一、氯离子通道与癫痫（论文文献综述）
丁健[1]（2021）在《GEFS+的致病基因验证和海马MRS变化与智力水平研究》文中提出遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+）是以家系为整体做出诊断的癫痫综合征。目前研究表明,GEFS+表现为常染色体显性遗传的特性。迄今为止,虽然有数量不少的GEFS+家系被研究报道,但是在这些被报道的家系中存在基因突变的家系比例不到20%。GEFS+的致病基因及发病机制并未得到阐明。本研究前期对收集到的GEFS+家系成员进行了致病基因的筛查,在一个家系发现存在着编码钾离子通道β亚基的KCNAB3基因的杂合错义突变c.773A>G（p.H258R）,该基因的位点突变既往在GEFS+家系中未见报道,基因致病性的评估表明突变对蛋白功能的影响为可能致病。我们推测KCNAB3基因可能是中国人群GEFS+的新的致病基因。本研究拟对KCNAB3基因的突变进行细胞功能学的验证,并应用磁共振波谱（Magnetic resonance spectroscopy,MRS）对GEFS+患儿海马进行功能检测以及应用韦氏智力评估工具对患儿进行智力评估。探讨GEFS+的发病机制并了解GEFS+患儿海马及认知功能是否受影响,为GEFS+的病因、预后等研究提供新的理论依据。研究对象和方法对象:收集2016年01月～2019年12月诊断为GEFS+的家系30个。方法:对KCNAB3基因的杂合错义突变c.773A>G（p.H258R）位点构建慢病毒载体质粒,使用293Ta细胞进行慢病毒包装,将重组慢病毒质粒感染人类胚胎肾细胞293（HEK293）,使用全细胞膜片钳技术进行细胞功能学验证。对30个GEFS+家系先证者患儿进行海马1H-MRS波谱值以及智商检测,与对照组比较。结果1.转染野生型KCNA1重组慢病毒质粒HEK293细胞的钾离子电流是不失活的电流。转染野生型KCNA1+野生型KCNAB3重组慢病毒质粒HEK293细胞的钾离子电流出现失活特性。转染野生型KCNA1+突变型KCNAB3重组慢病毒质粒HEK293细胞的钾离子电流失活特性更明显。2.野生型KCNA1组电流密度为 59.674±45.053 pA/pF（n=12）,野生型 KCNA1+野生型KCNAB3组电流密度为35.485±28.695pA/pF（n=11）,野生型KCNA1+突变型KCNAB3组电流密度为22.607±19.473 pA/pF（n=11）,三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。3.GEFS+患儿与对照组双侧海马NAA/Cr、Cho/Cr、NAA/（Cho+Cr）数值比较,差异无显着统计学意义。4.GEFS+患儿与对照组智力等级分布比较无显着差异性（P>0.05）。5.GEFS+患儿的言语智商（VIQ）及总智商（FIQ）均低于对照组,存在显着性差异（P<0.05）。操作智商（PIQ）低于对照组,但两者之间无显着性差异（P>0.05）。结论1.KCNAB3基因突变可以加速钾离子通道失活、抑制钾离子电流,提示突变可能提高神经元兴奋性,促进癫痫或惊厥的发作。2.KCNAB3基因可能是中国人群GEFS+新的致病基因。3.本研究中GEFS+患儿的海马MRS改变不明显。4.本研究中GEFS+患儿的言语智商（VIQ）及总智商（FIQ）低于正常儿童,而智力等级分布及操作智商（PIQ）与正常儿童之间无差异。
李汶灿[2]（2021）在《利用分子折叠策略构筑人造离子通道》文中研究指明天然离子通道作为细胞膜的“看门人”,可以选择性地传输与生理活动密切相关离子或蛋白,维持细胞的动态平衡,对维持生命体活动的正常运行至关重要。然而,天然离子通道突变引起的蛋白功能障碍会导致严重的离子通道病,如神经系统疾病（全身性癫痫或偏瘫偏头痛）,呼吸系统疾病（囊性纤维化）,内分泌系统疾病（糖尿病）等。复杂的天然通道蛋白结构限制了人们对离子通道病的研究。但随着科技的发展,越来越多的通道蛋白晶体数据被解析报道,使人们对天然离子通道的结构与传输机制有了更深入的认识。例如,高分辨冷冻电镜技术加速了通道蛋白结构的获取,为人类理解天然离子通道结构提供了重要信息。这些研究成果极大地促进了人们对离子通道蛋白结构及其生物学功能的认识,也推动了离子通道化学仿生领域的发展。科研工作者利用氢键、静电作用、金属配位、主体-客体相互作用和离子-π相互作用等多种非共价作用发展了丰富的人造离子通道。人造离子通道作为天然离子通道的替代物,不仅有助于揭示离子传输运作机制,而且还具有巨大的生物医用潜力用于治疗离子通道病。虽然人造离子通道在体外实验中表现出优异的生物相容性以及离子传输性质,但是对于天然离子通道所展示的高选择性、高传输活性以及智能门控性等特点,人工合成体系仍然难以实现。为了更好模拟天然蛋白通道,揭示离子传输的基本规律,构建高选择性、高传输活性的人造离子通道具有重要的科学意义和研究价值。对此,我们课题组以螺旋拓扑结构设计发展了系列人造离子通道体系,其通道结构具有可修饰的空腔、可调节的空腔尺寸,实现了通道多样性,在模拟天然离子通道领域具有无限潜力。本论文旨在模拟天然离子通道蛋白结构与功能,利用分子折叠策略构筑具有离子选择性的新型人造跨膜通道,拓展人造离子通道结构,研究离子通道模拟物跨膜传输功能,揭示离子传输效率、离子选择性的结构基础与物化本质。1、钠离子选择性增强的仿生离子通道通过对比天然钾钠离子通道可以得知,天然钾离子通道空腔尺寸要小于天然钠离子空腔。这是由于钾离子与钾离子通道选择器中的四个氧原子可以很好的匹配,从而形成配位键来弥补脱水合的能量。而钠离子尺寸较小不能与钾离子通道完美匹配,且钠离子的水合能更强。我们在本组已报道的高选择性的钾离子通道的基础上,学习天然钾钠离子通道选择器空腔大小区别,在保留离子有效结合位点的基础上,引入自主设计基元扩大通道空腔尺寸,实现钠离子选择性增强。2、人造双孔阳离子通道天然氯离子通道以通道二聚体形式传输氯离子,受这一结构启发,我们摆脱传统构筑单孔离子通道的想法,试图用桥连单元将两个单孔通道有机整合在一起,开发新型双孔离子通道。基于组内已有经验,我们对不同的桥连单元进行筛选,最终将刚性的联恶二唑基元作为我们合成双孔离子通道的桥连单元。在联恶二唑基元的作用下,双孔分子以S型构象存在。双孔分子在自发π堆积作用下可以在膜内自组装形成具有两个相同的中空离子传输路径的双孔离子通道。与我们以往理解的单孔人造离子通道不同,双孔离子通道在离子通道传输模式上必然是全新的。我们开发的这种双孔离子通道不仅丰富了我们的人造离子传输体系,同时也为开发新型多孔离子通道提供了结构基础,更为我们从化学层面解释天然通道传输机理提供了很好的模型。3、设计合成螺旋拓扑阴离子通道脲基作为吸电子基团,可以提供氢键有效地结合阴离子,常被用于设计合成阴离子转运体。我们试图将脲基引入螺旋仿生通道,利用分子折叠策略将脲基基元规律地排列在三维螺旋骨架内,成功地合成了首例含脲基的人造阴离子螺旋仿生通道。我们研究了富含氢键供体的螺旋仿生通道空腔对离子传输以及离子选择性的影响。脲基基团的引入不仅丰富了螺旋密码子,还带来了全新的螺旋拓扑结构。以上这些新颖的离子跨膜通道不仅是我们向天然离子通道学习的成果表现,还为传统的离子跨膜体系丰富了拓扑结构,为我们在未来效仿大自然中复杂结构的功能化应用提供了独特的想法。
赵腾[3]（2021）在《NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究》文中研究表明研究背景:N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate,NMDA）受体（NR）是脑内兴奋性神经递质-谷氨酸的主要受体。其作为一种配体门控型的离子通道,在突触内主要参与介导兴奋性突触后电流（EPSC）的产生及传递,在突触外还可参与γ-氨基丁酸（GABA）能中间神经元突触前GABA释放,进而影响抑制性突触后电流（IPSC）的产生。而构成神经元网络的兴奋性突触信号和抑制性突触信号的失衡是形成癫痫的重要原因。因此,NR应该是影响神经元网络兴奋/抑制平衡的关键因素。通过一些临床病例及细胞水平受体功能分析证实,NR功能增强型（Go F）基因突变和功能丧失型（Lo F）基因突变均可导致癫痫。而作为NR的亚基之一,GluN2A/GRIN2A突变的患者中78%表现为癫痫,是目前NR基因变异相关癫痫研究的重点。目前,Lo F型NR基因突变所致癫痫的发病机制尚不明确,在转基因动物水平进行在体、离体电生理及行为学研究,进而明确该型基因突变致病的特点和机制意义重大。另外,一些变构调节剂可以逆转部分基因变异所致的NR功能异常。通过细胞水平筛选并在动物水平干预,可能筛选出对Lo F型NR较为有效的正向变构调节剂（positive allosteric modulator s,PAMs）,从而为临床精准化治疗提供重要理论和实践支持。研究方法:本课题以临床报道及细胞水平受体功能分析证实较为典型的Lo F型突变GluN2A/GRIN2A-V685G为研究位点。首先利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行NR功能验证,并根据文献资料选择了孕烯醇酮硫酸酯（PS）、24（S）羟基胆固醇（24（S）-HC）、妥布霉素、花生四烯酸、D-丝氨酸、精胺以及谷氨酸、甘氨酸做为备选药物在细胞水平进行敏感药物筛选,选出1-2种最为敏感的药物作为干预药物。利用胚胎显微注射法制备GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠,而后将小鼠分为空白组（WT）、功能丧失型突变组（Lo F）、空白治疗组（WT+drug）、突变治疗组（Lo F+drug）。在行为学方面,观察各组小鼠自发癫痫发作的情况,进行癫痫等级评分。若无自发癫痫的表型,则在各组建立高热癫痫模型,评估癫痫发作的阈值（发作潜伏期）。应用新颖物体识别实验（NOR）以及新颖物体位置识别（NOL）实验评估各组小鼠的认知状况;应用悬尾实验、糖水偏好实验和强迫游泳实验评估各组小鼠的抑郁行为状况。在体检测各组小鼠皮层脑电图异常放电水平,并将各组小鼠断头取脑,应用膜片钳技术检测海马CA1区锥体神经元突触后膜NR所介导的电流（EPSC）以及GABA能中间神经元所介导的m IPSC水平,同时检测全锥体神经元动作电位的变化。最后利用Real-time PCR和Western blot技术检测GluN2A亚基的表达情况。研究结果:本课题利用非洲爪蟾卵母细胞在细胞水平进行了NR功能验证,结果显示转染GRIN2A-V685G突变c DNA的蛙卵表面NR电流较对照组明显下降,功能基本丧失。将备选药物应用到转染细胞,结果显示24（S）-HC可以部分逆转该突变的NR功能。结合相关文献,最终选择可以增加脑内及血清24（S）-HC水平且已经临床应用于抗HIV治疗的依法韦仑（efavirenz,EFV）作为干预药物。而后将动物分为了WT组、Lo F组、WT+EFV组、Lo F+EFV组。行为学评价显示,各组小鼠均未出现自发性癫痫发作,在建立高热惊厥模型后,Lo F组小鼠癫痫发作潜伏期较短,而Lo F+EFV组癫痫发作潜伏期则较Lo F组明显延长,各组小鼠的发作强度和发作时持续时间无明显差异。在认知功能评价中,各组在新颖物体识别实验（NOR）中无明显差异,在新颖物体位置识别实验（NOL）中,Lo F组与WT组差异也无显着性,但观察趋势可见Lo F组小鼠较WT组识别指数稍有降低。而Lo F+EFV组的NOL识别指数较Lo F组明显增高,差异有显着性,可见Lo F小鼠可能存在空间记忆能力减退,而EFV可以逆转这种趋势。在抑郁行为评估中,各组小鼠均未发现明显差异,且Lo F组和Lo F+EFV组小鼠在悬尾不动实验中不动时间反而更短。在体电生理学检测显示Lo F组小鼠的皮层脑电图出现癫痫样放电（seizure-like events,SLEs）的频率明显增加,而Lo F+EFV组则较少出现SLEs,说明EFV可以部分抑制突变小鼠的脑内异常放电。随后利用膜片钳进行突触内NR电流（EPSC）水平检测显示Lo F组电流幅度和最大电流面积均明显降低,Lo F+EFV组则较Lo F组明显升高,差异均有显着性。m IPSC水平检测显示各组电流的振幅峰值（peak amplititude）检测中未发现明显差异,但在电流发放频率（event frequency）检测中,Lo F组较WT组明显下降,而Lo F+EFV组则无下降。随后进行全细胞动作电位检测显示与WT组相比,Lo F组小鼠海马CA1区锥体细胞动作电位阈值有所下降,动作电位幅度值增加,动作电位输入电阻增加,相同电流刺激下动作电位根数明显增加,差异有显着性。而Lo F+EFV组较Lo F组在动作电位上述指标中有逆转的趋势,但差异无显着性。而后进行的Real-time PCR和Western blot检测显示各组在GluN2A表达中无明显差异。研究结论:（1）GRIN2A-V685G突变可使GluN2A亚基配体结合结构域（ABD）功能障碍,致谷氨酸效力丧失,进而导致NMDA受体功能障碍。（2）GluN2A/GRIN2AV685G转基因小鼠海马CA1区锥体神经元突触内NR介导的EPSC降低,而由突触外NMDAR参与的GABA能中间神经元所介导的m IPSC也下降。使神经元网络的兴奋/抑制平衡失调,最终导致锥体神经元兴奋性增高。（3）GluN2A/GRIN2A-V685G转基因小鼠容易出现癫痫发作,其皮层脑电图可见异常放电增多。（4）抗HIV药依法韦仑（EFV）可以通过增加脑内24（S）羟基胆固醇水平来部分恢复GluN2A/GRIN2A-V685G突变所致的NMDAR功能丧失,减少皮层的异常放电,抑制转基因小鼠的癫痫发作。
李信晓[4]（2021）在《GABRG2突变导致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）的分子遗传学特征及机制研究》文中提出第一部分构建GABRG2敲除细胞系及探讨温度对相关蛋白的影响目的运用CRISPR/Cas9基因编辑工具在小鼠海马神经元细胞系（HT22）中构建GABRG2基因敲除的体外细胞模型,并采用RNA-seq分析细胞基因的表观遗传特征,探讨在不同温度条件下对其他蛋白表达的影响。方法（1）在NCBI-gene中查找GABRG2基因的DNA序列以及蛋白信息,根据GABRG2基因序列特征,选择第三个转录本进行靶向删除;（2）根据蛋白质保守区特点,在外显子前1/3设计guide RNA（g RNA）;（3）利用CRISPR设计软件和网站筛选sg RNA序列,生成一系列sg RNA序列,选择分值高的前三个sg RNA序列,以降低同源序列及脱靶效应;（4）将筛选的g RNA送公司合成后,将其插入p Sp Cas9（BB）-2A-Puro（PX459）V2.0质粒载体,选择阳性克隆进行摇菌培养,进行酶切鉴定;（5）将构建好的PX459-GABRG2-1/2/3质粒转染入HT22细胞,提取基因组DNA进行测序,验证质粒活性;（6）运用Western blot和RT-q PCR技术分别检测GABRG2的蛋白和m RNA表达情况,验证GABRG2基因敲除效果,以质粒转染细胞敲除效率最高组为基因敲除组,以野生型为对照组;（7）提取对照组和实验组细胞总RNA,行转录组测序,对筛选差异基因并进行信号通路和蛋白质互作分析;（8）在不同温度条件下检测GABAA受体及MMP家族相关蛋白的表达。结果（1）酶切鉴定和测序分析显示成功将设计的GABRG2 sg RNA插入PX459质粒,质粒构建成功;（2）采用TA克隆后测序显示,质粒PX459-GABRG2-01、PX459-GABRG2-2和PX459-GABRG2-03分别发生碱基缺失、点突变和点突变,构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性;（3）实验组GABRG2的蛋白和m RNA的表达水平显着低于对照组,其中PX459-GABRG2-03组敲除效率最高,达90%以上;（4）RNA-seq显示共有2157个差异基因,其中上调和下调基因分别是1173个和984个;（5）差异基因KEEG富集分析信号通路主要包括PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、p53信号通路和Rap1信号通路;GO富集分析显示,差异基因多集中于细胞生物学过程、代谢、发育、免疫、细胞凋亡、细胞膜、细胞外、突触及受体活性、转运体活性、酶活性调节等过程;PPI结果显示,GABRG2与GABAA受体其他亚基联系密切,处于其核心地位;（6）在不同温度条件下,GABRG2基因敲除组细胞中GABRA1/GABRB1/GABRB3和CACNA1A的表达量随温度升高逐渐降低,而GABRA5的表达随温度升高逐渐增加。MMP家族的相关因子MMP3和MMP9的表达则升高。结论（1）成功利用CRISPR/Cas9 system构建稳定转染的GABRG2敲除细胞系,为研究GABRG2在遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）中致病机制提供线索;（2）GABRG2基因突变可使GABAA受体的大部分亚基表达量降低,可能导致GABA能信号通路功能受损,致使体内抑制性的神经递质释放降低;（3）通过调节PI3K-Akt和MAPK信号通路影响神经元的凋亡、发育、受体活性、转运体活性、酶活性及相关基因的表达,这些改变在GEFS+发生过程中可能起到重要作用。第二部分GABRG2基因敲除对HT22细胞突触前膜囊泡释放及功能的影响目的评估GABRG2基因敲除后的突触前膜递质释放功能及GABA能抑制性突触的传递活动方法（1）利用FM4-64染料进行细胞突触囊泡释放染色,观察细胞的胞吞和胞吐情况,用以检测基因敲除后细胞递质释放功能;（2）通过全细胞膜片钳技术检测GABRG2基因敲除后细胞系的m IPSC变化。结果（1）与野生组相比,GABRG2基因敲除组细胞FM4-64的阳性簇数量显着减少（WT:4.20±0.21 clusters/10μm;KO细胞:1.60±0.18 clusters/10μm;t-检验;P<0.0001）。KO组细胞中,FM4-64的荧光强度也显着降低（P<0.0001）;（2）KO组细胞的m IPSC频率显着低于对照组（0.79±0.04 Hz vs.1.87±0.16 Hz;P<0.001）,m IPSC的振幅也低于对照组（10.18±0.87 p A vs.24.00±1.10 p A;P<0.001）。此外,WT组和KO组细胞的峰值电流有显着性差异（498±35.5 p A vs.53.4±7.0;P<0.001）。结论γ2亚基功能障碍影响细胞膜递质释放,降低了m IPSCs动作电位的诱发频率和电流幅度,这可能是GEFS+发生的一个重要因素。第三部分构建GABRG2敲除小鼠模型及探讨温度对癫痫行为的影响目的构建海马和新皮质特异性GABRG2基因敲除小鼠模型,探讨不同温度条件下对GABRG2基因敲除小鼠癫痫行为的影响及潜在机制。方法（1）利用Cre/loxp重组酶系统技术,首先构建GABRG2fl/wt转基因小鼠,繁配得到GABRG2fl/fl纯合子小鼠,将其与海马和新皮质组织特异性表达Cre+/+重组酶的工具鼠进行繁配和鉴定,选择子代基因型为GABRG2fl/wt Cre+的小鼠作为实验对象,同窝别的野生型小鼠作为对照组。取子代小鼠的脚趾或尾部,提取基因组DNA,PCR后进行琼脂糖凝胶电泳,鉴别小鼠基因型;（2）采用RT-q PCR,Western Blot和免疫组化方法技术检测GABRG2基因在小鼠海马和新皮质中的m RNA和蛋白质表达水平;（3）用Nissl染色法分析大脑皮层和海马神经元的丢失情况;（4）使用温度加热仪对小鼠加热,记录癫痫发作情况,脑电图（EEG）用于记录脑电活动;（5）使用PTZ诱导癫痫发作,比较热诱导与PTZ诱导癫痫发作的严重程度。结果（1）筛选出子代基因型为GABRG2fl/wt Cre+小鼠作为实验对象;小鼠海马和新皮质中GABRG2的m RNA和蛋白表达水平显着低于野生组;（2）组化结果显示,GABRG2fl/wtCre+小鼠海马和新皮质内的GABRG2表达显着降低,其主要减少部位是海马的CA3区和新皮质的Ⅳ-Ⅴ层;（3）热造模过程中,实验组小鼠癫痫发作更明显。皮层脑电图（EEG）显示实验组小鼠皮层脑电的棘波数量显着高于对照组,杂合子CKO小鼠对热诱导癫痫发作敏感性更高,可以引发全身强制性阵挛癫痫发作,而对照组小鼠不受影响;（4）与同窝野生型小鼠相比,GABRG2fl/wt Cre+小鼠利用PTZ诱导癫痫发作的潜伏期较短、癫痫发作持续的时间延长、死亡率及严重程度增加。结论（1）成功构建了海马和新皮质特异性GABRG2基因敲除小鼠模型;（2）GABRG2fl/wtCre+小鼠再现了人类热性惊厥的许多特征,是研究遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的良好模型;（3）GABRG2fl/wt Cre+小鼠具有显着的温度易感性。第四部分GABRG2基因敲除小鼠的表观遗传学特征目的探讨GABRG2基因敲除后引起遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的表观遗传学特征。方法（1）采用RNA-seq技术,基于Illumina测序平台,分别提取海马与皮质组织的总RNA,进行建库测序和生物信息分析;（2）利用ATAC-seq技术,基于Illumina技术测序平台,分别提取海马与皮质组织细胞的细胞核,加入T5转座酶后进行纯化,构建文库测序和生物信息学分析。结果（1）RNA-seq测序结果显示,正常体温下,GABRG2fl/wtCre+小鼠与野生型小鼠海马组织内差异基因个数为667个,上调基因和下调基因个数分别为496和171;皮层组织内差异基因个数为552个,上调基因和下调基因个数分别为170和383。热诱导癫痫发作情况下（40℃）,海马组织内差异基因的个数为681个,上调基因和下调基因个数分别为440和241;皮层内差异基因的个数是743,上调基因和下调基因的个数分别是382和361。GO生物学富集结果显示,主要包含神经肽信号通路、神经递质代谢过程、蛋白细胞外基质、细胞外基质、受体活性调节及G-蛋白偶联受体结合;KEEG分析显示,主要富集的信号通路有MAPK pathway、Toll样受体通路、IL-17 pathway、NF-κB pathway、c AMP通路和PI3K-Akt pathway;（2）ATAC-Seq结果显示,每组样品的clean base数均在17.5G以上。进一步数据显示,正常体温下,GABRG2fl/wtCre+小鼠与野生型小鼠海马组织内差异peak数为106187个,皮层组织内差异peak数为118,620个;热诱导癫痫发作情况下（40℃）,海马组织内差异peak数为116,754个,皮层内的差异peak数为121,874个。根据这些差异peak数进行基因注释同时进行信号通路分析,在正常体温下,海马组织差异基因数共16,418个,上调和下调基因数分别为1,767和14,651个;皮层内差异基因个数为12,716个,上调和下调基因分别为852和11,864个;热诱导条件下,海马组织内差异基因总数为6530个,上调和下调基因个数分别是4,410个2,120个;皮层内差异基因总数为5,249个,上调和下调基因分别为2,884和2,365个;另外,我们也分析了差异peak上存在的差异motif,选取最显着的25个motif作为实验对象。再将其与已知转录因子进行motif的富集,共发现14个关系最密切的转录因子。结论（1）RNA-seq和ATAC-seq的分析结果较为一致,共同的信号通路有PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、m TOR信号通路及Toll样受体信号通路;（2）motif富集分析显示涉及14个重要的转录因子
江东[5]（2021）在《SLE患者皮损表现与其他临床特征的相关性》文中研究说明[目的]回顾性复习系统性红斑狼疮患者的皮肤粘膜损害类型与其他症状体征、各脏器损伤程度、并发症以及生化指标和免疫学指标等临床资料,深入探讨系统性红斑狼疮患者皮肤损害与其他临床特征之间的相关性,为疾病早期诊断、早期干预、诊疗方案选择和预后判断提供依据。[方法]收集1999-2019年昆明医科大学第二附属医院皮肤性病科与风湿免疫科收治的系统性红斑狼疮确诊病例共1000例,根据有无皮肤损害进行分组,对其实验室指标及其他临床表现进行统计学分析,符合或近似正态分布的计量资料以均数±标准差（χ±S）表示,组间比较采用独立样本t检验:非正态分布的计量资料以四分位数间距表示Md（P25,P75）,组间比较采用Mann-Whitney U检验;计数资料和等级资料组间比较采用卡方检验,组内比较采用Bonferroni检验。采用Logistic回归分析计算各个皮损与其他临床特征的相关性,以P<0.05为差异有统计学意义。[结果]1000例系统性红斑狼疮患者（891例女性,109例男性）男女比例1:8.17,平均年龄为37.53±14.26岁,男女患者间的发病年龄无显着差异。在本研究中,1000例SLE患者中最主要的临床表现为血液系统损害（82.3%）,其次分别为皮肤黏膜损害（81.5%）、关节炎（64.9%）、狼疮性肾炎（58.2%）、肝损伤（56.9%）、血管炎（44.4%）、浆膜炎（39%）、间质性肺炎（33.8%）、神经系统损伤（19.1%）、肺动脉高压（12.6%）、脾肿大（11.3%）和胃肠炎（5.9%）。特异性皮损蝶形红斑（60.6%）的发生率高于盘状红斑（24.8%）。非特异性皮损最常见的为血管炎（44.4%）,包括:指尖红斑（31.6%）、可触及紫癜（15.5%）、甲周红斑（12.3%）、雷诺现象（10%）、血栓性静脉炎（4.1%）和网状青斑（3.3%）。其他非特异性皮损的发生率从高到低依次为狼疮性脱发（26.6%）、光敏感（16.9%）和口腔溃疡（16.8%）。Logistic回归分析揭示了关节炎（P<0.001,OR2.039,95%CI 1.458～2.852）、光敏感（P<0.001,OR4.231,95%CI 2.554～7.007）、指尖红斑（P=0.002,OR 2.270,95%CI 1.347～3.826）、癫痫（P=0.014,OR 2.844,95%CI 1.240～6.522）、间质性肺炎（P<0.001,OR 1.980,95%CI 1.397～2.807）是蝶形红斑的危险性因素。高密度脂蛋白（P=0.006,OR 0.420,95%CI 0.227～0.775）、血清总 CO2（P=0.039,OR 0.910,95%CI 0.834～0.993）、狼疮性肾炎（P=0.030,OR 0.514,95%CI 0.282～0.937）是盘状红斑的保护性因素;同时抗心磷脂抗体（P=0.039,OR 1.791,95%CI 1.031～3.113）、光敏感（P=0.001,OR 2.364,95%CI 1.447～3.863）是盘状红斑的危险性因素。抗心磷脂抗体-IgM（P=0.038,OR0.484,95%CI 0.244～0.959）是局限性急性皮肤型红斑狼疮（ACLE）的保护性因素;同时关节炎（P<0.001,OR 2.606,95%CI 1.731～3.922）、指尖红斑（P=0.001 OR 2.627,95%CI 1.458～4.730）、间质性肺炎（P=0.015,OR 1.628,95%CI 1.101～2.406）是局限性ACLE的危险性因素。血清氯离子（P=0.021,OR 0.944,95%CI 0.898～0.991）、心包积液（P=0.034,OR 0.517,95%CI 0.282～0.951）是泛发性ACLE的保护性因素;同时肌酐（P=0.003,OR 1.004,95%CI 1.001～1.006）、光敏感（P<0.001,OR2.627,95%CI 1.655～4.170）、癫痫（P=0.039,OR2.468,95%CI 1.048～5.811）、肝损伤（P=0.003,OR 1.969,95%CI 1.260～3.076）是泛发性ACLE的危险性因素。抗核抗体滴度（P=0.003,OR 0.674,95%CI 0.522～0.871）是慢性皮肤型红斑狼疮的保护性因素;同时抗核糖体P蛋白抗体（P=0.012,OR 1.315,95%CI 1.062～1.627）、抗心磷脂抗体 IgG（P=0.010,OR 4.072,95%CI 1.391～11.923）、狼疮性脱发（P=0.024,OR 1.784,95%CI 1.080～2.948）是泛发性ACLE的危险性因素。是补体C3（P=0.002,OR 0.329,95%CI 0.162～0.669）是狼疮性脱发的保护性因素。抗Sm抗体（P=0.009,OR 1.378,95%CI 1.084～1.750）、关节炎（P=0.027,OR 1.746,95%CI 1.066～2.860）是口腔溃疡的危险性因素。精神症状（P=0.008,OR 0.244,95%CI 0.085～0.697）是光敏感的保护性因素;同时抗Sm抗体（P=0.012,OR 1.313,95%CI 1.061～1.624）、干燥综合征（P=0.001,OR 2.603,95%CI 1.461～4.636）是光敏感的危险性因素。抗Sm抗体（P=0.013,OR 1.273,95%CI 1.052～1.541）、关节炎（P=0.013,OR 1.530,95%CI 1.095～2.139）是血管炎的危险性因素。血清球蛋白（P=0.024,OR 1.039,95%CI 1.005～1.073）、抗 RNP 抗体（P=0.001,OR 1.518,95%CI 1.194～1.929）、抗cANCA抗体（P=0.006,OR 6.590,95%CI 1.725～25.180）、关节炎（P=0.018,OR 2.130,95%CI 1.140～3.977）、心包积液（P=0.018,OR 2.531,95%CI 1.176～5.445）是雷诺现象的危险性因素。[结论]1.系统性红斑狼疮的发病存在性别偏倚,该疾病好发于女性,但男女之间的发病年龄不存在显着差异。2.系统性红斑狼疮最常见的系统性损害分别是血液系统损害、皮肤黏膜损害和关节炎。3.系统性红斑狼疮患者多于发病初期即首次发病即出现皮肤黏膜损害,本组SLE患者81.5%出现皮疹（特异性皮损+非特异性皮损）,其中特异性皮损占69.9%,非特异皮损占67.2%。4.系统性红斑狼疮的皮肤黏膜损害与部分脏器损害及实验室指标具有明确的相关性,可用于预测SLE患者某些系统性损伤和脏器并发症的发生和发展,有助于制定干预措施及其预后评估。
张贺博[6]（2021）在《Nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究》文中研究表明目的:神经前体细胞表达发育下调基因4（Nedd4-2）,编码泛素连接酶E3。近期研究发现,部分癫痫患者中Nedd4-2基因发生突变,并指出Nedd4-2通过介导AMPA受体的亚基Glu A1的泛素化,影响神经元的活动和癫痫发作易感性。近年来研究表明,癫痫的发生与离子通道、神经递质、突触连接等有着密切联系。泛素化修饰的底物中有很多是影响中枢神经兴奋性的离子通道蛋白,泛素化修饰通过调控这些通道蛋白表达水平,进一步影响神经元的兴奋性,与癫痫的发生密切相关。然而是否还有其它未知与癫痫相关的Nedd4-2的底物有待进一步的研究。本研究利用CRISPR/Cas9技术,构建了Nedd4-2基因敲除（Nedd4-2+/-）小鼠模型,该模型中Nedd4-2长亚型和短亚型在脑中表达水平均减半。本研究通过戊四唑（PTZ）诱导实验组Nedd4-2+/-（KO）小鼠与对照组Nedd4-2+/+（WT）小鼠发生癫痫,采用Label-free蛋白组学检测和体内体外实验等方法,比较KO与WT小鼠海马组织蛋白质表达差异,以期发现新的Nedd4-2靶蛋白,揭示Nedd4-2参与癫痫发生的新机制。方法:1、Nedd4-2基因敲除小鼠由上海南方模式生物科技股份有限公司构建。2、小鼠每天给于PTZ 35mg/kg腹腔注射一次,癫痫发作评分按Racine分级。3、采用Label-free-LC-MS/MS技术检测PTZ诱导癫痫成功点燃的KO小鼠与WT小鼠海马体组织中的差异表达的蛋白质,并进行Cluster,GO和KEGG生物信息分析,筛选出与癫痫相关的差异蛋白。4、提取鼠尾DNA,PCR鉴定小鼠基因型。5、实时荧光定量PCR检测Nedd4-2和Kir4.1表达6、小鼠海马,皮质和髓质Western Blot检测Nedd4-2和Kir4.1的表达。7、尼氏染色检测小鼠脑组织中神经元数量的变化。8、免疫组织学方法检测Kir4.1在小鼠脑组织中的表达。9、Co-IP检测脑组织内Nedd4-2与Kir4.1以及Kir4.1与Ub的结合。10、细胞转染,Western Blot检测Nedd4-2和Kir4.1的表达,Co-IP验证转染后Kir4.1的泛素化程度变化。11、Kir4.1表达载体和突变载体转染细胞,Co-IP验证Nedd4-2与Kir4.1的结合。12、Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A转染细胞,给于放线菌酮（100μg/ml）处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化。13、14-3-3表达载体转染细胞,给于R18处理,Western Blot检测Kir4.1表达变化,Co-IP验证Nedd4-2与Kir4.1的结合程度变化。14、Kir4.1表达载体分别和Nedd4-2表达载体或空载体共转染HEK293细胞,Kir4.1表达载体和Kir4.1突变体T312A分别转染HEK293细胞,记录Ba2+敏感的内向钾离子电流。结果:1、Rt-qPCR和Western Blot结果显示,KO小鼠与WT小鼠相比,Nedd4-2在海马,皮质和髓质m RNA和蛋白表达水平均下降约一半。2、小鼠经PTZ注射后,根据Racine评分标准,结果显示KO小鼠癫痫发作评分持续高于WT组。脑组织的尼氏染色结果显示,KO小鼠与WT对照组小鼠相比,尼氏体数量减少,说明神经元损伤更明显。3、海马体蛋白组学分析鉴定的3379个蛋白中,与WT小鼠对照相比,有55个蛋白被认为在KO小鼠中发生改变,其中内向整流k+通道Kir4.1上调了1.83倍。4、分别提取KO小鼠与WT小鼠海马、皮质和髓质总蛋白进行Western Blot实验,结果显示,与对照组WT小鼠相比,Nedd4-2表达明显降低（P<0.01）,Kir4.1表达明显增高（P<0.01）。5、免疫组化结果显示,KO小鼠与WT小鼠相比,Kir4.1表达升高。6、Co-IP结果显示,与WT组小鼠相比,KO小鼠海马中Kir4.1的泛素化修饰水平明显下调（P<0.01）。7、Co-IP实验证实,在KO与WT小鼠海马组织中,Nedd4-2与Kir4.1存在相互作用,另外,与WT组相比,KO组中Kir4.1与Nedd4-2结合程度明显减弱（P<0.01）。8、c6细胞转染Nedd4-2干扰载体,与对照组相比,Kir4.1蛋白表达升高。Co-IP结果显示,Kir4.1的泛素化水平明显降低。9、Kir4.1表达载体以及三种突变载体,分别和Nedd4-2共转染c6细胞,CoIP实验结果显示,Kir4.1突变体T312A与Nedd4-2相互作用明显减弱。10、T312A突变的Kir4.1表达载体和野生Kir4.1表达载体分别和Nedd4-2表达载体共转染c6细胞,给于Cycloheximide处理,与WT组相比,突变的Kir4.1仍保持较高水平（P<0.0001）。11、Co-IP结果显示,14-3-3与Kir4.1存在相互作用。c6细胞转染14-3-3表达载体,与空载组相比,Kir4.1表达水平降低,Kir4.1与Nedd4-2相互作用增强。相反,给于14-3-3抑制剂R18处理,与对照组相比,Kir4.1表达水平升高,Kir4.1与Nedd4-2相互作用增强。12、在HEK293细胞中,与空载体组相比,转染Nedd4-2表达载体的细胞中,Ba2+敏感的内向钾离子电流显着降低;与转染野生型Kir4.1表达载体相比,转染T312A突变体的Kir4.1 Ba2+敏感的内向钾离子电流为野生型3.5%。结论:1、在PTZ诱导癫痫的KO和WT小鼠海马组织中,共鉴定到3379个蛋白质,筛选出了55个差异蛋白,与WT组相比,在KO组中21个高表达13个低表达。2、Nedd4-2单倍剂量不足引起癫痫易感性升高。3、Nedd4-2是Kir4.1的泛素E3连接酶,Nedd4-2通过与Kir4.1的苏氨酸312-脯氨酸这一基序相互作用,并介导其发生泛素化修饰和降解。4、KO小鼠脑组织中,Kir4.1表达明显上调,Kir4.1泛素化修饰水平下调。5、适配器蛋白14-3-3促进了Nedd4-2介导的Kir4.1的泛素化。
陈娟[7]（2020）在《GABRG2突变斑马鱼癫痫模型的构建及机制研究》文中研究指明目的 构建人突变GABRG2（F343L）转基因斑马鱼模型,探寻GABRG2（F343L）突变在斑马鱼癫痫发生中的机制,并筛选有效的抗癫痫药。方法1.利用Gateway克隆技术,以pDestTol2CG2为表达载体,通过LR反应,构建野生型hGABRG2wt和突变型hGABRG2F343L表达质粒。2.将野生型（WT）和突变型（F343L）质粒分别与Tol2 mRNA共同注射到野生型（AB品系）斑马鱼胚胎中,在受精后24～48h,筛选心脏表达绿色荧光的斑马鱼培养。3.将成年转基因斑马鱼与野生型斑马鱼杂交,产生F1代斑马鱼,经筛选和基因型鉴定获得Tg（hGABRG2wt）和T（hGABR G2F343L）斑马鱼系。4.采用视频自动跟踪系统,分析不同基因型斑马鱼基础游泳行为、昼夜节律以及在光闪刺激和PTZ诱导情况下游泳行为。5.qPCR和原位杂交检测不同基因型斑马鱼癫痫发作标志性基因c-fos表达变化。6.qPCR、Western blot和免疫荧光组织化学检测不同基因型斑马鱼脑组织GAB AA受体亚基的表达。7.Western blot和免疫荧光组织化学检测不同基因型斑马鱼突触后蛋白的表达。8.转录组测序分析不同基因型斑马鱼脑差异表达基因,并进行GO聚类和KEGG通路富集分析。9.通过行为学分析不同抗癫痫药对突变转基因斑马鱼的作用。结果1.利用转基因技术可以构建携带人突变GABRG2（F343L）基因的斑马鱼,该斑马鱼系具有癫痫表型。2.与WT转基因斑马鱼相比,F343L突变斑马鱼游泳行为更活跃,整体昼夜节律没有显着改变,但对于光照、光闪刺激和PTZ诱导更为敏感。3.F343L突变斑马鱼中癫痫发作标志性基因c-fos在72 hpf时显着增高。4.F343L突变斑马鱼中GABRG2基因和蛋白表达均显着降低;GABRA1基因表达先降低后恢复正常,蛋白没有显着变化;GABRB2基因表达先降低后增加,蛋白早期没有显着改变,后期升高。5.F343L突变斑马鱼中突触后膜蛋白Gephyrin和GAD65/67表达降低。6.转录组测序发现F343L突变斑马鱼在72 hpf和120 hpf时与WT相比分别有953个和524个差异表达基因。7.传统抗癫痫药物作用30 min对F343L突变斑马鱼游泳行为没有显着影响,组蛋白脱乙酰化酶抑制剂SAHA作用30 min可以显着抑制斑马鱼兴奋性,并呈剂量依赖效应。结论1.成功构建人突变GABRG2（F343L）转基因斑马鱼模型,该转基因斑马鱼系具有癫痫表型,游泳行为更为活跃,对癫痫刺激更敏感。2.突变GABRG2（F343L）转基因斑马鱼GABRG2基因和蛋白表达显着降低,可能由此影响突触后膜相关蛋白的表达,从而改变离子通道和突触功能。3.突变GABRG2（F343L）转基因斑马鱼转录组发生改变。4.SAHA对突变GABRG2（F343L）转基因斑马鱼具有抗癫痫治疗作用。
李玉霞[8]（2020）在《家蚕BmClC-2基因的克隆、鉴定及功能研究》文中研究说明电压门控氯离子通道蛋白（voltage-gated chloride channel,Cl C）属于氯离子通道蛋白中的一个大家族,普遍存在于真核与原核生物中,主要位于各类细胞的细胞质膜或器膜上,可调控不同的生理过程和细胞功能。氯离子通道蛋白2（Chloride channel protein 2,Cl C-2）是电压门控氯离子通道家族的一员。迄今为止,虽然对Cl C-2基因和蛋白质分子结构的研究取得了一些进展,但其结构、功能及调节机制等仍不完全清楚。目前对Cl C-2的研究主要集中在人类、小鼠和植物中,在昆虫中几乎没有报道。家蚕（Bombyx moir）是最早完成基因组测序的鳞翅目昆虫,完善的基因组、表达谱和蛋白组数据库为家蚕基因的功能研究提供了重要的平台。本研究利用生物信息学技术鉴定了家蚕Cl C家族基因,并探究了Cl C-2基因功能。1、对家蚕基因组进行筛选,首次鉴定到3个Bm Cl C基因家族成员,分别位于第1、17和27号染色体上;并依据Bm Cl Cs基因的蛋白质序列进行初步聚类,这3个基因的外显子内含子数目不一样,3个Bm Cl C蛋白为疏水性蛋白,且具有相似的蛋白保守结构域,但仍然存在基序的多样性,它们有可能作为潜在的蛋白质-蛋白质间的相互作用结构域辅助Cl C蛋白的作用。利用Real-time PCR技术分析了3个Bm Cl C基因在家蚕9个组织的表达情况,结果表明3个Bm Cl C基因在脂肪体的表达量最高,推测Bm Cl Cs可能在家蚕营养运输过程中起着关键作用。2、对位于27号染色体上的Bm Cl C基因家族中的Bm Cl C-2（BGIBMGA004625）基因进行全长克隆,得到家蚕BY品种中该基因全长是4808 bp,开放阅读框的为2865 bp,起始密码子位于全长的第310-312位,终止密码子位于第3170-3172位,编码区由954个核苷酸组成;XBY品种中Bm Cl C-2基因全长是4774 bp,开放阅读框与BY品种相同,起始密码子位于全长的第284-286位,终止密码子位于第3144-3146位,编码954氨基酸。将以BY为模板扩增得到的Bm Cl C-2基因全长序列提交到NCBI,Gen Bank登录号为MT353899。对家蚕Bm Cl C-2基因的序列进行分析,经比对得到的两个家蚕品种的Bm Cl C-2编码区,发现在第933氨基酸位点有一个有义突变,但蛋白质的二级结构无变化,两个品种的非编码区都有缺失和增多的部分,有待于进一步研究。生物信息学分析表明,Bm Cl C-2编码954个氨基酸残基,分子量是105.76 k D,理论等电点是9.48,平均亲水性值为0.11127,为疏水蛋白,存在Cl C-1-like、Vottage-CLC、Clc A、PRK05227、CBS等结构域,定位于细胞膜,无信号肽,存在12次跨膜结构,同时对Bm Cl C-2的抗原表位区进行预测,通过综合分析,将640-855 aa作为抗原区段。对Bm Cl C-2全组织表达情况进行RT-PCR和q PCR研究发现,Bm Cl C-2基因在两个品种的9个组织中均有不同程度的的表达,且在中肠、马氏管和生殖腺的表达量较高,添家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus,Bm NPV）24小时后,两个品种中的Bm Cl C-2基因表达量差异最大的是中肠、生殖腺和气管丛。3、构建p ET-28a（+）-Bm Cl C-2原核表达载体,高效表达重组融合蛋白,并纯化含His标签的重组Bm Cl C-2蛋白,制备特异性良好,效价较高（1:288650）的多克隆抗体,为分析该蛋白在家蚕中的功能奠定了基础。4、通过对Bm Cl C-2在家蚕各发育时期及2个品种五龄幼虫经Bm NPV处理后各组织中的表达情况进行研究,发现该蛋白在家蚕蛾期几乎不表达,卵期表达量最高,2个品种经Bm NPV侵染与未侵染,该蛋白在各组织均有不同程度的改变。表达图谱分析表明Bm Cl C-2在卵期胚胎发育的营养运输过程中可能起着很大的作用,Bm NPV会影响该蛋白在各个组织的表达。RNA干扰后,荧光显微镜下观察XBY的血细胞呈绿色荧光,表明其血细胞中存在Bm NPV,说明Bm Cl C-2被干扰后抗性品种XBY失去对Bm NPV抗性;个体存活率调查也证明,Bm NPV侵染的XBY品种个体最终被病毒感染而亡,初步证实了Bm Cl C-2在家蚕抗Bm NPV过程中可能起到一定作用。
秦洋洋[9]（2020）在《222例初诊癫痫患儿临床特点与诊治分析》文中研究指明背景癫痫（Epilepsy,EP）是世界上最古老的疾病之一,其文字记录最早可以追溯到公元前4000年[1]。它是一种发病机制复杂、反复癫痫发作为特点的慢性脑部疾病,可由多种因素造成,在各个年龄、地区和种族均有发病。2017年国际抗癫痫联盟（International League Against Epilepsy,ILAE）对癫痫发作类型及癫痫进行重新修订[2],主要分为局灶性起源、全面性起源、未知起源三种类型。而对癫痫的诊断尽可能从癫痫发作类型、癫痫类型、癫痫综合征、病因、共患病等进行[3]。研究表明,全世界共约有7000万癫痫患者,超过一半的患者出现在发展中国家[4]。在我国,癫痫患者超过900万,其中活动性癫痫650万[5]。癫痫在儿童时期发病率最高,儿童时期随着年龄的增长发病率逐渐下降[6],随着人口老龄化,癫痫在老年人群中的发病率呈上升趋势。研究表明,约60%的癫痫起源于儿童时期,而儿童作为家庭的希望,祖国的未来,一旦患病,不仅给家庭及社会带来了巨大的负面影响,同时可能会对儿童的心理健康产生影响。由于我国各地区经济、文化发展水平不同,各地区医疗水平及医疗条件不尽相同,而河南省作为农业及人口大省,医疗条件相对落后,癫痫作为一种难治性、慢性疾病,其诊疗水平相对北京等一线城市存在差距。目前国内外缺少对癫痫患者的诊疗是否及时、诊断和治疗是否合理等相关问题的大样本研究。郑州大学第三附属医院小儿神经内科癫痫患儿的年门诊就诊量大,病人来自全省各地,有很强代表性及客观研究条件。因此通过对郑州大学第三附属医院初诊癫痫患儿的分析,以管窥河南省儿童癫痫整体诊疗状况,了解目前各级医院对癫痫的诊疗能力。研究目的本研究通过对省级以下级别医院转诊至我院、我院初诊的癫痫患儿的临床特点及诊治进行分析,探索河南省各级医院对儿童癫痫的诊断及治疗水平,分析影响治疗及治疗效果的高危因素,为癫痫患儿的规范性治疗及科学管理提供参考。资料与方法2018年10月-2019年1月首次在郑州大学第三附属医院小儿神经内科门诊或病房住院的诊断为癫痫的0～14岁患儿222例,填写癫痫病例调查表,收集患儿的性别、就诊年龄、起病年龄、病因、发作类型、出生史、头颅影像学检查、脑电图及治疗等资料。数据结果采用SPSS 22.0统计学软件进行分析,计数资料用例数（%）表示,单因素分析采用卡方检验进行,单因素分析后将有意义的影响因素作为自变量,治疗效果作为因变量,进行多因素Logistic回归分析,筛选出影响我院癫痫患儿治疗效果及外院治疗情况的因素。检验标准为α=0.05,以P<0.05示差异有统计学意义。结果1.调查癫痫患儿222例,男132例,女90例,男女比例:1.47:1。起病年龄:～1岁114例,>1～2岁32例,>2～3岁18例,>3～4岁10例,>4～5岁8例,>5～6岁9例,>6～7岁9例,>7～8岁7例,>8～9岁5例,>9～10岁5例,>10～11 岁 2 例,>11～12 岁 1 例,>12 岁 2 例。2.外院共就诊263例,51例误诊,212例诊断为癫痫。212例癫痫中进行发作类型诊断53例,全面性发作28例,局灶性发作22例,起始不明发作3例。病因诊断:结构性20例,遗传性3例,代谢性2例。诊断癫痫综合征9例。共患病13例。经我院诊断后,共诊断癫痫246例,24例失访,共收集有效病例222例并进行详细的分层诊断。按发作类型诊断:局灶性发作114例（51.35%）,全面性发作97例（43.69%）,起始不明发作11例（4.96%）。按病因诊断:结构性49例,遗传性19例,代谢性11例,感染性7例,免疫性2例,病因不明134例。诊断癫痫综合征62例:伴中央颞区棘波的儿童良性癫痫23例（Benign childhood epilepsy with centrotemporal spikes,BECTS）,（包括 2 例 BECT 变异型）,婴儿痉挛症17例（Infantile spasms,IS）,非综合征型早发癫痫性脑病7例,Dravet综合征 3 例,Doose 综合征 2 例,Landau-Kleffner 综合征 2 例（Landau-Kleffner syndrome,LKS）,大田原综合征2例,良性家族性婴儿型癫痫（Benign familial neonatal epilepsy,BFNE）2 例,Lennox-Gastaut 综合征 1 例（Lennox-Gastaut syndrome,LGS）,全面性癫痫伴热性惊厥附加症（Genetic epilepsy with febrile seizures plus,GEFS+）1例,癫痫性脑病伴慢波睡眠期持续棘慢波1例（Epileptic encephalopathy with continuous spike and waves during slow wave sleep,CSWS）,儿童失神癫痫1例。诊断共患病73例:认知障碍55例,抽动障碍7例,注意力缺陷多动障碍4例,孤独症谱系障碍3例,情绪障碍3例,睡眠障碍1例。3.外院诊断为癫痫的212例患儿中,117例未治疗,95例药物治疗。影响外院患儿治疗与未治疗的单因素卡方检验结果提示:癫痫发作类型、初诊医院级别、家庭经济条件比较有统计学意义（P<0.05）。4.我院222例癫痫患儿中控制113例,有效52例,无效57例。治疗有效组及治疗无效组中单因素卡方分析结果提示院外治疗经过、发作间期脑电图、癫痫综合征、遗传代谢性病因、病因明确比较有统计学意义（P<0.05）。多元Logistic回归分析提示发作间期脑电图、癫痫综合征是影响癫痫治疗效果的高危因素。5.合并癫痫共患病的患儿中,19例认知障碍患儿规律进行家庭教育,2例抽动障碍患儿口服药物治疗,1例孤独症谱系障碍患儿规律进行心理治疗。结论省级以下医院中存在癫痫误诊误治现象。癫痫发作类型、初诊医院级别、家庭经济条件影响癫痫的治疗。发作间期脑电图、癫痫综合征是影响抗癫痫药物治疗效果的高危因素。规范化、分层次诊断与癫痫的治疗效果密切相关。
张星柔[10]（2019）在《氯离子纳米通道的构建及其传输性能研究》文中进行了进一步梳理氯离子是生命体内含量最丰富的阴离子。氯离子通道普遍分布于生命体细胞的细胞膜和细胞器膜中,是氯离子出入细胞的重要方式。氯离子传输过程在生理过程中非常重要,参与多种生理活动,如:维持机体酸碱平衡;维持细胞外液渗透压;稳定神经细胞膜电位等。氯离子传输的通量为兴奋性神经传递提供了基础,对维持神经元、心脏和肌肉细胞的生理功能必不可少,细胞膜上的氯离子通道对氯离子的低透过率、低通量可导致多种疾病,如囊性纤维化病等。然而,生物氯离子通道很不稳定,难以有效地用于体外研究。因此,构建高通量的人工氯离子传输通道,有助于我们更好地了解生命活动,为解决生理和病理问题提供新的思路,是一项具有意义且充满挑战的任务。仿生人工纳米通道具有性质相对稳定、表面易于修饰的特点。特别是聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）纳米通道,可以通过简单的方法控制通道的几何形状和尺寸、修饰多种功能的表面,因此成为实现仿生通道体外研究、离子传感、构建纳米流体器件等功能的优良材料。因而,本文采用PET膜作为设计高通量的氯离子传输人工纳米通道的基础材料。我们面临的关键问题为:如何构建氯离子通道?及如何提高纳米通道中的氯离子传输通量?本论文围绕此问题开展以下研究内容:1.氯离子受体分子功能化纳米通道的构建及其氯离子传输的研究。根据氨基基团可以与氯离子发生氢键相互作用的性质,通过设计并向纳米通道中引入不同结构的与氯离子有相互作用的氨基受体分子,研究并考察其对氯离子传输通量的影响。发现氨基柱[5]芳烃功能化后的纳米通道中氯离子传输通量最高,为1.33 × 10-6 mol·cm-2·min-1,相较于功能化前和其它受体分子功能化的纳米通道,氯离子通量发生很大提高。为解释其机理根据核磁滴定实验中氢的位移发现氨基柱[5]芳烃苯环上的氢与氯离子发生了较强的相互作用,说明其空腔和链长尺寸与氯离子最为匹配,与氯离子的相互作用也最强。最后利用多物理场模拟软件（COMSOL Multiphysics）对通道内的氯离子浓度分布进行模拟,发现氨基柱[5]芳烃修饰的纳米通道中氯离子浓度更高,说明在纳米通道内修饰与氯离子结合作用强的分子,对氯离子进入纳米通道有着促进作用。为设计构建更高通量的氯离子纳米通道提供了基础。2.漏斗形结构仿生纳米通道的构建及其对氯离子传输通量的影响。通过对细胞中离子通道仿生,构建了结构仿生漏斗形的纳米通道,并通过比较不同程度的漏斗形纳米通道中的氯离子跨膜电流和通量,考察了该结构对氯离子传输通量的影响。漏斗深度比λ=0.5的漏斗形纳米通道的氯离子传输通量最大,每个通道每秒可以传输2.8×106个氯离子,相比直形纳米通道提高了 31倍,且对K+保有很好的选择性。为探究机理,利用COMSOL软件对不同结构程度的纳米通道中的情况进行模拟,发现漏斗形结构对通道内离子分布、电位差有影响,离子传输的驱动力更大。因此漏斗形结构的纳米通道使得氯离子传输通量更高。这有助于我们提高并控制离子在纳米通道中的传输通量,更好地理解离子在自然界中的迁移行为。3.哑铃形纳米通道的构建及进一步提高氯离子传输通量。由人体肾脏细胞中的CLC氯离子通道的特殊结构得到启发,研究结构仿生的哑铃形纳米通道对氯离子传输通量的影响。并比较不同程度的哑铃形结构对氯离子传输通量的影响,最终将氯离子传输通量提高到平均每个通道每秒传输9.09× 106个氯离子,已达到生命体中的离子通道通量。最后,利用COMSOL理论模拟看出哑铃形结构的纳米通道更有利于氯离子从通道中离开,因此更有利于氯离子传输,从理论模拟的角度解释了哑铃形纳米通道提高氯离子通量的原因。
二、氯离子通道与癫痫（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、氯离子通道与癫痫（论文提纲范文）
（1）GEFS+的致病基因验证和海马MRS变化与智力水平研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症致病基因的验证 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 基因异常与癫痫 |
| 1.2 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的概念 |
| 1.3 GEFS~+的致病原理 |
| 1.4 GEFS~+的相关的基因 |
| 1.4.1 编码电压门控性钠离子通道亚基的基因 |
| 1.4.2 编码配体门控性氯离子通道GABA＿A亚基的基因 |
| 1.5 钾离子通道 |
| 1.5.1 Kv通道 |
| 1.5.2 内向整流通道 |
| 第二章 研究对象 |
| 第三章 试剂和仪器 |
| 3.1 主要试剂 |
| 3.2 主要试剂盒 |
| 3.3 主要设备和仪器 |
| 3.4 相关溶液配方 |
| 3.5 生物信息途径及主要软件 |
| 第四章 实验方法 |
| 4.1 质粒构建 |
| 4.1.1 载体的线性化及infusion反应 |
| 4.1.2 目的片段和载体的连接--Fast-Fusion~(TM)反应 |
| 4.1.3 转化 |
| 4.1.4 PCR法筛选重组克隆 |
| 4.1.5 质粒DNA酶切 |
| 4.2 制备慢病毒 |
| 4.2.1 培养包装细胞 |
| 4.2.2 制备DNA-EndoFectin转染复合物 |
| 4.2.3 转染包装细胞 |
| 4.2.4 收获慢病毒颗粒 |
| 4.3 慢病毒滴度检验 |
| 4.4 转染目的细胞 |
| 4.5 基因表达检测 |
| 4.5.1 RT-PCR检测 |
| 4.5.2 荧光显微镜检测 |
| 4.6 膜片钳检测 |
| 4.7 统计学分析 |
| 第五章 研究结果 |
| 5.1 KCNAB3基因突变家系资料 |
| 5.2 突变型质粒酶切鉴定 |
| 5.3 慢病毒滴度检验(荧光法) |
| 5.4 HEK293细胞的转染结果检测 |
| 5.4.1 RT-PCR检测结果 |
| 5.4.2 荧光显微镜检测 |
| 5.5 膜片钳全细胞记录检测结果 |
| 5.5.1 KCNAB3基因突变对电压依赖钾通道动力学的影响 |
| 5.5.2 电流密度的比较 |
| 第六章 讨论 |
| 6.1 电压依赖性钾离子通道 |
| 6.2 KCNAB3基因 |
| 第七章 结论 |
| 第二部分 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症患儿海马MRS变化与智力水平研究 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 GEFS~+与海马硬化的关系 |
| 1.2 海马的结构与功能 |
| 1.3 磁共振波谱(Magnetic Resonance Spectroscopy, MRS) |
| 1.4 癫痫与智力低下 |
| 1.4.1 癫痫发作与智力低下 |
| 1.4.2 癫痫持续状态与智力低下 |
| 1.4.3 热性惊厥与智力低下 |
| 第二章 研究对象及方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.1.1 试验组 |
| 2.1.2 对照组 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 视频脑电图监测 |
| 2.2.2 头颅MRI平扫+MRS检查 |
| 2.2.3 海马硬化诊断标准 |
| 2.2.4 智力测试 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第三章 研究结果 |
| 3.1 GEFS~+家系临床表型分析 |
| 3.2 GEFS~+家系先证者的临床资料 |
| 3.3 GEFS~+组与对照组性别及年龄对比分析 |
| 3.4 GEFS~+组与对照组左右两侧海马波谱值对比分析 |
| 3.5 GEFS~+患儿组与对照组双侧海马波谱平均值对比分析 |
| 3.6 GEFS~+患儿组与对照组智力评估对比分析 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 GEFS~+患儿海马MRS变化分析 |
| 4.2 GEFS~+患儿智力测试分析 |
| 4.3 GEFS~+患儿海马损伤与智力关系分析 |
| 第五章 结论 |
| 创新点和不足 |
| 参考文献 |
| 综述 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症基因研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（2）利用分子折叠策略构筑人造离子通道（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 天然离子通道 |
| 1.1.1 概述 |
| 1.1.2 天然钾离子通道 |
| 1.1.3 天然钠离子通道 |
| 1.1.4 天然氯离子通道 |
| 1.2 人造离子通道 |
| 1.2.1 概述 |
| 1.2.2 人造阳离子通道 |
| 1.2.3 人造阴离子传输体系 |
| 1.2.4 本论文的立论依据 |
| 第二章 钠离子选择性增强的仿生离子通道 |
| 2.1 序言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 合成路线与表征 |
| 2.3 实验结果分析与讨论 |
| 2.3.1 离子通道结构分析 |
| 2.3.2 离子滴定数据 |
| 2.3.3 离子通道传输性能测试 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 人造双孔离子通道 |
| 3.1 序言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 合成路线及其表征 |
| 3.3 实验结构分析与讨论 |
| 3.3.1 单、双孔离子通道的结构设计 |
| 3.3.2 质谱数据分析 |
| 3.3.3 圆二(CD)色谱分析 |
| 3.3.4 离子通道传输性能测试 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 螺旋拓扑阴离子通道的设计合成 |
| 4.1 序言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 合成路线及其表征 |
| 4.3 实验结构分析与讨论 |
| 4.3.1 聚合物离子通道 |
| 4.3.2 单体与聚合物对不同离子的荧光滴定 |
| 4.3.3 离子通道传输性能测试 |
| 4.4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 作者简介 |
| 硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 癫痫的病因学研究进展 |
| 2.1.1 癫痫相关的神经结构与功能 |
| 2.1.2 脑结构性病因与癫痫 |
| 2.1.3 感染性病因与癫痫 |
| 2.1.4 免疫性病因与癫痫 |
| 2.1.5 代谢性病因与癫痫 |
| 2.1.6 遗传性病因与癫痫 |
| 2.2 NMDA受体基因变异与癫痫的相关性研究进展 |
| 2.2.1 NMDA受体的结构及功能 |
| 2.2.2 NMDA受体的分布 |
| 2.2.3 NMDA受体基因变异与癫痫 |
| 2.2.4 NMDA受体基因变异的药物调节 |
| 第3章 研究内容 |
| 3.1 细胞水平评估突变的NMDA受体功能及干预药物筛选 |
| 3.1.1 材料与方法 |
| 3.1.2 结果 |
| 3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G转基因鼠制备 |
| 3.2.1 基因信息 |
| 3.2.2 蛋白信息 |
| 3.2.3 转基因载体构建及目的基因片段的获得 |
| 3.2.4 显微注射 |
| 3.2.5 小鼠出生与检测 |
| 3.2.6 交配扩繁 |
| 3.3 转基因鼠癫痫发病机制及精准干预药物研究 |
| 3.3.1 材料与方法 |
| 3.3.2 结果 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变对 NMDA 受体功能的影响 |
| 4.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变特异性功能增强剂的筛选 |
| 4.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠行为学改变 |
| 4.3.1 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠癫痫发作的特点 |
| 4.3.2 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠认知功能变化 |
| 4.3.3 GluN2A/GRIN2A-V685G突变小鼠抑郁行为的表现 |
| 4.4 通过在体及离体电生理学检测探讨 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠癫痫发病的机制 |
| 4.5 依法韦仑(EVF)对 GluN2A/GRIN2A-V685G 突变小鼠行为学、电生理的影响及应用前景 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）GABRG2突变导致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）的分子遗传学特征及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 构建GABRG2 敲除细胞系及探讨温度对相关蛋白的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 GABRG2 基因敲除对HT22 细胞突触囊泡释放及功能的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 构建GABRG2敲除小鼠模型及探讨温度对小鼠癫痫行为的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 GABRG2 基因敲除小鼠的表观遗传学特征 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| GABRG2 基因突变致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症的分子遗传学研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 个人简介 |
| 开题、中期及学位论文答辩委员组成 |
（5）SLE患者皮损表现与其他临床特征的相关性（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一部分 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 局限性 |
| 创新性 |
| 参考文献 |
| 附录 SLE调查问卷 |
| 综述 红斑狼疮皮损与临床特征的相关性 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（6）Nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验相关试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验主要试剂 |
| 2.1.2 实验主要仪器 |
| 2.2 生物信息学和计算机软件 |
| 2.3 实验动物 |
| 2.3.1 小鼠模型构建 |
| 2.3.2 小鼠饲养 |
| 2.3.3 小鼠癫痫模型构建 |
| 2.4 实验方法 |
| 2.4.1 Nedd4-2+/-(KO)和Nedd4-2+/+(WT)小鼠鉴定 |
| 2.4.2 动物取材 |
| 2.4.3 Label-free定量蛋白组学检测 |
| 2.4.4 生信分析 |
| 2.4.5 细胞和组织蛋白提取 |
| 2.4.6 BCA蛋白浓度测定 |
| 2.4.7 细胞培养 |
| 2.4.8 细胞转染 |
| 2.4.9 质粒提取 |
| 2.4.10 免疫共沉淀 |
| 2.4.11 Western Blot |
| 2.4.12 组织总RNA提取 |
| 2.4.13 逆转录反应和实时定量荧光PCR反应 |
| 2.4.14 免疫组化 |
| 2.4.15 尼氏染色 |
| 2.4.16 全细胞膜片钳记录 |
| 2.5 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Nedd4-2+/-小鼠表现出Nedd4-2 单倍剂量不足 |
| 3.2 Nedd4-2 单倍剂量不足导致癫痫易感性增加 |
| 3.3 PTZ诱导癫痫小鼠的海马蛋白组学分析 |
| 3.4 Nedd4-2介导的泛素化受损导致Kir4.1表达上调 |
| 3.5 敲低Nedd4-2使Kir4.1的泛素化水平降低 |
| 3.6 Nedd4-2通过苏氨酸312-脯氨酸基序与Kir4.1相互作用 |
| 3.7 14-3-3蛋白部分促进了Nedd4-2介导的Kir4.1的泛素化 |
| 3.8 Kir5.1于脑组织及c6细胞低表达 |
| 3.9 全细胞膜片钳记录 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 泛素蛋白酶体途径在癫痫发病机制中的作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）GABRG2突变斑马鱼癫痫模型的构建及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 试剂与耗材 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Gateway入门克隆质粒来源 |
| 2.2.2 LR反应构建质粒 |
| 2.2.3 Tol2 mRNA制备 |
| 2.2.4 显微注射 |
| 2.2.5 单克隆筛选鉴定 |
| 2.2.6 行为学实验 |
| 2.2.7 药物治疗实验 |
| 2.2.8 原位杂交c-fos探针制备 |
| 2.2.9 整体原位杂交(Whole-mount RNA in suit hybridization,WISH) |
| 2.2.10 实时定量qPCR |
| 2.2.11 Western Blot |
| 2.2.12 免疫荧光组织化学 |
| 2.2.13 转录组测序 |
| 2.2.14 统计学分析 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 转基因斑马鱼的构建及鉴定 |
| 3.2 转基因斑马鱼的表型分析 |
| 3.3 行为学指标 |
| 3.3.1 转基因斑马鱼基础游泳行为分析 |
| 3.3.2 光闪刺激对转基因斑马鱼游泳行为的影响 |
| 3.3.3 昼夜节律对转基因斑马鱼游泳行为的影响 |
| 3.3.4 PTZ对转基因斑马鱼游泳行为的影响 |
| 3.4 癫痫发作标志性基因表达 |
| 3.5 转基因斑马鱼GABA_A受体亚基表达 |
| 3.5.1 GABA_A受体亚基基因表达 |
| 3.5.2 GABA_A受体亚基蛋白表达 |
| 3.6 转基因斑马鱼突触相关蛋白的表达 |
| 3.7 转基因斑马鱼脑组织 |
| 3.7.1 转录组测序分析72 hpf转基因斑马鱼脑差异表达基因 |
| 3.7.2 转录组测序分析72 hpf差异基因的验证 |
| 3.7.3 转录组测序分析120 hpf转基因斑马鱼脑差异表达基因 |
| 3.7.4 转录组测序分析120hpf的差异基因的验证 |
| 3.8 抗癫痫药物治疗 |
| 3.8.1 传统抗癫痫药物治疗 |
| 3.8.2 SAHA治疗作用 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 附录 |
| 综述 GABRG2突变在遗传性癫痫中发生的机制研究 |
| 综述参考文献 |
| 在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目 |
| A:在国内外刊物上发表的论文 |
| B:所参加的项目 |
| 致谢 |
（8）家蚕BmClC-2基因的克隆、鉴定及功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 氯离子通道的研究进展 |
| 1.2 电压门控氯离子通道(ClC)蛋白的研究进展 |
| 1.2.1 ClC通道蛋白的分类及组织分布 |
| 1.2.2 ClC蛋白的结构 |
| 1.2.3 ClC通道蛋白的生物学功能 |
| 1.3 氯离子通道蛋白2的研究进展 |
| 1.3.1 ClC-2的结构 |
| 1.3.2 ClC-2的分布与调节 |
| 1.3.3 ClC-2与疾病 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 主要研究内容及技术路线 |
| 1.5.1 主要研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 家蚕ClC基因家族的鉴定及表达分析 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器试剂 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 家蚕ClC基因家族的鉴定 |
| 2.3.2 家蚕ClC基因家族构建NJ系统进化树 |
| 2.3.3 家蚕ClCs基因结构及染色体定位分析 |
| 2.3.4 家蚕ClC基因表达分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 家蚕ClC基因的鉴定及序列分析 |
| 2.4.2 家蚕ClCs基因结构、保守基序及进化树分析 |
| 2.4.3 家蚕ClCs染色体定位分析 |
| 2.4.4 家蚕ClCs基因在不同组织的表达分析 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 BmClC-2基因的全长克隆、生物信息分析及表达分析 |
| 3.1 实验材料与仪器 |
| 3.1.1 实验材料及处理 |
| 3.1.2 主要仪器与设备 |
| 3.2 主要试剂及配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 总RNA提取 |
| 3.3.2 BmClC-2基因编码区克隆 |
| 3.3.3 BmClC-2 基因非翻译(UTR)区的克隆 |
| 3.3.4 BmClC-2基因的生物信息学分析 |
| 3.3.5 两个品种BmClC-2基因表达谱分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 总RNA质量检测 |
| 3.4.2 BmClC-2基因编码区克隆结果 |
| 3.4.3 BmClC-2 基因5’RACE和3’RACE克隆 |
| 3.4.4 BmClC-2 基因cDNA全长拼接结果 |
| 3.4.5 家蚕BmClC-2基因的序列分析结果 |
| 3.4.6 BmClC-2基因在2个品种中的表达图谱分析 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 BmClC-2基因的原核表达与抗体制备 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 试剂 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.2.4 主要试剂配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 RNA提取与反转录反应 |
| 4.3.2 PCR扩增反应 |
| 4.3.3 目的基因BmClC-2与载体的纯化、酶切、连接 |
| 4.3.4 连接产物的转化 |
| 4.3.5 重组质粒的鉴定 |
| 4.3.6 BmClC-2蛋白的诱导表达与纯化 |
| 4.3.7 抗体的制备 |
| 4.3.8 抗体特异性的Western blotting鉴定 |
| 4.3.9 间接ELISA法测定抗体效价 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 BmClC-2 基因PCR扩增片段 |
| 4.4.2 重组质粒p ET-28a(+) -BmClC-2 鉴定 |
| 4.4.3 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达与纯化 |
| 4.4.4 融合蛋白的Western blotting检测 |
| 4.4.5 多抗的效价检测 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 家蚕BmClC-2 基因的表达谱分析和RNAi研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 主要试剂 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 家蚕各时期及各组织蛋白提取 |
| 5.3.2 总蛋白浓度定量 |
| 5.3.3 家蚕BmClC-2在各发育时期的表达分析 |
| 5.3.4 家蚕BmClC-2 在经过BmNPV处理后的家蚕各组织中的表达分析 |
| 5.3.5 RNA干扰BmClC-2对XBY抗性的影响 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 家蚕BmClC-2在各发育时期的表达分析 |
| 5.4.2 BmClC-2在BY与 XBY品种中BmNPV处理后各组织中的表达分析 |
| 5.4.3 RNA干扰BmClC-2 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的学位论文 |
| 致谢 |
（9）222例初诊癫痫患儿临床特点与诊治分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 1 引言 |
| 2 资料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 研究局限性 |
| 参考文献 |
| 附表1 癫痫病例调查表 |
| 综述 儿童癫痫的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及攻读硕士期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）氯离子纳米通道的构建及其传输性能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生命体离子通道 |
| 1.1.1 离子通道概述 |
| 1.1.2 生命体内的氯离子通道 |
| 1.1.3 氯离子通道研究进展与意义 |
| 1.2 仿生离子纳米通道 |
| 1.2.1 仿生离子纳米通道膜材料 |
| 1.2.2 仿生离子纳米通道的功能化设计 |
| 1.2.3 仿生离子纳米通道的结构设计 |
| 1.2.4 仿生离子纳米通道的理论模拟方法 |
| 1.3 仿生离子纳米通道研究进展与应用 |
| 1.4 柱芳烃的研究现状 |
| 1.4.1 柱芳烃分子的特性 |
| 1.4.2 柱芳烃分子的主客体相互作用 |
| 1.5 本文选题思路 |
| 1.6 论文创新点 |
| 第二章 功能化的人工纳米通道的构建及其氯离子传输的研究 |
| 2.1 序言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验主要试剂和仪器 |
| 2.2.2 银/氯化银(Ag/AgCl)电极的制备 |
| 2.2.3 电流测试仪器 |
| 2.2.4 PET直形人工纳米通道的制备 |
| 2.2.5 氯离子氨基受体分子的合成路线 |
| 2.2.6 功能化人工纳米通道的构建 |
| 2.2.7 人工纳米通道在功能化前后的响应性能测试 |
| 2.2.8 氯离子在功能化前后的人工纳米通道跨膜电流及传输通量测试 |
| 2.2.9 接触角(CA)及荧光共聚焦(LSCM)测试 |
| 2.3 实验结果与讨论 |
| 2.3.1 直形PET人工纳米通道的构建及表征 |
| 2.3.2 氯离子氨基受体分子的修饰及表征 |
| 2.3.3 氯离子在不同氨基受体分子功能化的人工纳米通道中的传输通量 |
| 2.3.4 核磁滴定氯离子与受体分子的主客体相互作用 |
| 2.3.5 功能化人工纳米通道对氯离子传输通量影响的理论模拟 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 漏斗形结构仿生纳米通道的构建及其对氯离子传输通量的影响 |
| 3.1 序言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验主要试剂和仪器 |
| 3.2.2 漏斗形结构人工纳米通道的制备 |
| 3.2.3 氨基柱[5]芳烃分子修饰的纳米通道的构建 |
| 3.2.4 不同尺寸的漏斗形结构对氯离子通量的测试 |
| 3.2.5 X射线衍射光电子能谱(XPS)测试 |
| 3.3 实验结果与讨论 |
| 3.3.1 不同程度漏斗形结构纳米通道的构建及表征 |
| 3.3.2 NH_2-P[5]功能化的人工纳米通道的表征 |
| 3.3.3 漏斗形结构对氯离子传输通量的影响 |
| 3.3.4 漏斗形结构提高氯离子传输通量的机理探究 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 哑铃形结构仿生纳米通道的构建及进一步提高氯离子传输通量 |
| 4.1 序言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验主要试剂和仪器 |
| 4.2.2 哑铃形结构人工纳米通道的制备 |
| 4.2.3 不同尺寸的哑铃形结构对氯离子通量的测试 |
| 4.3 实验结果与讨论 |
| 4.3.1 不同程度哑铃形结构纳米通道的构建及表征 |
| 4.3.2 NH_2-P[5]功能化的人工纳米通道的表征 |
| 4.3.3 哑铃形结构对氯离子传输通量的影响 |
| 4.3.4 漏斗形结构提高氯离子传输通量的机理探究 |
| 4.4 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、氯离子通道与癫痫（论文参考文献）
- [1]GEFS+的致病基因验证和海马MRS变化与智力水平研究[D]. 丁健. 南方医科大学, 2021(02)
- [2]利用分子折叠策略构筑人造离子通道[D]. 李汶灿. 吉林大学, 2021(01)
- [3]NMDA受体亚基GluN2A/GRIN2A功能丧失型基因突变所致癫痫的发病机制及精准药物干预研究[D]. 赵腾. 吉林大学, 2021(01)
- [4]GABRG2突变导致遗传性癫痫伴热性惊厥附加症（GEFS+）的分子遗传学特征及机制研究[D]. 李信晓. 宁夏医科大学, 2021(02)
- [5]SLE患者皮损表现与其他临床特征的相关性[D]. 江东. 昆明医科大学, 2021(01)
- [6]Nedd4-2介导Kir4.1通道蛋白泛素化修饰对癫痫发病机制的研究[D]. 张贺博. 中国医科大学, 2021(02)
- [7]GABRG2突变斑马鱼癫痫模型的构建及机制研究[D]. 陈娟. 南通大学, 2020
- [8]家蚕BmClC-2基因的克隆、鉴定及功能研究[D]. 李玉霞. 江苏科技大学, 2020(03)
- [9]222例初诊癫痫患儿临床特点与诊治分析[D]. 秦洋洋. 郑州大学, 2020(02)
- [10]氯离子纳米通道的构建及其传输性能研究[D]. 张星柔. 华中师范大学, 2019(02)