一、利什曼原虫核酸疫苗的研究现状（论文文献综述）
王宁,赵鹏鹏,张艳艳,马勋,王正荣,薄新文[1]（2021）在《寄生虫DNA疫苗研究进展》文中研究指明寄生虫病带来了相当大的社会经济影响,人畜共患寄生虫给人们带来巨大的疾病负担,并给养殖业造成严重的经济损失。因此,寄生虫病的防治是人们迫切需要研究的课题。寄生虫存在很多形式的免疫逃避机制,灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗等未达到理想的预防寄生虫病的效果,很多研究表明DNA疫苗有望成为预防和治疗寄生虫病的有效方法。DNA疫苗是一种新型疫苗,可同时诱导机体产生持久的体液免疫和细胞免疫,通过在宿主内表达外源蛋白来提供保护性免疫。DNA疫苗与其他亚单位疫苗不同的是,免疫原由摄取抗原编码DNA的细胞在宿主内合成。体内蛋白质的合成也能进行抗原加工、修饰并递呈到宿主的免疫系统中,类似于自然感染的方式。笔者就DNA疫苗免疫机制、设计原则、免疫途径、优缺点及近几年寄生虫DNA疫苗的研究进展进行综述,以期为寄生虫DNA疫苗的开发提供理论参考。
陈劲宇,王玉洁,李焕卿,陈达丽[2]（2020）在《婴儿利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧基酶优势表位基因的分子克隆与表达》文中认为目的基于前期分析并选取的婴儿利什曼原虫PEPCK的优势表位基因,构建相应重组原核表达载体以获得重组蛋白,构建相应重组真核表达载体并验证真核载体在NIH3T3细胞中的表达,为后续动物的免疫和感染实验备下基础。方法根据PEPCK优势表位基因序列,经PCR反应及酶切连接构建重组原核与真核表达质粒pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK并分别转染至E. coli和NIH3T3细胞中进行表达。采用SDS-PAGE电泳和Western Blot鉴定原核重组质粒在大肠杆菌中的表达和原核表达蛋白被镍柱纯化后的情况,采用免疫荧光实验验证真核重组质粒在细胞中的表达。结果重组原核与真核载体的正确测序结果表明重组载体构建成功。SDS-PAGE电泳和Western Blot的结果显示,大肠杆菌中表达的原核重组蛋白以及纯化后的蛋白在48.08 kD处存在条带,转染了真核重组载体的NIH3T3细胞的免疫荧光结果呈阳性。结论成功构建了PEPCK优势表位基因的重组原核和真核表达载体:pET32a-PEPCK和pVAX1-EPEPCK,成功表达相应的重组蛋白并纯化并验证了pVAX1-EPEPCK在NIH3T3细胞中的表达,为后续DNA疫苗初次免疫和蛋白疫苗加强免疫的动物实验备下基础。
李文桂,陈雅棠[3]（2019）在《微生物介导的利什曼原虫KMP11疫苗的研制现状》文中指出利什曼原虫引起的利什曼病是一种严重危害人类健康的寄生虫病,采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域之一。动基体膜蛋白11（KMP11）抗原是一种有效的疫苗候选分子,本文综述了牛痘病毒、疱疹性口炎病毒、腺病毒血清型5、刚地弓形虫和蜥蜴利什曼原虫等微生物介导的利什曼原虫KMP11疫苗的研制现状。
黄凌远[4]（2014）在《减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究》文中研究说明罗非鱼是我国重要的淡水养殖鱼类。近年来,罗非鱼无乳链球菌病的暴发给罗非鱼养殖业造成了巨大的损失。本课题,以2009年,在海南暴发的罗非鱼无乳链球菌病为背景开展了针对该病的口服核酸疫苗的研究。我们将编码Sip蛋白的sip基因克隆至真核表达载体pVAX1,构建了重组质粒pVAX1-sip,并将该重组质粒电转化到减毒沙门氏菌SL7207,成功构建了以减毒沙门氏菌为载体的口服核酸疫苗。评价了疫苗的安全性、稳定性、在罗非鱼的组织分布以及口服免疫效果。具体内容包括：1.罗非鱼无乳链球菌sip基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达以罗非鱼源无乳链球菌的强毒力株（JF423941）的DNA为模板,PCR扩增了sip基因,并T-克隆,质粒测序分析,sip基因长度为1002bp,编码333个氨基酸（KJ398146.1）。在T-克隆重组质粒的基础上,以pVAX1为载体,成功构建了真核表达重组质粒。通过脂质体转染,重组质粒成功转染EPC细胞,利用间接免疫荧光法和蛋白免疫印迹法,证明了Sip蛋白在EPC细胞内的表达和表达蛋白免疫原性。2.重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性鉴定本章采用电转化技术,成功将核酸疫苗质粒导入了减毒沙门氏菌SL7207。对构建的重组减毒沙门氏菌进行了生物学特性分析,结果表明将外源基因导入减毒沙门氏菌载体菌株后,重组减毒沙门氏菌的生长特性未发生明显变化,与原始株趋于一致。在体外,在含抗生素培养环境下SL7207-pVAX1和SL7207-pVAX1-sip两株重组菌的质粒比较稳定,传代50代后,质粒稳定性仍然在90%以上；在不含抗生素培养环境下,重组沙门氏菌中的质粒稳定性有所下降,随着传代数的增加,可能存在质粒的丢失,但在35代内,稳定性仍然能够在80%以上,显示了较好的稳定性。体内稳定性试验表明减毒沙门氏菌能够稳定携带外源基因有效侵染到罗非鱼的各组织器官,为核酸疫苗发挥效果提供了前提保障,同时重组菌在免疫接种后28d,能够完全从机体消除,也表明了该重组菌具有较好的生物安全性。本章还考察了烘干和储存温度对口服免疫饲料中重组菌的影响,结果提示低温烘干和低温储存可以降低重组菌的损失率,同时建议口服免疫饲料尽量现配现用,以保证最佳免疫效果。3.核酸疫苗的安全性研究本章将不同浓度的重组菌核酸疫苗SL7207-PVAX1-sip灌胃接种罗非鱼,统计死亡率,得该重组菌对罗非鱼的半数致死量（LD50）为1.7×1011cfu/尾,该LD50值极高,表明对罗非鱼的毒力极弱。以灌胃途径免疫接种,在不高于1.25×1010cfu/尾灌服剂量范围内,罗非鱼不会出现死亡等异常症状,相对安全。以109cfu/mL,0.5mL/尾,灌胃接种罗非鱼,整个试验期间罗非鱼未发生死亡等异常,组织病理学观察表明,对照组和免疫组的各个组织脏器均相对正常,该剂量下免疫接种不会对罗非鱼造成病理损伤,是安全的。基因整合试验表明,在检测敏感度为102拷贝数下,重组质粒不会与罗非鱼发生染色体整合。综上,通过重组菌毒力试验,重组菌对罗非鱼的病理损伤评价和外源基因与宿主基因整合性三方面考察,均证实该疫苗对罗非鱼是安全的。4.核酸质粒在罗非鱼体内的组织分布及阳性表达本章对核酸质粒和表达的Sip蛋白进行了组织分布考察,结果表明,通过PCR检测,证明核酸质粒可分布于罗非鱼的肠道、肝脏、脾脏和肾脏；利用免疫组化方法,检测到表达的蛋白可分布于脾脏和肝脏。核酸质粒或表达的蛋白在组织内存留的时间与免疫接种次数呈正相关。试验结果表明,减毒沙门氏菌能够作为核酸疫苗的运载体,将sip基因携带并转移到靶组织,同时核酸疫苗质粒能够在罗非鱼体内进行有效的表达,为后期免疫试验奠定了基础。5.重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果考察罗非鱼经灌胃和投喂免疫饲料两种途径,分不同免疫次数进行免疫接种。考察了免疫后罗非鱼的血清总蛋白含量、血清总超氧化物歧化酶SOD含量、血清溶菌酶活性、血清补体C3含量、血清抗菌活性这些非特异性免疫指标以及体液免疫指标抗体效价和细胞免疫指标IL-1β、TNF-α细胞因子转录水平。综合评估了本课题研究的核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果。结果表明,灌胃和投喂免疫饲料两种免疫方式,均能够有效的诱导免疫应答反应。使罗非鱼获得抗无乳链球菌感染的能力。灌胃组最高免疫保护率为57%,拌料组最高免疫保护率可达63%。基于前期的安全性研究结果,最终推荐免疫程序为：108cfu/g拌料免疫接种,进行三个免疫程序,每次间隔7d,每次连续口服7d,每次每尾按鱼体重1%投喂免疫饲料。
禹海杰[5]（2013）在《弓形虫疫苗候选抗原IMP1生物学特性及其免疫原性研究》文中指出弓形虫是一种专性细胞内寄生繁殖的机会性致病病原体,可以感染包括人在内的几乎所有的温血动物,严重威胁人类及动物健康。正常人感染弓形虫后,大多数不表现出明显的临床症状,呈隐性感染状态,但对婴儿或机体免疫力低下或免疫抑制时（AIDS、骨髓移植、器官移植等）可表现出严重的临床症状,甚至可以引起死亡。妊娠期母畜感染该病,常可引起流产,死产,木乃伊胎以及其它一些严重的临床症状,造成严重的经济损失。目前,对于弓形虫病的防治仍以预防为主,无特效药物。因此,研发切实有效的疫苗是防治的关键。IMP1蛋白是2011年刚发现的蛋白,被认为在弓形虫病疫苗开发方面具有重要潜力。本研究通过分子生物学、基因工程学、免疫生物学等方法对弓形虫IMP1的表达特性及免疫原性进行研究,探讨IMP1及其相关蛋白的功能,为弓形虫病防控提供新的思路与方法。1.浙江省动物弓形虫病血清流行病学调查为了解浙江省动物弓形虫病的流行现状,更好地为弓形虫病的防治提供科学的依据,本项目组成员采集了来自浙江省十一地市的813份猪血清、70份奶牛血清、151份山羊血清、213份犬血清及60份猫血清样品,进行了弓形虫病的血清流行病学调查。结果表明,猪的感染率最高,平均血清阳性率高达53.4%,其次为犬16.0%,猫13.3%及山羊2.7%。在对70份奶牛的血清进行检测时,未有阳性样品检出。对采样背景较为详细的猪、犬、猫样品的试验数据进行统计学分析,结果显示,该病的血清阳性率随动物的年龄增长而显着性升高。弓形虫血清阳性率与饲养环境、动物品种等相关。本试验首次对浙江省猪、奶牛、山羊、犬、猫弓形虫血清阳性率进行较为详细的调查,调查结果显示浙江省动物特别是猪的弓形虫感染较为严重,鉴于目前尚无有效的疫苗用于该病的治疗,因此制定合理的方案控制该病的传播在浙江省动物弓形虫的防控方面具有重要意义。2.基于SAG1基因弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立荧光定量PCR因其高效敏感的特性在各种病原的检测中得到广泛应用,然而其检测效果与所选择的目的基因密切相关。本研究根据GenBank上公布的弓形虫RH株SAG1（又称P30）基因（X14080）保守区域序列设计特异性引物,采用SYBR（?） green I荧光染料法建立弓形虫的荧光定量PCR检测体系。与传统的PCR方法相比,该方法表现出更高的敏感性,最低可以检测到一个弓形虫速殖子。对人工感染小鼠的不同组织进行检测,1天后各样品即可被检出（血液25%、脾脏50%、肺脏50%）。本方法特异性好,与新孢子虫、大肠杆菌、牛巴贝斯虫、布氏锥虫、隐孢子虫、犬弓首蛔虫DNA均无交叉反应。用建立的方法对临床181份猪血进行检测,有11份样品检测结果为阳性,比普通PCR的9份表现出更高的敏感性。研究结果表明,基于SAG1基因建立了一种可靠的弓形虫SYBR（?） green I荧光定量PCR检测方法,该方法的建立可为弓形虫病理学、免疫学及治疗方面的研究提供重要的技术支持。3.弓形虫IMP1的表达特性研究弓形虫IMP1是一个新发现的蛋白,在鸡球虫、犬新孢子虫中都有高度保守的同源序列,本研究通过基因克隆技术用弓形虫RH株为模板成功获得了弓形虫IMP1序列,将所扩增基因与GenBank上公布的弓形虫ME49株（XM002370108;2e-36）的序列进行相似性分析比较,分别在114（A-G）与342（T-C）处各有一个突变,序列相似性为99.8%,但对编码氨基酸无影响。对所获得的序列进行原核表达、纯化,制备了兔源多克隆抗体。通过间接免疫荧光技术进一步对速殖子不同时期该蛋白的表达特性进行研究。研究结果发现在游离、吸附于细胞表面、入侵中、入侵后及纳虫空泡中的速殖子IMP1均有表达,均被定位于虫体表面,且在有些虫体的顶端表达更为强烈。该研究为进一步阐明IMP1的功能奠定了基础。4.弓形虫二价重组亚单位疫苗rSAG1-IMP1的免疫原性研究利用分子生物学技术分别构建BL21-pET30a-IMP1及BL21-pET30a-SAG1-IMP1原核表达系统,IPTG诱导重组蛋白的表达。用纯化后的重组蛋白免疫ICR小鼠,探讨弓形虫重组蛋白γSAG1-IMP1的免疫效果。按照每只小鼠100μg融合蛋白的剂量进行首免,2周后按照每只小鼠50μg融合蛋白的剂量进行二免,二免后两周再加强免疫一次。分别于免疫前和首免后每2周小鼠眼眶采血分离血清进行抗体检测,持续至三免后4周；三免后2周取脾脏,进行淋巴细胞增殖试验和细胞因子检测；三免后两周用新鲜传代的弓形虫按500个速殖子／只的剂量攻毒,评价其免疫保护效果。结果表明各重组蛋白均能显着提高机体对融合蛋白的免疫应答水平和淋巴细胞的增殖水平（P<0.05）：蛋白免疫组首免后4周抗体水平开始显着上升,首免后6周即可达到较高水平。其中二价亚单位疫苗rSAG1-IMP1的抗体水平要显着高于单价亚单位疫苗rIMP1和SAG1（P<0.05）。免疫后机体IgG1、IgG2a、IL-4、INF-γ水平均有所上升,但IgG1、IL-4更为明显。攻虫试验表明各蛋白免疫组均能显着延长小鼠的存活时间,弓形虫重组二价亚单位疫苗rSAG1-IMP1较单价亚单位疫苗具有更好的免疫效果。5.减毒沙门氏菌为载体传递弓形虫IMP1基因的免疫原性研究研究利用分子生物学技术构建了携带有弓形虫IMP1基因的减毒沙门氏菌活载体核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1。将构建的活载体核酸疫苗与空载减毒沙门氏菌ZJ111/pcDNA3.1免疫ICR小鼠,分别通过抗体水平检测、抗体亚类检测、淋巴细胞增殖试验、细胞因子检测以及攻虫试验等,探讨减毒沙门氏菌活载体核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、 ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1的免疫效果。结果表明：减毒沙门氏菌活载体核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1具有良好的免疫原性,可以诱导小鼠产生较强的体液及细胞免疫应答,显着提高机体INF-γ的分泌及IgG2a水平（P<0.05）,对小鼠抵抗弓形虫感染具有一定的免疫保护效果,可显着延长小鼠的存活时间（P<0.05）。而且二价核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1的免疫保护效果要显着的好于单价核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1。综上,本研究基于SAG1基因建立了一种可靠的弓形虫SYBR（?）green I荧光定量PCR检测方法,首次对浙江省猪、奶牛、山羊、犬、猫弓形虫血清阳性率进行较为详细的调查,通过制备IMP1多克隆抗体,应用间接免疫荧光技术对弓形虫速殖子感染不同阶段的IMP1蛋白的表达特性进行了研究,构建了弓形虫二价重组亚单位疫苗rSAG1-IMP1及减毒沙门氏菌活载体核酸疫苗ZJ111/pcDNA3.1-IMP1、ZJ111/pcDNA3.1-SAG1-IMP1并通过体液免疫和细胞免疫水平及小鼠攻虫试验等分析弓形虫IMP1蛋白作为疫苗的可能性及其前景,研究结果为进一步开发弓形虫病疫苗奠定了良好的基础。
李博[6]（2012）在《表达弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定》文中认为弓形虫（Toxoplasma gondii）是一类细胞内寄生,分布广泛的机会性致病原虫,能够导致人兽共患寄生虫病。虫体可侵入人和动物机体的多种脏器,引起人兽共患的弓形虫病,在动物和人群中有比较高的感染率,给人类健康和畜牧业生产都造成了较大的威胁。近年来,伴随孕妇感染弓形虫至胎儿畸形等症状的发生和艾滋病患者易感弓形虫并发弓形虫病的增多,弓形虫病已列为公共性的世界卫生问题。由于弓形虫的生活史较复杂,它的传播途径多样化,因此迄今对弓形虫病的治疗,未找到较理想药物。为此在弓形虫病防治中弓形虫疫苗已成为了研究的重点。ROP18具有蛋白激酶活性,并且参与形成纳虫空泡,使在细胞内寄生的弓形虫发挥持续发育能力和致病力。ROP18序列在101～113、129-142、152-163位氨基酸残基处含精氨酸,可能和蛋白锚定于PVM表面相关,C端是疏水区域,含丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶,在ROP2蛋白家族中保守。研究发现ROP18蛋白过量表达后,可使弓形虫在细胞内的数量增多,推测这个蛋白对抑制弓形虫增殖有一定的关系,极具疫苗候选抗原价值。蜥蜴利什曼原虫（Leishmania tarentolae）最初从爬行类蜥蜴（Moorish gecko Tarentola mauritanica）中分离得到的利什曼属原虫（Sauroleishmania）,对蜥蜴易感然,哺乳动物感染但不致病。由于蜥蜴利什曼原虫的寄生生活方式,其作为真核表达系统,可以用类似哺乳动物的翻译后修饰方式对目的蛋白进行翻译后加工,例如蛋白的磷酸化,糖基化或者异戊烯化。此外,蜥蜴利什曼原虫作为真核表达载体系统还具有很多优势,如较易培养,细胞较易破碎,表达蛋白不易污染等,因此蜥蜴利什曼原虫在作为外源蛋白的表达载体系统方面的研究越来越受到国内外的关注弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫构建根据Genbank上已发表的弓形虫RH株ROP18基因序列,设计特异引物,从弓形虫RH株全基因组中使用PCR的方法扩增ROP18基因,并克隆至pMD18-T载体,所得序列经测序分析,片段长1404bp,与Genbank上已发表的序列同源性为100%。再克隆入真核表达载体pLEXSY-neo2,经酶切鉴定,成功的构建了真核表达载体pLEXSY-neo2-ROP18。然后将表达载体线性化,利用电穿孔转染技术电转蜥蜴源利什曼原虫,将真核表达载体导入蜥蜴源利什曼原虫。培养24h后,G418筛选表达载体经基因重组整合到宿主基因组内的阳性克隆。待培养虫体的培养基变浑浊,阴性对照组培养基澄清虫体死亡时,即筛选得到转基因蜥蜴利什曼原虫。基因重组蜥蜴利什曼原虫鉴定阳性克隆扩大培养后和对照蜥蜴利什曼原虫分别提取基因组,用ROP18特异引物和同源重组引物进行重组利什曼原虫PCR鉴定,结果显示阳性基因重组蜥蜴利什曼原中扩增出特异性目的条带,对照虫体没有目的条带；基因重组蜥蜴利什曼原用新鲜筛选培养基静置培养72h后提取表达蛋白,应用多克隆抗血清用Western blotting印记法蛋白水平上进行重组蛋白检测,结果显示出现约55ku的条带,证明目的蛋白可在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。
李琳[7]（2012）在《利什曼原虫检测方法建立及其在BALB/c鼠体内分布和增殖研究》文中研究表明利什曼原虫病是锥虫科利什曼属的利什曼原虫（Leishmania spp）经媒介昆虫叮咬传播给动物和人类的一种人兽共患病,也称为黑热病。世界上已报告过很多利什曼原虫病的病例，是世界卫生组织加强控制的热带疾病之一[1]。我国流行的黑热病主要是由杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）引起的内脏型利什曼原虫病。2008年对四川地震灾区的犬只进行了黑热病检测，汶川县、九寨沟县及黑水县的阳性检出率均在20%以上。为了更好的预防黑热病的发生，黑热病疫苗的研制迫在眉睫。有学者认为从蜥蜴体内分离到的蜥蜴利什曼原虫（Leishmania tarentolae）对哺乳动物不致病[3]，故可用作黑热病疫苗的研制。同时，由于蜥蜴利什曼原虫易在体外培养，且具有与哺乳动物细胞相似的蛋白翻译、加工修饰的功能，以及高的蛋白表达量和靶向作用，也常被用作非致病性寄生虫蛋白表达系统的研究。本实验以杜氏利什曼原虫和蜥蜴利什曼原虫为研究对象，采用吉姆萨染色和负染对具有不同致病性的杜氏利什曼原虫和蜥蜴利什曼原虫进行形态学研究，结果显示杜氏利什曼原虫前鞭毛体的虫体和鞭毛较蜥蜴利什曼原虫前鞭毛体的更加细长，在无鞭毛体的形态学方面无明显差异。以108/ml杜氏利什曼原虫和蜥蜴利什曼原虫经腹腔途径分别感染BALB/c小鼠，通过利什曼原虫间接免疫组化方法来分析定位其在小鼠体内的分布，结果显示杜氏利什曼原虫和蜥蜴利什曼原虫在小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中均有分布。利什曼原虫实时荧光定量PCR方法来分析比较杜氏利什曼原虫和蜥蜴利什曼原虫在小鼠肝脏内的增殖情况，结果显示蜥蜴利什曼原虫与杜氏利什曼原虫相比，其在小鼠肝脏内的相对增殖量较少。感染小鼠组织病理学研究，结果显示杜氏利什曼原虫导致小鼠的心肌纤维断裂，间质增宽，肝脏的肝细胞疏散，肝细胞索见纤维增多，有的肝细胞萎缩，肝脏中巨噬细胞增多，脾脏组织灶状出血坏死、嗜酸性粒细胞增多、巨核细胞增多，巨噬细胞增多、淋巴细胞增多，肺泡壁增厚，巨噬细胞增生，肾脏肾小球肿胀，肾小球囊壁增厚，肾小管上皮轻度变性，着色不均；蜥蜴利什曼原虫除导致小鼠脾脏组织中巨核细胞增多外，无明显的组织病理学变化。通过荧光染色方法对表达荧光蛋白的蜥蜴利什曼原虫进行了小鼠体内分布定位研究，可清晰地看到利什曼原虫在小鼠体内的分布，并应用利什曼原虫实时荧光定量PCR方法研究其在小鼠血液内的增殖情况，结果显示蜥蜴利什曼原虫在小鼠体内呈波浪状增殖。本试验证实了蜥蜴利什曼原虫对小鼠无致病性，为研制黑热病疫苗和治疗利什曼原虫病以及蜥蜴利什曼原虫蛋白表达载体的研究提供了科学依据。
殷丽红[8]（2011）在《蜥蜴利什曼原虫对杜氏利什曼原虫的交叉免疫保护研究》文中认为内脏型利什曼病（Visceral Leishmaniasis, VL）,又称黑热病,是一种广泛流行于热带和亚热带地区的人畜共患寄生虫病,也是我国人群五大寄生虫病之一。据2000年世界卫生组织统计：全球已有1200万黑热病患者,每年新发病例在200万人以上,同时,近3.5亿人正面临着感染威胁。研究显示：目前尚无大规模用于临床的黑热病预防接种疫苗,原因在于现有疫苗效果不够理想。因此,研制具有保护性和治疗性的黑热病疫苗成为防治黑热病迫在眉睫的首要任务。蜥蜴利什曼原虫对哺乳动物无致病性,本研究将其体外培养后分别免疫BALB/c小鼠和犬,通过对小鼠脾淋巴细胞转化能力、IgG、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、犬白细胞变化以及攻击杜氏利什曼原虫后,对小鼠和犬肝脏、脾脏的减虫率测定,进而评价蜥蜴利什曼原虫的免疫保护效果。石蜡切片制作观察小鼠和犬的肝脏、脾脏病理变化,为后续研究奠定了基础。小鼠免疫保护性试验：将体外培养蜥蜴利什曼原虫以腹腔注射方式免疫小鼠,二次免疫后,攻击杜氏利什曼原虫,60d后剖杀检测肝脏、脾脏减虫率。结果显示：蜥蜴利什曼原虫能诱导小鼠产生特异性IgG抗体,免疫组显着高于对照组（p<0.05）；淋巴细胞转化试验SI值为2.03,表明免疫组淋巴细胞被活化。免疫组的IFN-γ、IL-2检测值与PBS对照组有显着性差异（p<0.05）,而IL-10和IL-4变化不大。通过实时荧光定量PCR法检测免疫组肝脏、脾脏的减虫率分别为65.06%和89.76%。肝脏、脾脏病理切片HE染色后镜检可见：阳性对照组肝细胞明显变性,局部有片状凝固性坏死；脾淋巴细胞减少,髓区充血,而免疫组则无明显的组织病理特征性变化。犬免疫保护性试验：将体外培养蜥蜴利什曼原虫以皮下注射方式免疫犬,二次免疫后,攻击杜氏利什曼原虫,30d后宰杀检测肝脏、脾脏减虫率。结果显示：通过实时荧光定量PCR法检测,免疫组肝脏、脾脏减虫率分别为48.76%和51.9%。肝脏、脾脏病理切片HE染色后镜检可见：阳性对照组肝细胞脂肪变性、坏死、空泡化、水肿；脾脏淋巴细胞减少、出现结节、组织坏死、有严重的坏死灶；‘淋巴结细胞坏死。而免疫组则无明显的组织病理特征性变化。以上结果表明蜥蜴利什曼原虫对杜氏利什曼原虫具有交叉免疫保护作用。本研究为利什曼原虫疫苗研制以及黑热病的防治研究提供了确切的实验依据。为利什曼原虫病的诊断、有效检测奠定基础,蜥蜴利什曼原虫的应用,为黑热病疫苗研究增添了成功的可行性。
杨欢欢[9]（2011）在《弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定》文中研究表明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种广泛寄生于人和动物组织有核细胞内的机会性致病原虫。虫体可侵犯人和动物机体的多种脏器,引起人兽共患的弓形虫病,在动物和人群中的感染率都非常高,给人类的健康和畜牧业生产均造成了巨大威胁。迄今为止,弓形虫的治疗,特别是针对弓形虫包囊,尚无特效药物。因此,筛选和表达有效的抗原分子,研制安全有效的弓形虫疫苗具有重要的理论研究意义和实际应用价值。蜥蜴利什曼原虫（Leishmania tarentolae）最初是从爬行类蜥蜴中分离到的利什曼属原虫,对蜥蜴易感,但不感染哺乳动物。由于其寄生生活方式,蜥蜴利什曼原虫能以与哺乳动物相似的翻译后修饰方式对目的蛋白进行翻译后加工,例如蛋白的糖基化,磷酸化或者异戊烯化等。此外,蜥蜴利什曼原虫作为真核表达系统还具有易培养,细胞易破碎,表达蛋白不易污染等优点。因此蜥蜴利什曼原虫作为外源蛋白的表达系统越来越受到关注。本研究利用PCR扩增技术从弓形虫RH株全基因组中扩增出长短不等的弓形虫抗原基因SAG1,将其分别克隆入真核表达载体质粒pLEXSY-neo2,构建真核表达穿梭质粒pLEXSY-neo2-SAG1.利用电穿孔转染技术将外源基因表达盒转入蜥蜴利什曼原虫,经G418筛选阳性克隆。表达的外源重组蛋白经SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定,证明SAG1重组蛋白在蜥蜴利什曼原虫中得到表达。真核表达载体pLEXSY-neo2-SAG1构建利用PCR扩增技术从弓形虫RH株基因组中扩增出弓形虫主要表面抗原基因SAG1全长片段及截断片段,分别将其克隆进真核表达载体pLEXSY-neo2,抗原基因SAG1经序列测定分析,长片段为957bp,截短片度为650bp,与Genbank上发表的国际标准株GUY-1992-RUB株SAG1基因同源性为98%。经酶切鉴定,成功构建了真核表达载体pLEXSY-neo2-SAG1。真核表达载体pLEXSY-neo2-SAG1转染蜥蜴利什曼原虫及筛选采用电穿孔转染技术将真核表达载体导入蜥蜴利什曼原虫,表达载体经同源重组整合进宿主基因组内,阳性克隆因整合进G418抗性基因neo而能在筛选培养基中生长,未整合的虫体及阴性对照则死亡,经药物G418筛选两周,获得浑浊的阳性虫体和清澈的阴性对照。转基因蜥蜴利什曼原虫鉴定提取阳性虫体及阴性对照虫体基因组,运用SAG1特异性引物及表达载体诊断引物进行PCR鉴定,结果阳性虫体中能扩增出特异的目的条带。虫体在新鲜筛选培养基中静置培养72h后提取表达的蛋白,SDS-PAGE图中分泌型表达与胞内表达的蛋白均出现约33ku的条带,阴性对照中无目的条带,Western blotting鉴定表达蛋白均能被抗组氨酸标签的特异性单克隆抗体所识别。弓形虫主要抗原基因SAG1在蜥蜴利什曼原虫中的成功克隆与表达,获得了稳定表达弓形虫SAG1基因的蜥蜴利什曼原虫虫株,为弓形虫疫苗和诊断制剂的研制奠定了基础。也有助于拓宽对弓形虫抗原蛋白真核表达性质和特点等领域的研究。
韩凯凯[10]（2011）在《捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究》文中认为捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属毛圆科（Trichostrongylidae）血矛属（Haemonchus）线虫,分布较广,寄生于反刍动物第四胃,偶见于小肠,因吸血常常导致贫血、消瘦、严重时甚至死亡,对畜牧业造成重大经济损失。目前防治该病方法主要是化学药物驱虫,但由于虫体抗药性的产生以及药物残留和药物污染等问题,迫使人们将注意力转移到利用免疫学方法来防治该病。本文进行了捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, HcGAPDH）特性研究及其疫苗免疫保护试验；同时对捻转血矛线虫烯醇化酶（Enolase, HcENO）进行了生物学特性研究,克隆得到捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶基因序列并对其进行了生物信息学分析,主要工作如下：1.捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶特性的研究根据GenBank上登录的捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因EST序列（登录号为AW670737,登录长度为362bp）设计基因特异性引物,分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5’端未知区和3’端未知区,从而拼接得到HcGAPDH基因的全长cDNA,然后将该序列递交GenBank（登录号为HM145749）。后经分析发现：该基因全长1303bp,含有最大开放阅读框（ORF）为1026bp,5’非翻译区（5’-UTR）长90 bp,3’非翻译区（3’-UTR）长175bp。根据此基因的全长cDNA设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,利用RT-PCR技术,扩增出约1000bp的产物,测序结果与推导出的ORF序列一致。BLAST分析后将该片段克隆到pET-28a（+）载体中,转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达融合蛋白。SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达,分子量约38kDa。以自然感染的山羊血清作为一抗,Western blot分析结果显示在38kDa处出现特异性条带。用HcGAPDH表达蛋白的包涵体免疫大鼠制备高免血清做一抗,Western blot分析HcGAPDH基因在捻转血矛线虫的天然表达,结果在38kD处有明显条带,与推测ORF的蛋白大小无明显区别。酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化活性,其最适pH值为8,最适反应温度为40℃。2.捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶虫体组织分布的研究为了研究捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, HcGAPDH）在虫体中的分布与定位情况,我们应用常规方法表达已构建好的pET28a-HcGAPDH, GE纯化柱纯化后,免疫SD大鼠制备抗血清。浓缩型S-P免疫组化3步法检测HcGAPDH抗原在捻转血矛线虫体内的分布和表达。结果发现,HcGAPDH主要定位于小肠微绒毛上皮,在其他部位则鲜见。3.捻转血矛线虫pVAX1-HcGAPDH DNA疫苗的构建与体内表达情况的检测利用DNA重组技术,构建pVAX1-HcGAPDH DNA疫苗。经酶切鉴定后,腿部肌肉免疫小鼠,1周后取肌肉注射部位、非注射部位组织,利用RT-PCR和Western-blot技术分别检测DNA疫苗的转录与表达情况。RT-PCR检测结果显示,小鼠注射部位肌肉所扩增出的目的条带大小约为1000bp,非注射部位中未能检测到目的条带,从而说明重组质粒在注射部位可以成功转录；VVestern blot检测结果发现,在注射部位检测到大小为38kD的目的蛋白条带,而非注射部位未能检测到目的蛋白的条带,这些结果都为下一步的动物保护性试验奠定了基础。4.捻转血矛线虫pVAX1-HcGAPDH DNA疫苗的免疫保护性试验使用DNA疫苗pVAX1-HcGAPDH,对9-10月龄山羊做了免疫保护性试验。健康山羊15只,随机分成3组,每组5只。一组免疫100μg pVAX1-HcGAPDH,其他两组为不攻虫对照组和攻虫对照组。在试验山羊的背部皮下多点注射免疫,两个对照组用1m1PBS代替DNA疫苗,一共免疫两次,中间间隔2周。第二次免疫14天后,疫苗免疫组和攻虫对照组山羊口腔接种5000条捻转血矛线虫第三期感染性幼虫。从攻虫后22至34天,每隔一天收集粪便,虫卵计数。攻虫后35天,屠宰山羊并剖解皱胃,分离雌雄虫体,进行成虫计数。同时,采用间接酶联免疫吸附试验（ELISA）方法,测定了所有试验山羊血清特异性IgG滴度、血清以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中特异性IgA浓度。在免疫前、首免后14d、二免后14d、攻虫后14d和杀羊前对以下指标进行检测：利用ELISA试剂盒检测血清细胞因子（IFN-γ、TGF-β、IL-4、IL-22）的浓度变化；利用流式细胞术检测了所有试验山羊外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞和B淋巴细胞的变化；利用全自动电子血细胞分析仪对所有试验山羊的外周血中嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血红蛋白进行了检测。结果显示,DNA疫苗pVAX1-HcGAPDH免疫山羊后,ELISA检测结果表明血清IgG在首免后14天达到较高水平,二免后抗体水平进一步升高；血清IgA在免疫后出现较高水平的滴度,同时杀羊后发现胃粘膜组织匀浆具有较高的滴度,免疫后山羊CD4+T淋巴细胞、B淋巴细胞水平显着高于不攻虫对照组,同时细胞因子检测免疫组IL-4水平上升显着,IFN-γ、TGF-β、IL-22变化规律性不明显。分析试验山羊血细胞发现,免疫组和攻虫对照组山羊嗜酸性粒细胞浓度显着高于不攻虫对照组。5000条捻转血矛线虫三期幼虫攻击试验山羊后,免疫组虫卵减少率为34.9%,雌虫、雄虫和成虫总数减少率分别为39.23%,36.03%和37.73%,说明pVAX1-HcGAPDH对抵御山羊捻转血矛线虫的感染具有一定效果。5.捻转血矛线虫烯醇化酶特性的研究根据GenBank上登录的捻转血矛线虫烯醇化酶（Enolase）基因EST序列（登录号为BF422728,登录长度为482bp）设计基因特异性引物,分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5’端未知区和3’端未知区,从而拼接得到Enolase基因的全长cDNA。分析发现：该基因全长1583bp,含有最大开放阅读框（ORF）为1305bp,5’非翻译区（5’-UTR）长62 bp,3’非翻译区（3’-UTR）长21 6bp。根据Enolase基因的全长cDNA设计1对特异性引物,以捻转血矛线虫的总RNA为模板,采用RT-PCR技术,扩增出约1300bp的产物,将该片段克隆到pET-28a（+）载体中,转化入感受态大肠杆菌BL21（DE3）进行表达。SDS-PAGE结果分析发现融合蛋白在上清和包涵体中均有表达,分子量约49kDa。以自然感染的山羊血清作为一抗,Western blot结果显示在49kDa处出现特异性条带。HcGAPDH表达蛋白的包涵体免疫大鼠制备高免血清做一抗,用Western blot分析HcGAPDH基因在捻转血矛线虫的天然表达,结果在49kDa处有明显条带,与推测ORF的蛋白大小近似。酶活性测定结果表明该重组蛋白具有一定的烯醇化酶催化活性,其最适pH值为7。6.捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶的生物信息学分析根据GenBank上登录的捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase, HcPGK）基因EST序列（登录号为CB192372,登录长度为584bp）设计基因特异性引物,分别利用5’RACE和3’RACE获得该基因5’端未知序列和3’端未知序列,从而拼接得到PGK基因的全长cDNA。利用生物信息学网站的各种在线分析工具,对其进行分析发现：该基因全长1584bp,最大开放阅读框（ORF）为1254 bp,5’非翻译区（5’-UTR）长95 bp,3’非翻译区（3’-UTR）长235 bp。该基因编码417个氨基酸,相对分子量理论预测值为44,594 Da。存在多个潜在的生物活性功能位点,蛋白的理化性质稳定。有17个主要的B细胞抗原表位,这些为下步研究奠定了基础。
二、利什曼原虫核酸疫苗的研究现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、利什曼原虫核酸疫苗的研究现状（论文提纲范文）
（1）寄生虫DNA疫苗研究进展（论文提纲范文）
| 1 DNA疫苗作用机制及设计原则 |
| 1.1 作用机制 |
| 1.2 DNA疫苗的设计原则 |
| 2 DNA疫苗免疫方式 |
| 2.1 EP |
| 2.2 PMEd |
| 2.3 脂质体 |
| 2.4 微米和纳米颗粒 |
| 3 DNA疫苗优缺点 |
| 3.1 DNA疫苗优点 |
| 3.1.1 同时引起体液免疫和细胞免疫 |
| 3.1.2 表达的蛋白质类似天然真核生物结构并伴随翻译后修饰 |
| 3.1.3 MHCⅠ类和Ⅱ类分子均递呈抗原，具有极化T细胞的能力 |
| 3.1.4 免疫原性的长期持久性 |
| 3.1.5 DNA疫苗其他优点 |
| 3.2 DNA疫苗缺点 |
| 4 寄生虫DNA疫苗 |
| 4.1 原虫DNA疫苗 |
| 4.1.1 疟原虫 |
| 4.1.2 新孢子虫 |
| 4.1.3 贝氏隐孢子虫 |
| 4.1.4 弓形虫 |
| 4.1.5 利什曼原虫 |
| 4.1.6 克氏锥虫 |
| 4.1.7 球虫 |
| 4.2 蠕虫DNA疫苗 |
| 4.2.1 吸虫 |
| 4.2.2 线虫 |
| 4.2.3 绦虫 |
| 5 展 望 |
（3）微生物介导的利什曼原虫KMP11疫苗的研制现状（论文提纲范文）
| 1 病毒介导的利什曼原虫KMP11疫苗 |
| 1.1 重组牛痘病毒 |
| 1.2 重组疱疹性口炎病毒 |
| 1.3 重组腺病毒血清型5 |
| 2 寄生虫介导的利什曼原虫KMP11疫苗 |
| 2.1 重组刚地弓形虫 |
| 2.2 重组蜥蜴利什曼原虫 |
| 3 结语 |
（4）减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 综述部分 |
| 第一章 鱼类无乳链球菌研究进展 |
| 1 病原学 |
| 1.1 发现史 |
| 1.2 生物学性状 |
| 1.3 血清型与基因分型 |
| 1.4 不同宿主来源的无乳链球菌交叉感染 |
| 2 传播途径 |
| 3 致病性与致病机理 |
| 3.1 感染宿主及临床症状 |
| 3.2 致病机理 |
| 3.3 毒力因子 |
| 4 诊断 |
| 4.1 临床症状 |
| 4.2 病原检测 |
| 4.3 分子快诊技术 |
| 4.4 试剂盒快诊技术 |
| 5 防治现状 |
| 5.1 药物治疗 |
| 5.2 免疫预防 |
| 5.3 综合防控 |
| 6 小结 |
| 第二章 鱼类核酸疫苗研究进展 |
| 1 核酸疫苗概述 |
| 1.1 核酸疫苗的发展 |
| 1.2 核酸疫苗的构成 |
| 1.3 核酸疫苗的作用机理 |
| 1.4 核酸疫苗的优点和存在的主要问题 |
| 2 鱼类核酸疫苗的研究概况 |
| 2.1 鱼类核酸疫苗的类型 |
| 2.2 鱼类核酸疫苗的接种途径 |
| 2.3 鱼类DNA疫苗的影响因素 |
| 3 鱼类核酸疫苗载体 |
| 3.1 载体种类及特点 |
| 3.2 减毒沙门氏菌载体 |
| 3.3 减毒沙门氏菌载体在鱼类核酸疫苗的应用 |
| 4 鱼类DNA疫苗的佐剂 |
| 5 小结 |
| 第三章 研究目的与意义 |
| 试验研究 |
| 第四章 罗非鱼无乳链球菌SIP基因克隆、真核表达载体的构建及其在EPC细胞的表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株、细胞、载体 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 1.5 培养基 |
| 2 方法 |
| 2.1 无乳链球菌sip基因克隆、鉴定 |
| 2.1.1 引物设计与合成 |
| 2.1.2 细菌基因组DNA的提取 |
| 2.1.3 sip基因的PCR扩增 |
| 2.1.4 PCR产物的纯化回收 |
| 2.1.5 PCR产物的T/A连接 |
| 2.1.6 连接产物的转化 |
| 2.1.7 重组菌DH5α-pMD19-sip的PCR鉴定 |
| 2.1.8 重组质粒的酶切鉴定 |
| 2.1.9 测序及序列分析 |
| 2.2 重组真核表达质粒的构建、转化及鉴定 |
| 2.2.1 重组真核表达质粒的构建 |
| 2.2.2 重组真核表达质粒的转化 |
| 2.2.3 重组真核表达质粒的鉴定 |
| 2.3 pVAX1-sip在EPC细胞的表达及鉴定 |
| 2.3.1 兔抗无乳链球菌血清的制备 |
| 2.3.2 表达产物间接免疫荧光法鉴定 |
| 2.3.3 Western blot检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 无乳链球菌sip基因的扩增、T克隆及鉴定 |
| 3.2 sip基因测序与结果分析 |
| 3.3 真核表达质粒的构建及鉴定 |
| 3.4 真核表达产物的间接免疫荧光及Western blot检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸疫苗候选基因的选择 |
| 4.2 sip基因的T克隆和序列分析 |
| 4.3 真核表达载体的选择 |
| 4.4 真核表达载体的体外表达及检测 |
| 5 小结 |
| 第五章 重组减毒沙门氏菌的构建与生物学特性鉴定 |
| 1 材料 |
| 1.1 菌株、载体 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 重组减毒沙门氏菌核酸疫苗的构建 |
| 2.1.1 沙门氏菌感受态的制备 |
| 2.1.2 沙门氏菌的电转化 |
| 2.1.3 电转重组菌的鉴定 |
| 2.2 重组减毒沙门氏菌的生物学特性鉴定 |
| 2.2.1 重组减毒沙门氏菌的生长特性试验 |
| 2.2.2 重组减毒沙门氏菌体外遗传稳定性试验 |
| 2.2.3 重组减毒沙门氏菌体内遗传稳定性试验 |
| 2.2.4 口服免疫饲料的制备及计数 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组减毒沙门氏菌构建与鉴定 |
| 3.2 重组沙门氏菌生长特性 |
| 3.3 重组质粒在沙门氏菌的体外稳定性试验 |
| 3.4 重组质粒在沙门氏菌的体内稳定性试验 |
| 3.5 烘干及储存温度对饲料中阳性重组菌的影响 |
| 3.5.1 烘干温度对饲料中阳性重组菌的影响 |
| 3.5.2 储存温度对饲料中重组菌的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 重组质粒转化减毒沙门氏菌 |
| 4.2 重组沙门氏菌的稳定性考察 |
| 4.3 重组沙门氏菌在饲料中的稳定性 |
| 5 小结 |
| 第六章 核酸疫苗的安全性研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 SL7207-pVAX1-sip灌胃罗非鱼的LD_(50)测定 |
| 2.2 SL7207-pVAX1-sip灌胃罗非鱼的病理学观察 |
| 2.3 重组质粒核酸疫苗与罗非鱼染色体的整合性研究 |
| 2.3.1 免疫接种 |
| 2.3.2 组织细胞基因组DNA提取及提纯 |
| 2.3.3 PCR敏感试验 |
| 2.3.4 免疫组pVAX1-sip整合率测检 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组菌对罗非鱼的安全性试验 |
| 3.2 人工感染罗非鱼的病理学观察 |
| 3.3 染色体的整合性研究 |
| 4 讨论 |
| 4.1 沙门氏菌的减毒 |
| 4.2 减毒沙门氏菌对罗非鱼的毒力 |
| 4.3 核酸疫苗的基因整合性 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅰ 免疫后罗非鱼组织病理形态 |
| 第七章 核酸质粒在罗非鱼体内的组织分布及阳性表达 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 核酸质粒在罗非鱼体内的分布 |
| 2.1.1 免疫接种 |
| 2.1.2 组织细胞基因组DNA提取 |
| 2.1.3 PCR检测质粒DNA分布情况 |
| 2.2 免疫组化检测Sip蛋白的分布 |
| 2.2.1 兔高免血清的制备 |
| 2.2.2 Sip蛋白的组织分布检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 核酸质粒的组织分布 |
| 3.2 sip蛋白在免疫后罗非鱼组织体内的定位分布 |
| 4 讨论 |
| 4.1 减毒沙门氏菌的侵入机制 |
| 4.2 核酸质粒及表达蛋白的组织分布 |
| 5 小结 |
| 图版Ⅱ SIP蛋白的组织分布 |
| 第八章 重组核酸疫苗对罗非鱼的免疫效果考察 |
| 1 材料 |
| 1.1 试验动物 |
| 1.2 菌株 |
| 1.3 主要试剂及配置方法 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 接种菌株和口服饲料的准备 |
| 2.2 免疫程序及采血 |
| 2.3 免疫指标的检测 |
| 2.3.1 血清总蛋白含量测定 |
| 2.3.2 血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性 |
| 2.3.3 血清溶菌酶活性的测定 |
| 2.3.4 血清补体C_3含量测定 |
| 2.3.5 血清抗菌活性 |
| 2.3.6 采用ELISA检测抗体效价 |
| 2.3.7 核酸疫苗对罗非鱼细胞因子转录影响 |
| 2.3.8 免疫保护力测定 |
| 2.3.9 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 血清总蛋白含量的测定 |
| 3.1.1 灌胃组罗非鱼血清总蛋白 |
| 3.1.2 拌料组罗非鱼血清总蛋白 |
| 3.2 血清总超氧化物歧化酶(SOD)活性 |
| 3.2.1 灌胃组罗非鱼血清SOD活性 |
| 3.2.2 拌料组罗非鱼血清SOD活性 |
| 3.3 血清溶菌酶活性含量测定 |
| 3.3.1 灌胃组罗非鱼血清溶菌酶含量 |
| 3.3.2 拌料组罗非鱼血清溶菌酶含量 |
| 3.4 血清补体C_3含量测定 |
| 3.4.1 灌胃组罗非鱼血清补体C_3含量 |
| 3.4.2 拌料组罗非鱼血清补体C_3含量 |
| 3.5 血清抗菌活性测定 |
| 3.6 血清抗体效价 |
| 3.6.1 灌胃组罗非鱼抗体效价 |
| 3.6.2 拌料组罗非鱼抗体效价 |
| 3.7 罗非鱼IL-1β和TNF-α的转录水平变化 |
| 3.8 免疫保护率 |
| 3.8.1 灌胃组免疫保护率 |
| 3.8.2 拌料组免疫保护率 |
| 4 讨论 |
| 4.1 核酸疫苗对非特异性免疫的影响 |
| 4.2 核酸疫苗对抗体效价影响 |
| 4.3 核酸疫苗对细胞因子的影响 |
| 4.4 不同免疫程序对保护率的影响 |
| 4.5 推荐免疫程序 |
| 5 小结 |
| 第九章 结论与创新 |
| 1 结论 |
| 2 创新性 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文目录 |
（5）弓形虫疫苗候选抗原IMP1生物学特性及其免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 弓形虫与弓形虫病 |
| 1 弓形虫病原形态 |
| 2 弓形虫生活史 |
| 3 弓形虫的抵抗力 |
| 4 弓形虫流行病学 |
| 4.1 检测方法 |
| 4.2 流行情况 |
| 5 弓形虫病的防治 |
| 6 小结 |
| 第二章 弓形虫毒力因子研究进展 |
| 1 基因型与毒力 |
| 2 弓形虫滑行运动和粘附,入侵及逸出宿主细胞过程相关毒力因子 |
| 2.1 稳定的表膜蛋白和脂肪 |
| 2.2 棒状体颈部蛋白：RONs |
| 2.3 棒状体球部蛋白 |
| 2.4 瞬时表膜蛋白：MICs |
| 2.5 弓形虫与宿主细胞互作相关毒力因子 |
| 2.6 其它因子 |
| 3 参与虫体发育及转化的毒力因子 |
| 3.1 致密颗粒 |
| 3.2 细胞骨架 |
| 4 包囊形成和虫荷 |
| 5 小结 |
| 第三章 弓形虫疫苗研究进展 |
| 1 弓形虫疫苗防治机制 |
| 2 弓形虫疫苗研究现状 |
| 2.1 弓形虫虫体抗原 |
| 2.2 亚单位疫苗 |
| 2.3 核酸疫苗 |
| 3 小结 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第四章 浙江省动物弓形虫病血清流行病学调查 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要材料试剂与仪器 |
| 1.2 样品的采集 |
| 1.3 样品的检测 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 浙江省猪、奶牛、山羊、犬、猫弓形虫血清阳性率 |
| 2.2 浙江省猪弓形虫流行病学相关风险因子分析 |
| 2.3 浙江省犬弓形虫流行病学相关风险因子分析 |
| 2.4 浙江省猫弓形虫流行病学相关风险因子分析 |
| 3 讨论 |
| 第五章 基于SAG1基因弓形虫荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 参考虫株、模板和实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 弓形虫基因组DNA的制备 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 普通PCR |
| 1.2.4 定量PCR扩增 |
| 1.2.5 荧光定量PCR特异性试验 |
| 1.2.6 荧光定量PCR敏感性试验 |
| 1.2.7 荧光定量PCR稳定性及重复性试验 |
| 1.2.8 临床样品的检测 |
| 2 结果 |
| 2.1 阳性质粒pMD-SAG1的构建 |
| 2.2 荧光定量PCR扩增产物的鉴定 |
| 2.3 荧光定量PCR标准曲线的建立 |
| 2.4 荧光定量PCR特异性试验结果 |
| 2.5 敏感性试验结果 |
| 2.6 荧光定量PCR的重复性试验结果 |
| 2.7 临床样品检测结果 |
| 3 讨论 |
| 第六章 弓形虫IMP1的表达特性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 参考虫株和实验动物 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 工具酶与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 引物设计 |
| 1.2.2 弓形虫速殖子总RNA的提取 |
| 1.2.3 cDNA第一链的合成 |
| 1.2.4 弓形虫IMP1基因的RT-PCR扩增 |
| 1.2.5 弓形虫IMP1基因的克隆 |
| 1.2.6 测序分析 |
| 1.2.7 弓形虫IMP1原核表达载体的构建 |
| 1.2.8 弓形虫IMP1的原核表达 |
| 1.2.9 SDS-PAGE |
| 1.2.10 Western blot鉴定 |
| 1.2.11 目的蛋白的纯化与复性 |
| 1.2.12 多克隆抗体的制备 |
| 1.2.13 间接ELISA法检测抗体水平 |
| 1.2.14 Vero细胞及弓形虫的传代、培养 |
| 1.2.15 游离速殖子IMP1的亚细胞定位 |
| 1.2.16 入侵过程中速殖子IMP1的亚细胞定位 |
| 1.2.17 入侵后纳虫空泡中速殖子IMP1的亚细胞定位 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果 |
| 2.2 弓形虫pET30a-IMP1质粒的PCR鉴定及酶切分析 |
| 2.3 测序结果分析 |
| 2.4 pET30a-IMP1的原核表达及Western-blot鉴定 |
| 2.5 多克隆抗体效价的测定 |
| 2.6 不同时期弓形虫IMP1蛋白的亚细胞定位 |
| 3 讨论 |
| 第七章 弓形虫二价重组亚单位疫苗rSAG1/IMP1的免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 弓形虫与试验动物 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 工具酶与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 弓形虫基因组DNA的制备 |
| 1.2.2 弓形虫IMP1、SAG1基因的扩增 |
| 1.2.3 弓形虫IMP1及SAG1基因的克隆 |
| 1.2.4 测序分析 |
| 1.2.5 弓形虫SAG1-IMP1真核表达载体的构建 |
| 1.2.6 IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白 |
| 1.2.7 SDS-PAGE |
| 1.2.8 Western-blotting |
| 1.2.9 目的蛋白的纯化 |
| 1.2.10 重组亚单位疫苗的免疫效果研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pET30a-SAG1-IMP1的PCR鉴定 |
| 2.2 重组质粒pET30a-SAG1-IMP1的测序结果 |
| 2.3 rSAG1、rIMP1、rSAG-IMP1的表达纯化 |
| 2.4 重组亚单位疫苗诱导的体液免疫应答 |
| 2.5 抗体亚类的检测 |
| 2.6 淋巴细胞转化试验 |
| 2.7 胞因子的检测 |
| 2.8 动物保护性试验 |
| 3 讨论 |
| 第八章 减毒沙门氏菌为载体传递弓形虫IMP1基因的免疫原性研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 弓形虫与试验动物 |
| 1.1.2 菌株与质粒 |
| 1.1.3 工具酶与试剂 |
| 1.1.4 主要仪器设备 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 弓形虫基因组DNA的制备 |
| 1.2.2 弓形虫IMP1、SAG1基因的扩增 |
| 1.2.3 弓形虫IMP1及SAG1基因的克隆 |
| 1.2.4 测序分析 |
| 1.2.5 弓形虫IMP1及SAG1-IMP1真核表达载体的构建 |
| 1.2.6 电转用减毒沙门氏菌感受态的制备 |
| 1.2.7 真核表达质粒电转化入沙门氏菌 |
| 1.2.8 重组沙门氏菌中质粒的鉴定 |
| 1.2.9 减毒沙门氏菌活载体核酸疫苗的免疫效果研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pMD18-SAG1、pMD18-IMP1、pMD18-IMP1(融合)的PCR鉴定 |
| 2.2 重组质粒pcDNA3.1-IMP1、pcDNA3.1-IMP1(融合)的PCR鉴定 |
| 2.3 重组质粒pcDNA3.1-SAG1-IMP1的PCR鉴定 |
| 2.4 重组质粒的测序结果 |
| 2.5 活载体核酸疫苗诱导体液免疫应答 |
| 2.6 抗体亚类的检测 |
| 2.7 疫苗免疫对淋巴细胞增殖的影响 |
| 2.8 细胞因子的检测 |
| 2.9 动物保护性试验 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 论文创新性 |
| 研究展望 |
| 附录1 溶液配制 |
| 附录2 英文缩写注释 |
| 攻读博士学位期间的主要成果 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）表达弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 弓形虫病概况 |
| 1.2 弓形虫疫苗研究进展 |
| 1.3 弓形虫ROP18基因研究进展 |
| 1.4 蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)简介 |
| 1.5 研究前景 |
| 第二章 表达弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 转基因蜥蜴利什曼原虫鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（7）利什曼原虫检测方法建立及其在BALB/c鼠体内分布和增殖研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1篇 文献综述 |
| 1 利什曼原虫概述 |
| 1.1 利什曼原虫体内的蛋白 |
| 1.2 利什曼原虫动基体 |
| 1.3 利什曼原虫的致病性 |
| 1.4 利什曼原虫侵入巨噬细胞的机制 |
| 1.5 黑热病的检测方法 |
| 2 利什曼原虫疫苗研究进展 |
| 2.1 弱毒疫苗 |
| 2.2 灭活疫苗 |
| 2.3 基因工程重组疫苗 |
| 2.4 核酸疫苗 |
| 3 利什曼原虫候选疫苗佐剂的研究 |
| 3.1 白介素-12(IL-12，Interleukin-12 ) |
| 3.2 巨噬细胞刺激因子 (GM-CSF，Granolucyte macrophage-colony stimulating factor) |
| 3.3 单磷酰脂质A ( Monophosphoryl lipid A) |
| 3.4 寡聚脱氧核苷酸（CpG ODN，CPG Oligodeoxynucleotide ) |
| 3.5 卡介菌(BCG) |
| 3.6 铝盐(aluminium salts) |
| 3.7 弗氏佐剂 |
| 第2篇 研究内容 |
| 第1章 利什曼原虫形态学观察 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 利什曼原虫姬氏染色结果 |
| 2.2 利什曼原虫电子显微镜观察结果 |
| 2.3 蜥蜴利什曼原虫荧光显微镜观察结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利什曼原虫培养基的优化 |
| 3.2 利什曼原虫表面的保护层 |
| 3.3 利什曼原虫前鞭毛体形态学研究 |
| 4 小结 |
| 第2章 利什曼原虫检测方法建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 兔抗利什曼原虫多克隆抗体的浓度及纯度分析 |
| 2.2 利什曼原虫间接 ELISA方法的建立 |
| 2.3 利什曼原虫免疫组化方法建立 |
| 2.4 利什曼原虫实时荧光定量PCR方法的建立 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利什曼原虫间接ELISA的建立 |
| 3.2 抗原修复对免疫组化染色的影响 |
| 4 小结 |
| 第3章 利什曼原虫在小鼠体内的分布及增殖研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 利什曼原虫在BALB/c体内的分布 |
| 2.2 HE染色结果 |
| 2.3 利什曼原虫在BALB/c鼠肝脏及血液中的增殖 |
| 3 讨论 |
| 3.1 利什曼原虫在小鼠体内的分布及小鼠组织的病理变化 |
| 3.2 实验动物、接种途径对宿主体内利什曼原虫增殖的影响 |
| 3.3 利什曼原虫逃避机制对宿主体内利什曼原虫增殖的影响 |
| 3.4 表达荧光蛋白的蜥蜴利什曼原虫 |
| 4 小结 |
| 第3篇 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（8）蜥蜴利什曼原虫对杜氏利什曼原虫的交叉免疫保护研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 利什曼原虫的相关研究 |
| 1 利什曼原虫病的概述 |
| 2 利什曼原虫病的诊断 |
| 3 利什曼原虫疫苗研究现状 |
| 第二章 寄生虫疫苗交叉免疫保护的研究进展 |
| 1 利什曼原虫疫苗交叉免疫保护研究 |
| 2 其他寄生虫疫苗交叉免疫保护研究 |
| 第二部分 实验内容 |
| 第三章 蜥蜴利什曼原虫体外培养方法的建立 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 蜥蜴利什曼原虫对杜氏利什曼原虫的交叉免疫保护试验 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录:英文缩略词表 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 弓形虫病概况 |
| 1.2 弓形虫主要表面抗原SAG1研究进展 |
| 1.3 蜥蜴利什曼原虫(Leishmania tarentolae)简介 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 表达载体pLEXSY-neo_2-SAG1的构建 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第三章 表达载体pLEXSY-neo_2-SAG1电穿孔转染蜥蜴利什曼原虫及筛选 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第四章 转基因蜥蜴利什曼原虫鉴定 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（10）捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 捻转血矛线虫生化特性研究进展 |
| 1 捻转血矛线虫病 |
| 2 糖酵解途径 |
| 3 捻转血矛线虫的生化特性研究进展 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 捻转血矛线虫疫苗研究进展 |
| 1 捻转血矛线虫疫苗 |
| 2 捻转血矛线虫抗原的研究进展 |
| 3 遇到的问题及对策 |
| 4 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 甘油醛-3-磷酸脱氢酶研究进展 |
| 1 GAPDH的催化反应机理 |
| 2 GAPDH的来源与主要功能 |
| 3 GAPDH在寄生虫学中研究进展 |
| 4 捻转血矛线虫GAPDH |
| 参考文献 |
| 第四章 烯醇化酶研究进展 |
| 1 烯醇化酶的结构特点 |
| 2 烯醇化酶的来源与主要功能 |
| 3 烯醇化酶在寄生虫学中研究进展 |
| 4 捻转血矛线虫Enolase |
| 参考文献 |
| 第五章 磷酸甘油酸激酶研究进展 |
| 1 磷酸甘油酸激酶的结构特点 |
| 2 磷酸甘油酸激酶的同工酶 |
| 3 PGK在寄生虫上研究进展 |
| 4 捻转血矛线虫PGK |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第六章 捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆、表达及酶活性测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的虫体组织分布 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第八章 捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的构建及体内表达检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第九章 捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护性实验 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十章 捻转血矛线虫烯醇化酶基因的克隆、表达及酶活性测定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第十一章 捻转血矛线虫磷酸甘油酸激酶基因的克隆及其生物信息学分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 本论文的创新之处 |
| 致谢 |
| 论文发表情况 |
四、利什曼原虫核酸疫苗的研究现状（论文参考文献）
- [1]寄生虫DNA疫苗研究进展[J]. 王宁,赵鹏鹏,张艳艳,马勋,王正荣,薄新文. 中国畜牧兽医, 2021(03)
- [2]婴儿利什曼原虫磷酸烯醇丙酮酸羧基酶优势表位基因的分子克隆与表达[J]. 陈劲宇,王玉洁,李焕卿,陈达丽. 中国热带医学, 2020(11)
- [3]微生物介导的利什曼原虫KMP11疫苗的研制现状[J]. 李文桂,陈雅棠. 热带医学杂志, 2019(01)
- [4]减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究[D]. 黄凌远. 四川农业大学, 2014(10)
- [5]弓形虫疫苗候选抗原IMP1生物学特性及其免疫原性研究[D]. 禹海杰. 浙江大学, 2013(08)
- [6]表达弓形虫ROP18基因重组蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定[D]. 李博. 吉林农业大学, 2012(06)
- [7]利什曼原虫检测方法建立及其在BALB/c鼠体内分布和增殖研究[D]. 李琳. 吉林大学, 2012(10)
- [8]蜥蜴利什曼原虫对杜氏利什曼原虫的交叉免疫保护研究[D]. 殷丽红. 吉林农业大学, 2011(12)
- [9]弓形虫SAG1转基因蜥蜴利什曼原虫的构建及鉴定[D]. 杨欢欢. 吉林农业大学, 2011(11)
- [10]捻转血矛线虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶DNA疫苗的免疫保护作用与烯醇化酶特性的研究[D]. 韩凯凯. 南京农业大学, 2011(06)