.1.8 全基因组sg RNAs的 Illumina测序 |
| 4.1.9 测序数据分析 |
| 4.1.10 构建pU6-sgHPs-DHFR质粒 |
| 4.1.11 pU6-sgRNA-DHFR质粒的扩增及提取 |
| 4.1.12 HPs单克隆缺失株的筛选 |
| 4.1.13 基因敲除虫株的PCR鉴定 |
| 4.1.14 不同缺失株对H_2O_2的敏感性试验 |
| 4.1.15 H_2O_2对细胞内弓形虫增殖的影响 |
| 4.1.16 虫体活性氧检测 |
| 4.1.17 虫体MDA水平检测 |
| 4.1.18 虫体总抗氧化能力检测 |
| 4.1.19 入侵试验 |
| 4.1.20 增殖试验 |
| 4.1.21 噬斑试验 |
| 4.1.22 对小鼠的毒力试验 |
| 4.1.23 数据分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 sgRNA文库质粒的转化及扩大 |
| 4.2.2 利用H_2O_2进行全基因组筛选 |
| 4.2.3 抗氧化基因的筛选 |
| 4.2.4 pU6-sgRNA-DHFR质粒构建 |
| 4.2.5 单基因缺失株的构建 |
| 4.2.6 不同缺失株对H_2O_2的敏感性试验 |
| 4.2.7 H_2O_2对弓形虫增殖能力的影响 |
| 4.2.8 虫体内ROS、T-AOC和 MDA水平的测定 |
| 4.2.9 弓形虫感染巨噬细胞后对巨噬细胞ROS的影响 |
| 4.2.10 HPs-KO株的入侵和增殖能力 |
| 4.2.11 噬斑试验 |
| 4.2.12 对小鼠的毒力试验 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 HP1 的表达、鉴定及与相关的虫体蛋白的筛选 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验试剂与耗材 |
| 5.1.2 试验仪器 |
| 5.1.3 HP1 的生物信息学分析 |
| 5.1.3.1 HP1 序列分析 |
| 5.1.3.2 蛋白理化性质分析 |
| 5.1.3.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 5.1.3.4 结构域及基序分析 |
| 5.1.3.5 同源分析 |
| 5.1.4 HP1 的原核表达 |
| 5.1.4.1 虫体收集及RNA的提取 |
| 5.1.4.2 HP1 基因克隆 |
| 5.1.4.3 原核表达载体pET-32a-HP1 的构建及验证 |
| 5.1.4.4 重组蛋白HP1 的诱导表达及鉴定 |
| 5.1.4.5 重组蛋白HP1 的大量表达及纯化 |
| 5.1.5 多克隆抗体的制备 |
| 5.1.6 HP1 的定位分析 |
| 5.1.7 HP1 蛋白酶活性的测定 |
| 5.1.8 免疫共沉淀 |
| 5.1.8.1 虫体蛋白的准备 |
| 5.1.8.2 去除非特异性结合 |
| 5.1.8.3 免疫共沉淀 |
| 5.1.8.4 质谱分析 |
| 5.1.8.5 数据库检索 |
| 5.1.8.6 生物信息学分析 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 生物信息学分析 |
| 5.2.1.1 HP1 基因结构 |
| 5.2.1.2 蛋白理化性质分析 |
| 5.2.1.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 5.2.1.4 结构域及基序分析 |
| 5.2.1.5 多物种氨基酸序列比对及同源进化分析 |
| 5.2.2 HP1 的表达及鉴定 |
| 5.2.2.1 HP1 的扩增 |
| 5.2.2.2 重组质粒pET-32a-HP1 的鉴定 |
| 5.2.3 HP1 重组蛋白的表达及纯化 |
| 5.2.4 HP1 的定位分析 |
| 5.2.5 HP1 蛋白酶活性测定 |
| 5.2.6 与相互作用蛋白的筛选及鉴定 |
| 5.2.6.1 SDS-PAGE鉴定免疫产物 |
| 5.2.6.2 质谱分析及数据库检索结果 |
| 5.2.6.3 质谱数据分析 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 弓形虫HP1-KO株的构建及转录组分析 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验试剂与耗材 |
| 6.1.2 试验仪器 |
| 6.1.3 CRISPR/Cas9 基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及鉴定 |
| 6.1.4 HP1 缺失株的构建 |
| 6.1.5 HP1 缺失株的PCR验证 |
| 6.1.6 HP1 互补株的构建 |
| 6.1.7 弓形虫HP1-KO虫株的转录组分析 |
| 6.1.7.1 样品收集 |
| 6.1.7.2 RNA提取 |
| 6.1.7.3 转录组测序及序列比对分析 |
| 6.1.7.4 差异基因的GO分析及KEGG富集分析 |
| 6.1.8 荧光定量PCR验证差异基因 |
| 6.1.9 数据分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 HP1 敲除质粒的构建与鉴定 |
| 6.2.2 HP1 缺失株的PCR鉴定 |
| 6.2.3 HP1 互补株的构建 |
| 6.2.4 弓形虫HP1-KO虫株的转录组分析 |
| 6.2.4.1 数据质控 |
| 6.2.4.2 样本关系分析 |
| 6.2.4.3 差异基因分析 |
| 6.2.4.4 GO分析 |
| 6.2.4.5 KEGG分析 |
| 6.2.5 荧光定量PCR验证差异基因 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 HP1 与CAT的双基因缺失株的构建及表型研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验试剂与耗材 |
| 7.1.2 试验仪器 |
| 7.1.3 CAT基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及鉴定 |
| 7.1.4 HP1 与CAT双基因缺失株的构建及验证 |
| 7.1.5 H_2O_2对HP1/CAT双缺失株的影响 |
| 7.1.6 小鼠体内增殖试验 |
| 7.1.7 对小鼠的毒力试验 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 HP1 与CAT双基因缺失株的构建及验证 |
| 7.2.2 HP1/CAT-KO对 H_2O_2的敏感性试验 |
| 7.2.3 小鼠体内试验 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 AKHP的原核表达、敲除及功能研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 试验试剂与耗材 |
| 8.1.2 试验仪器 |
| 8.1.3 AKHP的生物学信息分析 |
| 8.1.4 AKHP的原核表达 |
| 8.1.5 WB验证 |
| 8.1.6 AKHP定位分析 |
| 8.1.6.1 定位质粒pMD-18T-AKHP的构建 |
| 8.1.6.2 定位分析 |
| 8.1.7 CRISPR/Cas9 基因敲除质粒和同源重组质粒的构建及AKHP缺失株的构建 |
| 8.1.8 互补株的构建 |
| 8.1.9 间接免疫荧光分析 |
| 8.1.10 AKHP缺失株的表型分析 |
| 8.1.10.1 入侵试验 |
| 8.1.10.2 增殖试验 |
| 8.1.11 AKHP缺失株株对H_2O_2的敏感性 |
| 8.1.12 抗氧化能力测定 |
| 8.1.13 AKHP的缺失对其他抗氧化基因的影响 |
| 8.1.14 AKHP缺失株对巨噬细胞ROS的影响 |
| 8.1.15 数据分析 |
| 8.2 结果 |
| 8.2.1 生物信息学分析 |
| 8.2.1.1 AKHP的基因结构 |
| 8.2.1.2 AKHP理化性质分析 |
| 8.2.1.3 蛋白信号肽及跨膜区预测 |
| 8.2.1.4 AKHP氨基酸序列对比 |
| 8.2.1.5 三级结构预测 |
| 8.2.1.6 蛋白互作关系分析 |
| 8.2.2 AKHP蛋白表达 |
| 8.2.2.1 AKHP的编码全长扩增 |
| 8.2.2.2 重组质粒pET-28a-AKHP的鉴定 |
| 8.2.2.3 AKHP重组蛋白的表达及纯化 |
| 8.2.3 AKHP的 WB验证 |
| 8.2.4 AKHP的定位分析 |
| 8.2.5 AKHP敲除质粒的构建及鉴定 |
| 8.2.6 AKHP缺失株的PCR鉴定 |
| 8.2.7 AKHP互补株的PCR鉴定 |
| 8.2.8 AKHP缺失株的间接免疫荧光鉴定 |
| 8.2.9 表型分析 |
| 8.2.10 AKHP缺失株对H_2O_2敏感性试验 |
| 8.2.11 抗氧化指标的测定 |
| 8.2.12 AKHP基因对其他抗氧化基因表达量的影响 |
| 8.2.13 AKHP缺失对巨噬细胞ROS水平的影响 |
| 8.3 讨论 |
| 第九章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（3）富含二硫键的多肽制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 二硫键多肽简介 |
| 1.1.1 芋螺毒素的简介 |
| 1.1.2 芋螺毒素的命名与分类 |
| 1.1.3 芋螺毒素的药理多样性 |
| 1.1.4 芋螺毒素的药用价值 |
| 1.2 富含二硫键的多肽制备方法 |
| 1.2.1 化学合成 |
| 1.2.2 异源表达 |
| 1.3 研究目的与意义 |
| 第2章 在大肠杆菌中表达两种芋螺毒素GⅢB、PⅢA |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 相关试剂和实验仪器 |
| 2.1.3 培养基和实验溶液配制 |
| 2.1.4 感受态细胞的制备 |
| 2.2 实验步骤 |
| 2.2.1 构建pET32a-TEV-GⅢB/PⅢA重组质粒 |
| 2.2.2 pET32a-TEV-GⅢB/PⅢA重组蛋白的表达 |
| 2.2.3 pET32a-TEV-GⅢB/PⅢA重组蛋白的纯化 |
| 2.2.4 MALDI-TOF质谱检测分子量 |
| 2.2.5 电生理活性实验 |
| 2.2.6 圆二色光谱测定GⅢB/PⅢA的二级结构 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 构建pET32a-TEV-GⅢB/PⅢA重组质粒的构建 |
| 2.3.2 pET32a-TEV-GⅢB/PⅢA重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.3.3 MALDI-TOF质谱检测分子量 |
| 2.3.4 电生理实验 |
| 2.3.5 圆二色光谱测定GⅢB/PⅢA的二级结构 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 在大肠杆菌中表达三种芋螺毒素 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 利用MBP标签在大肠杆菌pETduet-1中表达CnⅢC/KⅢA |
| 3.2.1 构建MBP-TEV-CnⅢC/KⅢA重组质粒 |
| 3.2.2 MBP-TEV-CnⅢC/KⅢA重组蛋白表达纯化 |
| 3.2.3 结果与讨论 |
| 3.2.4 小结 |
| 3.3 利用sumo标签在大肠杆菌中表达PⅢA |
| 3.3.1 构建pETduet-sumo-PⅢA重组质粒 |
| 3.3.2 结果与讨论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 附录A |
| 致谢 |
（4）番茄SlPrx应答低氮胁迫的机理分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 土壤中的氮 |
| 1.1.1 氮是限制植物生长的主要元素之一 |
| 1.1.2 提高氮利用效率的意义 |
| 1.1.3 低氮胁迫对植物的影响及植物的响应 |
| 1.2 NO在植物逆境生理中的作用 |
| 1.2.1 植物中的NO |
| 1.2.2 植物中NO介导的翻译后修饰 |
| 1.2.3 蛋白的S-亚硝基化 |
| 1.3 Prx相关研究 |
| 1.3.1 2-Cys-Prx的结构、类型 |
| 1.3.2 植物中的2-Cys-Prx |
| 1.3.3 Prx过氧化物酶的功能及研究进展 |
| 1.3.4 Grx谷氧还蛋白基因 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 番茄SlPrx参与NO缓解低氮胁迫的机理分析 |
| 2.1 材料与处理 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验材料处理 |
| 2.2 测定项目与方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.2 RNA反转成c DNA |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 ROS和NO荧光探针标记 |
| 2.2.5 硝酸盐含量和硝酸盐还原酶活性的测定 |
| 2.2.6 谷氨酰胺合成酶(GS)的测定 |
| 2.2.7 叶绿素含量的测定 |
| 2.2.8 生物素转换法分析S-亚硝基化蛋白 |
| 2.2.9 Western blot |
| 2.2.10 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 外源施加SNP对低氮胁迫下番茄幼苗的形态指标的影响 |
| 2.3.2 外源施加SNP对低氮胁迫下番茄幼苗叶绿素含量的影响 |
| 2.3.3 外源施加SNP对低氮胁迫下番茄幼苗根系的ROS含量的影响 |
| 2.3.4 外源施加SNP对低氮胁迫下番茄幼苗的NO含量的影响 |
| 2.3.5 外源施加SNP对低氮胁迫下番茄幼苗叶片中硝酸盐含量、NR和GS活性的影响 |
| 2.3.6 外源施加SNP对低氮胁迫下番茄SlPrx、SlGrx和氮代谢相关基因表达量的影响 |
| 2.3.7 低氮胁迫下外源施加SNP对番茄幼苗S-亚硝基化蛋白的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 番茄SlPrx蛋白的体外功能及与蛋白的互作分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 测定指标及方法 |
| 3.2.1 SlPrx、SlGrx的克隆 |
| 3.2.2 DNA片段回收 |
| 3.2.3 构建原核表达载体 |
| 3.2.4 SlPrx、SlGrx重组蛋白诱导表达 |
| 3.2.5 蛋白纯化 |
| 3.2.6 蛋白抗体的制备 |
| 3.2.7 蛋白质S-亚硝基化位点的预测 |
| 3.2.8 定点突变分析 |
| 3.2.9 蛋白S-亚硝基化分析 |
| 3.2.10 SlPrx对重金属和H_2O_2毒性的抗逆性体外试验 |
| 3.2.11 SlPrx的 H_2O_2清除能力的测定 |
| 3.2.12 SlPrx的过氧还蛋白活性的测定 |
| 3.2.13 混合功能氧化酶测定 |
| 3.2.14 生物素转换技术分析S-亚硝基化蛋白 |
| 3.2.15 Western blot |
| 3.2.16 酵母双杂交实验 |
| 3.2.17 Pull-down实验 |
| 3.2.18 免疫共沉淀(Co-IP)实验 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SlPrx、SlGrx重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 SlPrx可能的半胱氨酸S-亚硝化位点进行分析 |
| 3.3.3 pET-28a-SlPrx重组突变体蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.4 SlPrx清除H_2O_2能力和过氧还蛋白活性测定 |
| 3.3.5 SlPrx的抗氧化性能对DNA的保护试验 |
| 3.3.6 SlPrx对重金属和H_2O_2的抗性分析 |
| 3.3.7 SlPrx重组蛋白的S-亚硝基化分析 |
| 3.3.8 SlPrx重组蛋白及其突变体蛋白的S-亚硝基化 |
| 3.3.9 SlPrx-C3S突变蛋白对H_2O_2的清除能力分析 |
| 3.3.10 SlPrx与 SlTrx的相互作用分析 |
| 3.3.11 SlPrx与 SlGrx的相互作用分析 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SlPrx和 SlGrx过表达和基因编辑载体的构建及转基因番茄的获得 |
| 4.1 材料与处理 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.2 测定项目与方法 |
| 4.2.1 SlGrx的克隆 |
| 4.2.2 DNA片段回收 |
| 4.2.3 表达载体的酶切及回收 |
| 4.2.4 构建表达载体 |
| 4.2.5 基因编辑载体的构建及农杆菌介导法转化番茄 |
| 4.2.6 基因组DNA的提取 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 基因编辑载体及植物过表达载体的构建 |
| 4.3.2 转基因番茄鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表的论文 |
（5）弓形虫硫氧还蛋白的生物学特性及功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 弓形虫及弓形虫病基本概述 |
| 1.1.1 发现过程 |
| 1.1.2 流行情况及特点 |
| 1.1.3 分类及发育形态 |
| 1.1.4 生活史 |
| 1.1.5 临床表现及危害 |
| 1.1.6 致病机制 |
| 1.1.7 入侵与增殖过程及重要蛋白质 |
| 1.1.8 治疗方法 |
| 1.2 硫氧还蛋白 |
| 1.2.1 硫氧还蛋白的功能 |
| 1.2.2 硫氧还蛋白的作用机制 |
| 1.2.3 寄生虫硫氧还蛋白的研究进展 |
| 1.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术 |
| 1.3.1 CRISPR/Cas9技术原理 |
| 1.3.2 CRISPR/Cas9基因编辑 |
| 1.3.3 CRISPR/Cas9技术应用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 弓形虫Trx生物信息学分析与基因克隆 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 弓形虫Trx基本性质 |
| 2.3.2 弓形虫Trx理化性质 |
| 2.3.3 弓形虫Trx二级结构、免疫原性及亲疏水性 |
| 2.3.4 弓形虫Trx信号肽及跨膜区 |
| 2.3.5 弓形虫Trx结构域分析 |
| 2.3.6 弓形虫Trx同源性及进化树分析 |
| 2.3.7 目的片段扩增结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 弓形虫Trx结构特点 |
| 2.4.2 虫体纯化方式的选择 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 弓形虫Trx表达、定位及抗体特异性检测 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组表达质粒双酶切鉴定结果 |
| 3.3.2 重组蛋白质表达与纯化结果 |
| 3.3.3 免疫小鼠血清抗体效价检测结果 |
| 3.3.4 抗体特异性检测结果 |
| 3.3.5 弓形虫Trx天然表达鉴定结果 |
| 3.3.6 弓形虫Trx分泌特性鉴定结果 |
| 3.3.7 弓形虫Trx亚细胞定位结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 酶切位点选择原则 |
| 3.4.2 蛋白质诱导表达条件确定 |
| 3.4.3 多克隆抗体制备条件确定 |
| 3.4.4 亚细胞定位分析 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 弓形虫Trx黏附能力、抗氧化能力、转录及表达水平分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 氧化还原活性分析结果 |
| 4.3.2 肝素结合实验结果 |
| 4.3.3 细胞黏附实验结果 |
| 4.3.4 抗氧化实验结果 |
| 4.3.5 转录水平分析结果 |
| 4.3.6 表达水平分析结果 |
| 4.3.7 抗H_2O_2氧化能力结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 弓形虫Trx氧化还原活性分析 |
| 4.4.2 弓形虫Trx肝素结合能力分析 |
| 4.4.3 弓形虫Trx细胞黏附能力分析 |
| 4.4.4 弓形虫Trx抗氧化能力分析 |
| 4.4.5 弓形虫Trx转录及表达水平分析 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 弓形虫Trx过表达虫株的构建及其表型研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 弓形虫Trx过表达虫株单克隆鉴定结果 |
| 5.3.2 弓形虫Trx过表达虫株入侵速率比较结果 |
| 5.3.3 弓形虫Trx过表达虫株增殖速率比较结果 |
| 5.3.4 弓形虫Trx过表达虫株转录水平比较结果 |
| 5.3.5 弓形虫Trx过表达虫株表达水平比较结果 |
| 5.3.6 弓形虫Trx过表达虫株氧化还原指标比较结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 Trx过表达虫株构建思路 |
| 5.4.2 Trx过表达质粒p UPRT-T7S4-Trx的构建 |
| 5.4.3 Trx过表达虫株的构建、筛选及鉴定 |
| 5.4.4 Trx过表达虫株入侵速率、增殖速率、转录水平及表达水平分析 |
| 5.4.5 Trx过表达虫株氧化还原指标分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论、创新点及展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文 |
（6）芽孢杆菌降解羽毛角蛋白关键步骤解析及角蛋白酶的高效表达（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 角蛋白概述 |
| 1.1.1 角蛋白来源和分类 |
| 1.1.2 角蛋白的结构特征和理化性质 |
| 1.2 角蛋白酶概述 |
| 1.2.1 角蛋白酶的来源和分类 |
| 1.2.2 角蛋白酶的理化性质 |
| 1.2.3 角蛋白酶的异源表达 |
| 1.2.4 角蛋白酶的分子改造 |
| 1.2.5 角蛋白酶的应用 |
| 1.3 微生物降解角蛋白的关键步骤研究 |
| 1.3.1 微生物降解角蛋白的主要过程 |
| 1.3.2 微生物打开角蛋白二硫键的主要方式 |
| 1.4 立项依据和研究意义 |
| 1.5 本文主要的研究内容 |
| 第二章 共培养角蛋白酶分泌菌株高效降解羽毛 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 菌株 |
| 2.2.2 试剂及仪器 |
| 2.2.3 培养基和培养条件 |
| 2.2.4 羽毛的制备和降解率计算 |
| 2.2.5 角蛋白酶和蛋白酶活性测定方法 |
| 2.2.6 羽毛降解液的抗氧化性分析 |
| 2.2.7 羽毛降解液的氨基酸和多肽分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 角蛋白酶分泌菌株降解羽毛特性表征 |
| 2.3.2 共培养条件优化 |
| 2.3.3 单独培养和共培养降解体系参数分析 |
| 2.3.4 发酵罐(3-L)中共培养角蛋白酶分泌菌株降解羽毛研究 |
| 2.3.5 羽毛水解液营养成分分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 芽孢杆菌降解羽毛关键步骤解析 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 菌株 |
| 3.2.2 试剂及仪器 |
| 3.2.3 培养基和培养条件 |
| 3.2.4 菌株、质粒和引物 |
| 3.2.5 羽毛的制备和降解率计算 |
| 3.2.6 角蛋白酶和蛋白酶活性测定方法 |
| 3.2.7 羽毛降解产物氨基酸和多肽分析 |
| 3.2.8 角蛋白酶纯化方法 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 B.licheniformis BBE11-1降解羽毛角蛋白特性分析 |
| 3.3.2 B.licheniformis BBE11-1胞外酶降解羽毛特性分析 |
| 3.3.3 半胱氨酸代谢和亚硫酸盐转运途径基因缺失对亚硫酸盐代谢能力的影响 |
| 3.3.4 半胱氨酸代谢对细胞耐受性的影响 |
| 3.3.5 突变体降解羽毛特性分析 |
| 3.3.6 枯草芽孢杆菌中半胱氨酸代谢循环介导的羽毛降解机制验证 |
| 3.3.7 亚硫酸盐代谢能力对羽毛降解效率的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 角蛋白酶的异源表达及优化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 试剂及仪器 |
| 4.2.3 培养基和培养条件 |
| 4.2.4 菌株、质粒和引物 |
| 4.2.5 羽毛的制备和降解率计算 |
| 4.2.6 角蛋白酶活性测定方法 |
| 4.2.7 羽毛降解产物氨基酸和多肽分析 |
| 4.2.8 角蛋白酶纯化方法 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 启动子优化提升角蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达 |
| 4.3.2 角蛋白酶酶学性质分析 |
| 4.3.3 半理性设计翻译起始序列提高角蛋白酶表达 |
| 4.3.4 角蛋白酶的发酵培养基优化 |
| 4.3.5 角蛋白酶RBS3在15-L发酵罐中的工艺优化 |
| 4.3.6 角蛋白酶降解羽毛性能验证 |
| 4.3.7 角蛋白酶降解羽毛体系优化和产物分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 半理性设计前导肽提升角蛋白酶催化性能 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 菌株 |
| 5.2.2 试剂及仪器 |
| 5.2.3 培养基和培养条件 |
| 5.2.4 菌株、质粒和引物 |
| 5.2.5 羽毛的制备和降解率计算 |
| 5.2.6 角蛋白酶活性测定方法 |
| 5.2.7 羽毛降解产物氨基酸和多肽分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 前导肽截断对角蛋白酶表达的影响 |
| 5.3.2 替换前导肽切割位点P1对角蛋白酶表达的影响 |
| 5.3.3 基于序列比对的前导肽修饰 |
| 5.3.4 使用三密码子饱和突变(TCSM)筛选前导肽的组合突变体 |
| 5.3.5 2-D12和P1的组合突变 |
| 5.3.6 角蛋白酶工业化生产培养基优化 |
| 5.3.7 15-L发酵罐中突变体2-D12的发酵性能研究 |
| 5.3.8 用2-D12水解羽毛废物 |
| 5.3.9 羽毛水解物在植物栽培中的应用 |
| 5.4 本章小结 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 :作者在攻读博士学位期间发表的论文 |
（7）转录因子CmtR调控牛分枝杆菌抗氧化适应的信号通路和分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 结核病及其病原菌概述 |
| 1.1.1 结核分枝杆菌 |
| 1.1.2 结核病 |
| 1.1.3 病原感染与宿主巨噬细胞免疫 |
| 1.1.4 ROS在巨噬细胞抗结核分枝杆菌过程中的作用 |
| 1.2 ROS与氧化压力 |
| 1.2.1 ROS种类与来源 |
| 1.2.2 ROS的作用与氧化压力的危害 |
| 1.3 感应ROS的转录因子及其调控机制 |
| 1.3.1 OxyR |
| 1.3.2 Sox R与 Per R |
| 1.3.3 OhrR |
| 1.3.4 其它蛋白 |
| 1.4 细菌抗氧化的机制 |
| 1.4.1 非酶促的抗氧化剂 |
| 1.4.2 抗氧化酶类 |
| 1.4.3 类组蛋白 |
| 1.4.4 金属稳态 |
| 1.5 分枝杆菌抗氧化的研究进展 |
| 1.5.1 感应ROS的转录因子及其调控机制 |
| 1.5.2 抗氧化的机制 |
| 1.6 Zn~(2+)以及ESX-3在结核分枝杆菌中的研究进展 |
| 1.6.1 Zn~(2+)的作用与危害 |
| 1.6.2 Zn~(2+)稳态与ESX-3 |
| 1.6.3 ESX-3在宿主免疫中的作用 |
| 1.7 CmtR在结核分枝杆菌中的研究进展 |
| 1.8 本研究的目的、意义和思路 |
| 1.8.1 本研究的目的与意义 |
| 1.8.2 本研究的思路 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.0 菌株和质粒 |
| 2.1.1 引物、酶、试剂盒 |
| 2.1.2 培养基的配制 |
| 2.1.3 抗生素的配制 |
| 2.1.4 分子克隆相关试剂的配制 |
| 2.1.5 染色质免疫共沉淀(ChIP)实验试剂的配制 |
| 2.1.6 β-半乳糖甘酶活性检测实验试剂的配制 |
| 2.1.7 细菌双杂交(B2H)实验相关试剂的配制 |
| 2.1.8 细胞实验相关培养基以及冻存液的配制 |
| 2.1.9 小鼠 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 目的基因的克隆 |
| 2.2.2 重组蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.3 凝胶阻滞实验(EMSA) |
| 2.2.4 免疫共沉淀实验(ChIP) |
| 2.2.5 β-半乳糖苷酶活性实验 |
| 2.2.6 细菌菌体内金属含量的测定 |
| 2.2.7 实时定量PCR(RT-q PCR) |
| 2.2.8 重组菌株的构建 |
| 2.2.9 生长曲线以及H2O2耐受实验的测定 |
| 2.2.10 细菌转录组测序 |
| 2.2.11 细菌双杂交(B2H) |
| 2.2.12 表面等离子共振(SPR) |
| 2.2.13 细胞的培养与冻存 |
| 2.2.14 细胞感染 |
| 2.2.15 酸性溶酶体的检测 |
| 2.2.16 细菌毒性的检测 |
| 2.2.17 ROS检测 |
| 2.2.18 小鼠感染模型 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 Cmt R增强BCG的抗氧化能力而Cmt R(C24S)失去这种能力 |
| 3.1.1 Cmt R有利于BCG的抗氧化生长 |
| 3.1.2 CmtR能够感应氧化信号 |
| 3.1.3 Cys24是Cmt R响应H_2O_2信号的关键氨基酸 |
| 3.2 Cmt R通过Cmt R-Esx3-Zn~(2+)信号通路调控BCG的抗氧化生长 |
| 3.2.1 Cmt R正调控esx-3 操纵子的表达 |
| 3.2.2 H_2O_2诱导esx-3 操纵子基因的表达依赖于Cmt R |
| 3.2.3 Cmt R通过与Zur相互作用调控esx-3 操纵子的表达 |
| 3.2.4 Esx H促进Zn~(2+)的吸收进而增强BCG的抗氧化生长能力 |
| 3.2.5 Cmt R增强BCG的抗氧化生长能力依赖于Esx H |
| 3.2.6 Cmt R调控Zn~(2+)的吸收从而增强BCG的抗氧化生长能力 |
| 3.3 Cmt R有利于BCG在小鼠以及巨噬细胞内存活 |
| 3.3.1 Cmt R有利于BCG抑制巨噬细胞吞噬体的成熟和ROS的产生 |
| 3.3.2 Cmt R有利于BCG在巨噬细胞以及小鼠内存活 |
| 4 总结与讨论 |
| 4.1 总结 |
| 4.2 讨论 |
| 4.2.1 筛选感应氧化还原信号转录因子的方法 |
| 4.2.2 Cys24是CmtR感应H_2O_2的关键氨基酸 |
| 4.2.3 Cmt R负调控自身操纵子的表达而正调控esx-3 操纵子的表达 |
| 4.2.4 Esx G有利于BCG的抗氧化生长 |
| 4.2.5 外源Zn~(2+)增强BCG的抗氧化生长 |
| 4.2.6 Cmt R有利于BCG在巨噬细胞内存活 |
| 5 展望 |
| 5.1 在氧化压力下,结核分枝杆菌和宿主细胞“博弈”的机制 |
| 5.2 Zn~(2+)操纵结核分枝杆菌胞内稳态的机制 |
| 5.3 靶向CmtR抗结核药物的研发 |
| 参考文献 |
| 论文发表情况 |
| 致谢 |
（8）桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 干旱对植物生长的影响 |
| 1.2 植物抗旱性的研究进展 |
| 1.2.1 植物的抗旱性与旱后复水恢复生长的调节机制 |
| 1.2.2 植物的抗旱性评价体系及提高植物抗逆性的需求和措施 |
| 1.3 植物非生物胁迫下的氧化还原调节系统 |
| 1.3.1 非生物胁迫对植物氧化还原系统的影响 |
| 1.3.2 非生物胁迫下植物细胞中ROS的产生和代谢 |
| 1.4 植物硫氧还蛋白家族(Trxs)及其广泛作用 |
| 1.4.1 Trxs功能概况 |
| 1.4.2 叶绿体中的Trxs系统 |
| 1.4.3 叶绿体中一种类硫氧还蛋白-CDSP32 |
| 1.5 植物胞质抗坏血酸过氧化物酶(APX)研究进展 |
| 1.6 植物生长素氨基酸水解酶家族(ILR-like)研究进展 |
| 1.7 参与植物抗逆性几种胁迫应答因子的研究进展 |
| 1.7.1 脯氨酸参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.2 甜菜碱参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.3 可溶性糖类参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.4 脱落酸(ABA)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.7.5 超氧化物歧化酶(SOD)参与抗逆性的研究进展 |
| 1.8 桑树抗逆性及资源应用研究进展 |
| 1.8.1 古老的桑树物种及其生存能力 |
| 1.8.2 桑树资源应用发展现状 |
| 1.8.3 桑树抗旱性分子机制研究进展 |
| 1.9 本研究前期工作基础和技术依据 |
| 1.9.1 前期工作基础 |
| 1.9.2 技术流程 |
| 第二章 桑树中MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 基因克隆和序列分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 试验材料 |
| 2.2.1 植物材料 |
| 2.2.2 主要仪器设备 |
| 2.2.3 主要试剂及菌株 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 桑树叶片总RNA提取与鉴定 |
| 2.3.2 桑树叶片cDNA合成 |
| 2.3.3 基因克隆 |
| 2.3.4 序列的生物信息学分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 桑树中三个基因编码区克隆及测序 |
| 2.4.2 核酸和氨基酸序列的生物信息学分析 |
| 2.4.3 编码蛋白的系统发育树分析 |
| 2.4.4 GO(Gene ontology)数据库预测目标基因功能 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的表达模式分析及多克隆抗体制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 植物材料与胁迫处理 |
| 3.2.2 主要试剂耗材及仪器 |
| 3.3 试验方法 |
| 3.3.1 总RNA提取和反转录cDNA |
| 3.3.2 基因定量引物设计 |
| 3.3.3 实时荧光定量qRT-PCR |
| 3.3.4 叶片含水量测定 |
| 3.3.5 脯氨酸含量测定 |
| 3.3.6 原核表达载体的构建 |
| 3.3.7 多克隆抗体制备 |
| 3.3.8 多克隆抗体效价检测 |
| 3.3.9 数据统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 基因在桑树地上部分组织的表达规律 |
| 3.4.2 基因在不同桑树品种中的表达规律 |
| 3.4.3 基因在桑树中的生物钟节律表达规律 |
| 3.4.4 盐胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.5 高温胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.6 水分胁迫对基因表达水平的影响 |
| 3.4.7 施加外源ABA对基因表达水平的影响 |
| 3.4.8 施加外源乙烯利对基因表达水平的影响 |
| 3.4.9 施加外源水杨酸对基因表达水平的影响 |
| 3.4.10 氨基酸序列的抗原性分析 |
| 3.4.11 基因表达与蛋白纯化 |
| 3.4.12 多克隆抗体效价检测 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 MaCDSP32、MaILR1和MaAPX2 的瞬时表达分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 试验材料 |
| 4.3 试验方法 |
| 4.3.1 植物表达载体构建 |
| 4.3.2 重组质粒转化农杆菌 |
| 4.3.3 基因瞬时转化桑叶的处理方式 |
| 4.3.4 qRT-PCR检测基因表达量 |
| 4.3.5 叶片中H_2O_2和O_2~-的含量测定 |
| 4.3.6 转化烟草的亚细胞定位分析 |
| 4.3.7 数据统计分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 基因瞬时转化浸染后离体桑叶的状态 |
| 4.4.2 基因产物的亚细胞定位 |
| 4.4.3 瞬时表达MaCDSP32 基因对离体桑叶持水能力的影响 |
| 4.4.4 MaCDSP32 瞬时表达离体桑叶的自然失水情况 |
| 4.4.5 NaCl胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.6 PEG胁迫下离体桑叶气孔开度的变化 |
| 4.4.7 PEG处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.8 NaCl处理下胁迫相关基因表达量的变化 |
| 4.4.9 基因产物的亚细胞定位确认 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 桑树MaCDSP32 转化烟草的功能研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 试验材料 |
| 5.2.1 植物材料和生长条件 |
| 5.2.2 主要试剂和耗材 |
| 5.2.3 主要仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 叶盘法转化烟草及转基因烟草鉴定 |
| 5.3.2 MaCDSP32 表达产物亚细胞定位 |
| 5.3.3 转基因烟草非生物胁迫处理 |
| 5.3.4 转基因烟草种子萌发和幼苗生长处理 |
| 5.3.5 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱含量测定 |
| 5.3.6 叶片中ROS的组织定位和含量测定 |
| 5.3.7 SOD、APX、POD和 CAT抗氧化酶活性测定 |
| 5.3.8 光合作用气体交换参数测定 |
| 5.3.9 叶绿色素含量测定 |
| 5.3.10 数据统计分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 CDSP32序列在桑树和烟草中的同源性比对 |
| 5.4.2 阳性转基因烟草PCR鉴定 |
| 5.4.3 MaCDSP32 表达产物的亚细胞定位 |
| 5.4.4 MaCDSP32 对转基因烟草抗逆性的影响 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 桑树MaCDSP32 转化拟南芥的功能研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 试验材料 |
| 6.2.1 植物材料和生长条件 |
| 6.2.2 主要试剂和耗材 |
| 6.2.3 主要仪器 |
| 6.3 试验方法 |
| 6.3.1 构建MaCDSP32 过表达拟南芥植株 |
| 6.3.2 突变体拟南芥T-DNA插入鉴定 |
| 6.3.3 转基因拟南芥种子胁迫处理 |
| 6.3.4 转基因拟南芥植株非生物胁迫处理 |
| 6.3.5 生理生化指标测定 |
| 6.3.6 拟南芥叶片气孔开度测量 |
| 6.3.7 数据统计分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 MaCDSP32和AtCDSP32 序列同源性分析 |
| 6.4.2 AtCDSP32 突变体拟南芥植株鉴定 |
| 6.4.3 转基因拟南芥株系在非生物胁迫下的抗逆性分析 |
| 6.4.4 干旱胁迫对转基因拟南芥气孔开度的影响 |
| 6.4.5 非生物胁迫对转基因拟南芥抗氧化物酶活性的影响 |
| 6.4.6 非生物胁迫对拟南芥抗氧化物酶编码基因表达量的影响 |
| 6.4.7 渗透胁迫对拟南芥种子萌发及幼苗生长的影响 |
| 6.4.8 MaCDSP32 过表达拟南芥植株的早花现象 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 MaCDSP32 转基因烟草干旱胁迫转录组数据分析 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 试验材料 |
| 7.2.1 植物材料 |
| 7.2.2 胁迫处理方式及取样 |
| 7.3 试验方法 |
| 7.3.1 样品转录组文库构建 |
| 7.3.2 上机测序 |
| 7.3.3 信息分析流程 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 OE和WT烟草干旱样品转录组数据总体分析 |
| 7.4.2 OE和WT烟草干旱转录组样品差异表达基因分析 |
| 7.4.3 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因维恩图 |
| 7.4.4 OE和WT烟草干旱转录组差异表达基因聚类热图 |
| 7.4.5 OE和WT烟草干旱差异表达基因GO富集分析 |
| 7.4.6 OE和WT烟草复水差异表达基因KEGG通路分析 |
| 7.4.7 半胱氨酸和甲硫氨酸代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.8 淀粉和糖代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.9 油菜素类固醇代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.10 植物激素信号传导代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.11 光合元件固碳作用代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.4.12 硫代谢途径差异基因KEGG通路分析 |
| 7.5 干旱和复水相反生理参数涉及差异表达基因GO富集分析 |
| 7.6 小结 |
| 第八章 结论 |
| 8.1 本研究总结 |
| 8.2 本研究创新点 |
| 8.3 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）单增李斯特菌谷氧还蛋白介导的抗氧化应激及感染机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述 |
| 1 单增李斯特菌概述 |
| 2 细菌抗氧化应激修复 |
| 2.1 细菌蛋白质二硫键的形成和硫氧还蛋白系统 |
| 2.2 细菌谷氧还蛋白系统 |
| 2.3 细胞色素氧化酶和丙酮酸氧化酶 |
| 3 单增李斯特菌毒力调控 |
| 3.1 单增李斯特菌感染机制 |
| 3.2 单增李斯特菌OpuC转运系统 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第一章 单增李斯特菌谷氧还蛋白酶学功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试剂订购与配制 |
| 1.3 菌株及培养条件 |
| 1.4 E.coli感受态细胞制备 |
| 1.5 EGD-e基因组DNA提取 |
| 1.6 目的片段切胶回收及PCR产物纯化 |
| 1.7 Grx重组蛋白原核表达载体构建 |
| 1.8 重组质粒抽提及热转化 |
| 1.9 生物信息学分析 |
| 1.10 Grx关键氨基酸突变蛋白原核表达载体构建 |
| 1.11 Grx及其突变重组蛋白原核表达与纯化 |
| 1.12 体外Grx蛋白氧化还原酶活性分析 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 Grx氨基酸序列生物信息学分析 |
| 2.2 完成Grx及其关键氨基酸突变重组蛋白表达与纯化 |
| 2.3 单增李斯特菌Grx具有氧化还原酶活性 |
| 3 讨论 |
| 第二章 单增李斯特菌谷氧还蛋白抗氧化应激功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试剂订购与配制 |
| 1.3 菌株及培养条件 |
| 1.4 单增李斯特菌感受态细胞制备 |
| 1.5 单增李斯特菌基因敲除原理 |
| 1.6 单增李斯特菌EGD-e grx缺失株及回补株构建 |
| 1.7 单增李斯特菌grx突变株体外生长分裂能力分析 |
| 1.8 单增李斯特菌grx突变株菌落及菌体表型分析 |
| 1.9 细菌体外不同氧化剂应激试验 |
| 1.10 肼应激条件下细菌全基因转录组测序 |
| 1.11 实时荧光定量PCR验证转录组数据 |
| 1.12 绿色荧光蛋白(GFP)重组报告质粒构建 |
| 1.13 绿色荧光的定性与定量检测 |
| 1.14 凝胶迁移试验 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 完成单增李斯特菌EGD-e grx缺失株及回补株构建 |
| 2.2 单增李斯特菌缺失Grx后不影响细菌体外生长分裂能力 |
| 2.3 单增李斯特菌缺失Grx后细菌菌体变小但不影响鞭毛形成 |
| 2.4 单增李斯特菌缺失Grx后抗氧化能力增强 |
| 2.5 细菌全基因转录组测序结果分析 |
| 2.6 实时荧光定量PCR结果验证转录组数据 |
| 2.7 完成绿色荧光蛋白(GFP)重组荧光报告系统构建 |
| 2.8 绿色荧光释放量验证转录组数据 |
| 2.9 Grx间接调控氧化应激和毒力相关基因 |
| 3 讨论 |
| 第三章 单增李斯特菌谷氧还蛋白介导细菌感染功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验仪器 |
| 1.2 试剂订购与配制 |
| 1.3 菌株、细胞及培养条件 |
| 1.4 巨噬细胞J774A.1增殖试验 |
| 1.5 小肠上皮细胞Caco-2黏附、侵袭试验 |
| 1.6 荧光显微镜观察胞内细菌量 |
| 1.7 成纤维细胞L929空斑试验 |
| 1.8 小鼠模型脏器增殖试验 |
| 1.9 毒力因子内化素B(InlB)蛋白表达水平检测 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 单增李斯特菌缺失Grx后胞内增殖能力显着增强 |
| 2.2 单增李斯特菌缺失Grx后黏附、侵袭能力显着增强 |
| 2.3 单增李斯特菌缺失Grx后不影响细胞间迁移能力 |
| 2.4 单增李斯特菌缺失Grx后小鼠脏器内增殖能力显着增强 |
| 2.5 单增李斯特菌缺失Grx后 Inl B蛋白表达水平显着上调 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 中英文对照表 |
| 附录Ⅱ 引物 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（10）番茄硫氧还蛋白（SlTrxh）参与NO缓解硝酸盐胁迫的机理分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 土壤次生盐渍化 |
| 1.1.1 设施土壤次生盐渍化的成因 |
| 1.1.2 土壤次生盐渍化基本特征 |
| 1.1.3 盐胁迫对植物的影响及植物的响应 |
| 1.1.3.1 盐胁迫对植物的影响 |
| 1.1.3.2 植物对盐胁迫的响应 |
| 1.2 NO在植物逆境生理中的作用 |
| 1.2.1 植物中的NO |
| 1.2.2 NO对靶蛋白进行S-亚硝基化修饰 |
| 1.2.3 蛋白S-亚硝基化 |
| 1.2.4 蛋白去亚硝基化 |
| 1.3 Trx相关研究 |
| 1.3.1 结构、分类和分布 |
| 1.3.2 Trx系统 |
| 1.3.3 NADPH依赖性硫氧还蛋白还原酶(NTR) |
| 1.3.4 硫氧还蛋白的功能及研究进展 |
| 1.4 本研究目的和意义 |
| 第二章 硝酸盐胁迫下外源施加NO对番茄Trx系统关键基因的影响 |
| 2.1 材料与处理 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验材料处理 |
| 2.2 测定项目与方法 |
| 2.2.1 植物总RNA提取 |
| 2.2.2 RNA反转成cDNA |
| 2.2.3 实时荧光定量PCR |
| 2.2.4 ROS和NO荧光探针标记 |
| 2.2.5 抗氧化物酶活性和MDA含量的测定 |
| 2.2.6 生物素转换法分析S-亚硝基化蛋白 |
| 2.2.7 Western blot |
| 2.2.8 数据处理与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 外源施加SNP对硝酸盐胁迫下番茄幼苗的形态指标的影响 |
| 2.3.2 外源施加SNP对硝酸盐胁迫下番茄幼苗根系的ROS含量的影响 |
| 2.3.3 外源施加SNP对硝酸盐胁迫下番茄幼苗的NO含量的影响 |
| 2.3.4 外源施加SNP对硝酸盐胁迫下番茄幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影响 |
| 2.3.5 外源施加SNP对硝酸盐胁迫下番茄幼苗Trx系统基因表达量的影响 |
| 2.3.6 硝酸盐胁迫下外源施加SNP对番茄幼苗S-亚硝基化蛋白的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 番茄SlTrxh、SlTpx和 SlNTRB的原核表达、蛋白纯化及活性分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.2 测定指标及方法 |
| 3.2.1 SlTrxh、SlNTRB、SlTpx的克隆 |
| 3.2.2 DNA片段回收 |
| 3.2.3 连接表达载体 |
| 3.2.4 SlTrxh、SlNTRB、SlTpx重组蛋白诱导表达 |
| 3.2.5 蛋白纯化 |
| 3.2.6 蛋白抗体的制备 |
| 3.2.7 蛋白质S-亚硝基化位点的预测 |
| 3.2.8 定点突变分析 |
| 3.2.9 去硝基化分析 |
| 3.2.10 胰岛素还原测定 |
| 3.2.11 生物素转换技术分析S-亚硝基化蛋白 |
| 3.2.12 Western blot |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 SlTrxh、SlNTRB、SlTpx重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.2 SlTrxh可能的半胱氨酸S-亚硝化位点进行分析 |
| 3.3.3 pDE1-SlTrxC54S重组蛋白的表达与纯化 |
| 3.3.4 pDE1-SlTrxh、pDE1-SlTrxC54S重组蛋白的胰岛素还原活性分析 |
| 3.3.5 SlTrxh/ SlNTRB重组蛋白具有去亚硝基化酶活性 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 硝酸盐胁迫下SlTrxh、SlNTRB和 SlTpx转基因烟草的获得及SlTrxh的功能分析 |
| 4.1 材料与处理 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验材料处理 |
| 4.1.2.1 烟草发芽实验 |
| 4.1.2.2 烟草的生长条件及耐性分析 |
| 4.2 测定项目与方法 |
| 4.2.1 SlTrxh、SlNTRB、SlTpx、SlGSNOR的克隆 |
| 4.2.2 DNA片段回收 |
| 4.2.3 表达载体的酶切及回收 |
| 4.2.4 连接表达载体 |
| 4.2.5 农杆菌介导法转化烟草 |
| 4.2.6 基因组DNA的提取 |
| 4.2.7 农杆菌侵染烟草叶片表皮细胞亚细胞实验 |
| 4.2.8 O_2~-和H_2O_2的组织化学染色 |
| 4.2.9 H_2O_2含量及硫氧还蛋白系统相关酶活性的测定 |
| 4.2.10 酵母双杂交实验 |
| 4.2.11 Pull-down实验 |
| 4.2.12 免疫共沉淀(Co-IP)实验 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 pRI101-SlTrxh、pRI101-SlNTRB、pRI101-SlTpx植物表达载体的构建 |
| 4.3.2 转基因烟草鉴定 |
| 4.3.2.1 SlTrxh转基因烟草的鉴定 |
| 4.3.2.2 SlNTRB转基因烟草的鉴定 |
| 4.3.2.3 SlTpx转基因烟草的鉴定 |
| 4.3.3 SlTrxh的亚细胞定位 |
| 4.3.4 SlTrxh过表达烟草对硝酸盐胁迫的抗性分析 |
| 4.3.5 SlTrxh的过表达对烟草幼苗中ASA/DHA和 GSH/GSSG比值的影响 |
| 4.3.6 SlTrxh的过表达对烟草幼苗中MDA和 H_2O_2 含量的影响 |
| 4.3.7 SlTrxh的过表达对烟草幼苗中NTR活性的影响 |
| 4.3.8 SlTrxh的过表达烟草对氧化胁迫的耐受性增强 |
| 4.3.9 SlTrxh与 SlGSNOR的相互作用分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 附表 1 相关引物序列 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 A 攻读硕士期间发表的论文 |
四、硫氧还蛋白还原酶缺陷的大肠杆菌宿主促进含半胱氨酸残基的重组蛋白可溶性表达（论文参考文献）
- [1]家蝇硫氧还蛋白2单克隆抗体的制备及抗氧化研究[D]. 井金苗. 河北大学, 2021(09)
- [2]弓形虫抗氧化损伤基因的筛选及功能研究[D]. 陈芸. 中国农业科学院, 2021(01)
- [3]富含二硫键的多肽制备[D]. 郭亲梦. 上海师范大学, 2021(07)
- [4]番茄SlPrx应答低氮胁迫的机理分析[D]. 王曼琦. 昆明理工大学, 2021(01)
- [5]弓形虫硫氧还蛋白的生物学特性及功能研究[D]. 王大为. 沈阳农业大学, 2020
- [6]芽孢杆菌降解羽毛角蛋白关键步骤解析及角蛋白酶的高效表达[D]. 彭政. 江南大学, 2020(04)
- [7]转录因子CmtR调控牛分枝杆菌抗氧化适应的信号通路和分子机制研究[D]. 李肖辉. 华中农业大学, 2020(05)
- [8]桑树（Morus alba）三个干旱诱导基因的表达规律及MaCDSP32基因的功能分析[D]. 孙红梅. 西北农林科技大学, 2020
- [9]单增李斯特菌谷氧还蛋白介导的抗氧化应激及感染机制研究[D]. 杭奕. 浙江农林大学, 2020(02)
- [10]番茄硫氧还蛋白（SlTrxh）参与NO缓解硝酸盐胁迫的机理分析[D]. 齐琪. 昆明理工大学, 2020(05)