一、小鼠肝癌H_(22)细胞克隆株的选择及其细胞特性比较（论文文献综述）
王珂欣[1]（2021）在《基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制》文中研究表明选题依据:肝癌是世界上流行最高的10种恶性肿瘤之一,死亡率在消化系统恶性肿瘤中位居第二,发病率有上升趋势,而我国每年新发病例占全球一半以上。目前肝癌的治疗手段主要有外科手术切除及放、化疗等,但患者5年内生存率低于30%。因此,探索肝癌发病机制和防治肝癌药物作用机制,是提高肝癌患者生存率和解决临床用药问题的迫切需求。复方苦参注射液在中国已有超过15年的临床应用历史,用于治疗多种类型的实体肿瘤,尤其是癌肿疼痛和消化系统肿瘤中的肝癌。临床研究表明复方苦参注射液可以改善中晚期肝癌患者的症状,且辅助双介入治疗,联合动脉灌注栓塞术,联合化疗均有显着的疗效。实验药理研究表明复方苦参注射液对H22肝癌荷瘤小鼠模型具有抑瘤作用,可显着抑制肝癌细胞增殖,且调控细胞周期。然而,复方苦参注射液在其它肝癌动物模型中是否具有抑制作用?是否具有抑制肝癌转移的作用?除调控凋亡和周期相关信号通路之外,其抑制肝癌细胞增殖及转移的具体机制还有哪些?其抗肝癌的药效物质基础是什么?这些关键科学问题仍然不清晰,需要进行深入、系统的研究。本研究首先从体内外明确了复方苦参注射液抗肝癌的作用;其次,采用计算系统药理学模型预测了复方苦参注射液抗肝癌的药效成分群;最后,基于定量成分导向的网络药理学方法预测了复方苦参注射液抗肝癌的作用机制并进行了验证。研究结果为复方苦参注射液抗肝癌临床用药提供新的科学依据,为进一步开发组分新药提供物质基础,同时也将为其他中药注射剂防治肿瘤研究提供研究思路。目的:（1）明确复方苦参注射液抗肝癌药理作用。（2）构建计算系统药理学模型,探寻复方苦参注射液抗肝癌的药效成分群。（3）基于定量成分导向的网络药理学方法阐释复方苦参注射液抗肝癌的作用机制。方法:（1）通过肝癌细胞增殖和克隆形成实验,以及对二乙基亚硝胺诱发肝癌大鼠肝脏组织的一般和病理学观察及血清生化指标,明确复方苦参注射液对肝癌细胞和大鼠的抑制作用;通过细胞粘附、伤口愈合细胞划痕、Transwell侵袭以及趋化运动实验,明确复方苦参注射液对肝癌细胞侵袭转移的作用。（2）采用计算系统药理学模型,将代谢组学分析、数据收集、网络算法、生物信息学工具相结合,使用一种称为Dijkstra算法模拟药物靶点对疾病分子网络的传播效应,识别出复方苦参注射液抗肝癌药效成分群。（3）通过对复方苦参注射液中高含量成分进行抗肝癌活性筛选,聚焦含量高且活性强的成分,采用网络药理学方法预测复方苦参注射液抗肝癌作用的关键靶点和通路,采用蛋白质免疫印迹技术对预测关键靶点和Wnt/β-catenin信号通路进行体内外验证,明确复方苦参注射液调节Wnt/β-catenin信号通路抗肝癌的机制。采用代谢组学技术,分析复方苦参注射液对差异代谢物的调节作用,阐明复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的作用机制。最后,整合分析复方苦参注射液抗肝癌作用机制。结果:（1）2 mg/mL复方苦参注射液能显着抑制人肝癌细胞SMMC-7721的增殖和克隆形成;1.5和3 mL/kg复方苦参注射液可改善二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠肝细胞结构的损伤,并不同程度回调肝功能相关指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）和γ-谷酰基转肽酶（γ-GT）的水平,表明复方苦参注射液具有抑制肝癌生长的作用。1和2 mg/mL复方苦参注射液具有显着抑制肝癌细胞迁移、侵袭和趋化运动能力,能显着增加细胞-细胞粘附和抑制细胞-基质粘附,表明复方苦参注射液具有抑制肝癌侵袭转移的作用。（2）基于UPLC-MS鉴定出复方苦参注射液中的21个化学成分,多个数据库预测了复方苦参注射液21个化学成分的作用靶点,构建了复方苦参注射液的成分-靶点网络。随后整合了复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的277个基因作为疾病基因,基于蛋白-蛋白相互作用数据构建了一个全面的复方苦参注射液成分-靶点-互作蛋白-疾病基因网络,并应用Dijkstra算法计算成分的靶点传播到疾病分子网络的最短距离链17412条,从而根据传播系数识别出11个药效成分群:槐定碱、9β-hydroxylamprolobine、苦参碱、槐醇、异苦参碱、（-）-乙酰鹰靛叶碱、N-甲基金雀花碱、氧化槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐醇和（-）-oxylehmannine,并从致病基因和功能通路的覆盖率验证了药效成分群的准确性和可靠性。（3）对复方苦参注射液中含量高的5个化合物进行抗肝癌活性筛选,对具有显着肝癌抑制活性的苦参碱、氧化苦参碱、槐定碱和N-甲基金雀花碱进行网络药理学分析。通过构建复方苦参注射液抗肝癌靶点-相关蛋白网络,预测出关键靶点,在肝癌细胞和大鼠上验证,结果表明复方苦参注射液可以显着增加肝癌细胞和大鼠中CASP3的表达,抑制MMP2,MYC和REG1A的表达。通过对关键蛋白的深入验证发现复方苦参注射液可通过下调细胞和大鼠中Vimentin的表达,增加E-cadherin的表达来抑制上皮间质转化过程。此外,复方苦参注射液可以显着调节细胞和大鼠中Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin和GSK-3β及下游蛋白COX2的表达。同时,复方苦参注射液可显着阻滞Wnt/β-catenin信号通路激活剂LiCl所致的肝癌细胞中β-catenin和COX2表达水平的升高和GSK-3β表达水平的降低;可抑制LiCl所致的肝癌细胞中上皮间质转化过程、迁移和侵袭作用,表明复方苦参注射液可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路发挥抗肝癌侵袭转移作用。对网络药理学预测的靶点进行通路富集分析,发现复方苦参注射液发挥抗肝癌作用可能与调节代谢通路相关。肝癌大鼠血清和肝脏代谢组学结果表明复方苦参注射液均能显着调节两种样本中差异代谢物柠檬酸和乳酸的含量,改善肝癌的代谢紊乱,其机制可能涉及糖酵解过程关键代谢物和代谢酶,且Wnt/β-catenin信号通路关键下游靶点c-Myc可能介导复方苦参注射液对糖酵解的抑制作用。对复方苦参注射液抗肝癌作用机制整合分析,表明复方苦参注射液可能通过调节β-catenin/c-Myc信号通路,进而干预肝癌代谢重编程和抑制EMT过程来发挥抗肝癌作用。结论:（1）复方苦参注射液对肝癌细胞和二乙基亚硝胺诱发肝癌大鼠具有抑制作用,具有抑制肝癌细胞侵袭转移的作用。（2）复方苦参注射液抗肝癌的主要药效成分可能为槐定碱、苦参碱、氧化苦参碱、N-甲基金雀花碱,次要药效成分为槐醇、异苦参碱、（-）-乙酰鹰靛叶碱、氧化槐定碱、氧化槐醇、9β-hydroxylamprolobine和（-）-oxylehmannine。（3）复方苦参注射液可能通过调节β-catenin/c-Myc信号通路中关键蛋白,进而干预肝癌代谢重编程和抑制上皮间质转化过程来发挥抗肝癌作用。（4）本研究提出的计算系统药理学模型可用于中药复方物质基础的研究;定量成分导向网络药理学方法可用于预测成分含量明确的中药复方作用机制。
梁清乐[2]（2020）在《肿瘤细胞来源微颗粒的软硬度调控纳米药物递送效率》文中研究指明传统化疗药物由于不能在肿瘤部位高度富集及其毒副作用,影响其治疗效果。纳米载药系统能提高化疗药物在肿瘤组织的渗透和滞留,但仍面临肿瘤部位的蓄积不多和不能深部穿透等问题,也不能将药物进一步靶向肿瘤深部存在的肿瘤再生细胞（tumour repopulating cells,TRCs）。因此理想的靶向TRCs的纳米药物需克服体内系列生理屏障并被TRCs有效摄取。微颗粒（microparticles,MPs）是细胞受到应激时释放的一种胞外囊泡,由于具有良好的生物相容性、内在靶向性和较低的免疫原性,是一种极具潜力的药物传递载体。文献报道普通肿瘤细胞来源的MPs（2D-MPs）负载抗肿瘤药物能大量杀死肿瘤细胞,临床研究呈现优良的抗肿瘤效果。基于纳米载药系统生物力学特性,如软硬度深刻影响纳米药物体内过程的认识,本文利用三维软纤维蛋白胶（90 Pa）分选技术,制备了软的TRCs来源的MPs（3D-MPs）。研究发现3D-MPs比2D-MPs更加柔软,并具有更强的形变能力。在体内和体外实验中,我们发现这种软的3D-MPs能更多在肿瘤组织蓄积,更容易穿越肿瘤血管进入肿瘤深部,并且更多地被TRCs摄取,因而负载药物能发挥更优良的抗肿瘤效果。进一步研究发现细胞骨架相关蛋白cytospin-A在调控3D-MPs软硬度中发挥重要的作用。本文主要研究内容以及结果如下:1、TRCs来源的载药3D-MPs的表征及药效学研究应用力学筛选的方法,在软三维纤维蛋白胶（90Pa）中培养得到了H22和B16-F10TRCs,并且成功在体外用无血清培养基扩大培养,得到大量的TRCs。将化疗药物与TRCs共孵育,并采用紫外线诱导,制备得到了载阿霉素（doxorubicin,DOX）和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）的DOX@3D-MPs和5-FU@3D-MPs,其载药量分别为每微克3D-MPs蛋白包载0.06μg DOX和0.04μg 5-FU。DOX@3D-MPs粒径约510-540nm,zeta电位为-25～-30mV,并且在生理环境下7d后仍能保持比较好的稳定性,在酸性的溶酶体环境下能比较多地释放药物。针对不同肿瘤模型,如不同肿瘤大小的H22皮下瘤模型以及B16-F10黑色素瘤肺转移模型,DOX@3D-MPs相比于游离的DOX、DOX@2D-MPs和高剂量的商品化脂质体阿霉素（Doxil）,都表现出更强的抗肿瘤效果。同时,3D-MPs包载其它化疗药物,如5-FU也在H22肝癌皮下瘤模型中显示出良好的抗肿瘤效果。并且相比高剂量Doxil的明显毒性,DOX@3D-MPs显示出很好的生物安全性,也不会在动物体内形成肿瘤。2、3D-MPs的体内过程研究DOX@3D-MPs在肿瘤组织高度富集,其在肿瘤部位富集量的药时曲线下面积（area under the curve,AUC）值大约是DOX、DOX@2D-MPs和Doxil的38.9、3.1和6.7倍。进一步的肿瘤组织切片分析发现,DOX@3D-MPs组在肿瘤组织血管外较远的区域有较多的DOX红色荧光信号,而游离DOX和Doxil组血管外区域几乎没有荧光信号。小鼠背部肿瘤皮窗模型和斑马鱼肿瘤模型也发现DOX@3D-MPs组中DOX很快从肿瘤血管渗出并渗透到肿瘤深部。体外肿瘤3D球模型也证实DOX@3D-MPs能深部穿透肿瘤组织。体外细胞实验结果表明,DOX@3D-MPs被肿瘤细胞和TRCs大量摄取,并且在较低的浓度下对肿瘤细胞和TRCs有强的杀伤效果,但其对RAW264.7巨噬细胞和ECV304内皮细胞的毒性很低。体内动物实验结果表明,相比于游离DOX、DOX@2D-MPs和高剂量的Doxil,DOX@3D-MPs在肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞中蓄积量最大,而在肿瘤巨噬细胞、基质细胞和免疫细胞中蓄积量很低。并且DOX@3D-MPs大量杀伤肿瘤细胞和TRCs,而较小引起巨噬细胞和内皮细胞的凋亡。通过胞内过程研究显示,这种细胞杀伤机制可能与DOX@3D-MPs进入细胞后先进入溶酶体,释放药物进入细胞核杀伤细胞有关。3、软硬度对3D-MPs体内过程影响的研究采用原子力显微镜发现3D-MPs的杨氏模量约为2D-MPs的1/3,说明3D-MPs较软。并且与2D-MPs相比,在低渗溶液中3D-MPs的粒径明显增大,而在高渗溶液中3D-MPs的粒径又显着缩小,说明3D-MPs具有良好的可变形性。动物和细胞实验发现,3D-MPs较2D-MPs有更多的肿瘤蓄积、更容易穿透肿瘤血管和穿透进入深部、更多地被肿瘤细胞及TRCs摄取。但是当用Jasplakinolide（Jasp,可诱导肌动蛋白聚合成微丝）处理3D-MPs使其变硬后,其在肿瘤部位蓄积、肿瘤深部穿透及被肿瘤细胞及TRCs摄取能力都降低,而Latrunculin A（LatA,阻断肌动蛋白聚合）处理2D-MPs使其变软后,其在肿瘤部位蓄积、肿瘤深部穿透及被肿瘤细胞及TRCs摄取能力均增加。并且发现巨噬细胞对3D-MPs的摄取要明显少于2D-MPs,但对Jasp处理的3D-MPs摄取增加,而对LatA处理的2D-MPs摄取减少。上述研究说明软硬度影响3D-MPs的体内过程,也为阐明载药3D-MPs具有更好抗肿瘤效果提供依据。4、调控3D-MPs软硬度的分子机制研究为了探讨3D-MPs柔软的分子机制,采用同位素标记相对与绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation,i TRAQ）方法对2D-MPs和3D-MPs的蛋白质组学进行分析,并采用western blot进行验证,发现cytospin-A在3D-MPs表达量比2D-MPs中低。采用siRNA干扰的方法抑制H22细胞内的cytospin-A的表达,发现抑制cytospin-A的表达后其分泌的MPs（2D-MPs cytospi-A siRNA）变得更加柔软,具有与3D-MPs相近的杨氏模量。动物实验发现,相对于2D-MPs,2D-MPs cytospi-A siRNA在肿瘤部位蓄积及深部穿透能力增强、被肿瘤细胞及TRCs的摄取增多。进一步将变软的2D-MPs cytospi-A siRNA包载DOX后,也发现DOX在肿瘤蓄积、肿瘤深部穿透、被肿瘤细胞及TRCs的摄取能力增强。且DOX@2D-MPs cytospin-A siRNA抗肿瘤效果显着强于DOX@2D-MPs,几乎和DOX@3D-MPs的药效相当。经DOX@2D-MPs cytospin-A siRNA治疗后,肿瘤组织中肿瘤细胞在三维软纤维蛋白胶（90Pa）中形成的肿瘤细胞球数量和大小明显降低,说明其对TRCs的杀伤明显增强。上述结果说明cytospin-A在调控MPs的软硬度、影响其体内过程及载药MPs的抗肿瘤效果上发挥重要作用。本文的研究将为软硬度可调的新型纳米载药系统构建提供新思路,并为发展一类新型高效的靶向TRCs载药系统提供依据。
杨培伟[3]（2019）在《半枝莲和白花蛇舌草提取物对HBV相关性肝细胞癌的作用及对circRNAs差异表达的影响》文中研究指明目的:探索半枝莲、白花蛇舌草、半枝莲+白花蛇舌草提取物在体内外水平上的抗肝细胞癌（HCC）活性、抗HBV活性及从circ RNAs调控角度,探讨半白提取物对HCC生长的可能分子作用机制,为半白提取物治疗HCC的作用机制研究提供理论基础。方法:本研究采用完全随机的实验设计类型,1.分别通过乙醇加热回流的方法制备半枝莲、白花蛇舌草、半枝莲+白花蛇舌草提取物,并进行总黄酮及其活性成分木犀草素和芹菜素含量测定;2.通过CCK-8、平板克隆形成、流式细胞术、Transwell小室、细胞免疫荧光及裸鼠皮下接种Hep3B移植瘤模型等实验,明确半白提取物对HBV相关性Hep G2.2.15和Hep3B细胞生长、侵袭、转移、HBV活性及裸鼠移植瘤的影响;3.通过高通量测序技术对circ RNAs的差异表达进行初步检测,观察半白提取物调控Hep3B细胞circ RNAs差异表达谱变化,应用生物信息学方法预测靶基因、GO功能和KEGG信号通路,并构建circ RNA-mi RNA-gene共表达网络图。结果:1.半枝莲、白花蛇舌草及半枝莲+白花蛇舌草提取物的总黄酮含量分别为（5.69±0.34）%、（2.47±0.14）%和（5.20±0.08）%,其中木犀草素含量分别为（0.143±0.001）%、0%、（0.050±0.001）%,芹菜素含量分别为（0.182±0.003）%、0%、（0.072±0.001）%。2.与对照组相比,半白提取物在一定范围内以浓度依赖性和时间依赖性的方式抑制Hep G2.2.15和Hep3B细胞的生长,半白提取物可以抑制细胞的克隆形成率,使G0/G1期细胞比例增加和G2/M期减少,增加细胞凋亡率,抑制细胞迁移和侵袭,降低Hep3B荷瘤裸鼠肿瘤体积和移植瘤重量,降低移植瘤中Ki67、PCNA表达,增加P21、P27表达,抑制HCC细胞、移植瘤裸鼠肝组织和血清中的HBs Ag和HBV-DNA m RNA相对表达量,均具有统计学差异（P<0.05或P<0.01）;细胞增殖和凋亡有关的蛋白Cyclin D1表达稍降低,P53和Bcl-2表达降低,P21和Bax表达增加（Hep3B细胞P53缺失）;倒置显微镜、透射电子显微镜和细胞免疫荧光结果显示,经半白提取物处理后HCC细胞形态发生明显变化,核固缩,细胞数量不同程度的减少,胞质内自噬小体明显增多,自噬相关蛋白Beclin1和LC3B聚集较对照组明显减少。3.分析和鉴定出使用半白提取物前后Hep3B细胞中circ RNAs差异表达谱,GO功能和KEGG通路分析也显示了差异表达circ RNAs的生物学功能;共有5504个差异circ RNAs与751578个mi RNA靶向结合,筛选HBV相关性HCC有关的mi RNA,绘制了circ RNA-mi RNA-gene共表达网络图。结论:1.证实半白提取物中均含有总黄酮类,半枝莲的总黄酮类活性成份含有木犀草素和芹菜素,而白花蛇舌草中未检测到木犀草素和芹菜素。2.半白提取物通过抑制HCC细胞增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡,抑制HCC细胞迁移和侵袭,抑制自噬相关蛋白的表达,促进自噬小体的生成和抑制HBs Ag、HBV-DNA复制等多途径抑制Hep G2.2.15和Hep3B细胞的体内体外生长;但半枝莲和白花蛇舌草联用后在抑制HCC的体内外生长和抑制HBV活性方面未见明显的协同作用。3.发现半白提取物可调控Hep3B细胞circ RNAs差异表达,并可能通过改变多种circ RNA-mi RNA-gene共表达影响HBV相关性HCC细胞生长。
许倩倩[4]（2019）在《PID1促进胰岛素抵抗和肝癌发生的作用及机制研究》文中研究指明实验背景肥胖及胰岛素抵抗、脂肪肝已被多项研究证实具有增加肝癌发病的风险。肥胖及胰岛素抵抗主要通过激活原癌通路、诱导慢性炎症、调控表观遗传学、诱导肠道菌群紊乱和调控脂质代谢等多种途径促进肝癌的发生和发展,然而目前仍缺乏有效的靶点针对胰岛素抵抗诱导的肝癌。PID1是在肥胖患者腹部脂肪组织中发现的显着高表达的新基因,现有研究多聚焦于其促胰岛素抵抗的作用和机制上。我们的前期研究发现PID1在肿瘤细胞中相较于正常细胞有较明显的高表达,可能是潜在的促癌基因。而我们前期在自发肥胖和胰岛抵抗的ob/ob小鼠模型上已经证实干扰PID1能显着抑制小鼠体重,减少脂肪体积和重量,同时改善脂肪肝和胰岛素抵抗。目的基于前期工作,本研究将对PID1在肝癌发生发展中的作用及分子机制进行研究,同时深入探索干扰PID1改善ob/ob小鼠脂肪肝和胰岛素抵抗的机制,并初步探索胰岛素抵抗状况下PID1的促肝癌作用。方法第一,检测肝癌细胞、肝癌组织芯片及肝癌临床样本中PID1的表达;采用Ch IP确定肝癌细胞中PID1启动子区域的组蛋白H3K4me3修饰水平;构建H22皮下移植瘤模型,采用慢病毒干扰PID1的表达,检测肿瘤的体积和荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫状况;采用流体力学注射方法（hydrodynamic injection）构建肝脏特异性过表达PID1的模型,检测小鼠肝脏的病理状况、糖酵解和脂质代谢状况、原癌通路EGFR/KRAS/ERK的表达;采用免疫共沉淀检测PID1和EGFR的相互作用关系;采用sh EGFR质粒或EGFR抑制剂检测EGFR的存在对PID1促肿瘤功能的作用。第二,在PID1肝脏特异性过表达小鼠模型上检测肝脏免疫浸润的T细胞、巨噬细胞、骨髓来源抑制性细胞、调节性T细胞的比例,检测树突状细胞的表型和功能,检测肝脏炎症因子相关基因的m RNA水平,筛选PID1作用的靶细胞;检测脾脏T细胞、巨噬细胞、骨髓来源抑制性细胞、调节性T细胞的比例,血清促炎细胞因子IL6、MCP-1、TNF-α、IFN-γ、IL12和抗炎细胞因子IL10的分泌水平;采用液质联用联合免疫共沉淀确定PID1相互作用的蛋白;检测抑制EGFR表达后的PID1过表达小鼠的免疫状况;采用Gr-1磁珠分选肝脏浸润的骨髓来源抑制细胞,检测其炎症相关细胞因子的表达水平,与T细胞共培养检测其功能。第三,在自发肥胖及胰岛素抵抗的ob/ob小鼠模型上采用慢病毒干扰PID1的表达,检测肝脏PPARα、FABP1的表达,检测脂肪组织PPARγ、FABP4的表达;采用凝胶迁移电泳确定肝脏中PPARα的转录活性;提取肝脏细胞核和细胞质中蛋白,分别检测FABP1的表达水平;采用免疫荧光检测肝脏FABP1的表达和分布;采用克隆形成检测干扰PID1对小鼠正常肝细胞生长的影响;采用克隆形成、MTT和线粒体膜电位检测胰岛素对肝癌细胞增殖和活力的影响;在胰岛素抵抗细胞模型的基础上检测细胞增殖、活力,检测增殖相关抗原、原癌基因及肿瘤干细胞相关基因的表达。结果第一,我们发现PID1在肝癌细胞、肝癌组织芯片和临床肝癌样本中有高表达的现象;H3K4甲基化转移酶抑制剂MI-2能抑制PID1的表达,PID1启动子区域存在H3K4me3修饰且肝癌细胞和临床肝癌样本中PID1的H3K4me3修饰增强;干扰PID1后,H22移植瘤的生长受到抑制,小鼠脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例增加,MDSCs和Tregs比例降低,血清抗肿瘤细胞因子IL6、MCP-1、TNF-α、IFN-γ分泌增多,肿瘤组织原癌基因、肿瘤干细胞基因表达下调;PID1肝脏特异性过表达小鼠肝脏有明显病变,Ki-67表达升高,血清ALT、AST上调,NEFA、TG、TCHO上调,HDLC下调,胰岛素分泌上调,糖酵解相关基因表达上调,而干扰PID1后小鼠肝癌细胞糖酵解代谢减弱;肝脏过表达PID1后肝脏增殖相关抗原和原癌基因表达上调,EGFR/KRAS/ERK通路表达上调;免疫共沉淀结果显示PID1与EGFR有蛋白相互作用,抑制EGFR的表达后PID1的促肿瘤作用消失,但不影响PID1促进NEFA分泌的作用。第二,在PID1肝脏过表达小鼠上,我们发现肝脏MDSCs细胞有明显的上调,对其他免疫细胞有一定程度的影响但是并没有显着性差异（CD3+、CD4+、CD8+T细胞、巨噬细胞比例降低,DCs细胞CD11c、MHCII、CD86、CCR7下调,PD-L1上调,Tregs比例增加）;我们检测PID1过表达小鼠的脾脏免疫细胞比例,发现CD3+、CD4+和CD8+T降低,MDSCs和Tregs增多,血清IL6、MCP-1、IFN-γ、TNF-α、IL12下调,IL10上调,肝脏PD-1、IL10、F4/80基因表达下调,IL6、MCP-1、IFN-γ、IL1β基因表达上调;此外,液质联用和免疫共沉淀结果显示PID1与MDSCs活化的标志分子ARG1有蛋白相互作用;过表达PID1小鼠的肝脏MDSCs中免疫抑制分子表达增强,免疫促进分子表达降低,同时MDSCs对T细胞的抑制作用增强;EGFR被抑制后PID1过表达小鼠肝脏和脾脏的T细胞分化和增殖均显示被抑制,而免疫抑制性细胞MDSCs和Tregs则显着上调。第三,我们发现干扰PID1的ob/ob小鼠肝脏中FABP1和PPARα表达上调,脂肪组织PPARγ表达上调、FABP4的表达下调;EMSA结果显示干扰PID1增强了肝脏PPARα转录活性;干扰PID1后,细胞核中FABP1表达增多,细胞浆中FABP1蛋白的减少,肝脏FABP1免疫荧光的结果也相符;干扰PID1的小鼠肝细胞AML12生长被抑制;给予Hep G2细胞胰岛素促进了其克隆形成,也显着上调了其PID1的表达;Hep G2和L02细胞构建胰岛素抵抗模型后,细胞克隆形成能力增强,线粒体膜电位升高,IGF1表达上调,肿瘤增殖相关抗原PCNA增多,原癌基因KRAS上调,肿瘤干细胞相关基因POU5F1、SOX2和NANOG表达增多;此外,胰岛素抵抗的Hep G2显示Ki-67阳性细胞比例增多,Cyclin D1、EGFR、KRAS、c-Myc、c-fos蛋白水平均有明显上调。结论第一,PID1在肝癌细胞和临床肝癌样本中高表达,且受肝癌环境下增强的H3K4me3修饰所调控;干扰PID1能显着抑制肝癌移植瘤的生长,增强小鼠抗肿瘤免疫;肝脏过表达PID1则能部分依赖与EGFR结合激活EGFR/KRAS/ERK通路促进肝癌形成,EGFR的存在是PID1发挥促肿瘤作用的必要条件;PID1还能通过调控肝脏代谢促进肿瘤形成;第二,小鼠肝脏过表达PID1能诱导肝脏和系统性免疫抑制,其机制部分依赖于与MDSCs活化标志蛋白ARG1相互作用,诱导肝脏招募MDSCs,增强MDSCs对T细胞的抑制作用;第三,干扰PID1可通过促进FABP1的表达直接调控脂质代谢,也可能通过促进FABP1入核与PPARα结合,增强PPARα的转录活性,从而间接增强脂质代谢相关酶的转录,以加速脂质代谢,改善ob/ob小鼠的脂肪肝和胰岛素抵抗;胰岛素及胰岛素抵抗能通过激活PID1的表达促进肝癌细胞的增殖,而这一激活部分依赖于胰岛素抵抗环境下PID1的H3K4me3修饰增强。
白雪[5]（2017）在《常春藤皂甙元抗肝癌作用研究》文中进行了进一步梳理肝细胞癌（Hepatocellμlar Carcinoma,HCC）（简称肝癌）的发病率在所有恶性肿瘤中排在第二位,仅次于肺癌,其发病率因地区不同而有所差异,发达国家明显低于发展中国家,亚洲国家的发病率高于美国和西欧国家,在我国其发病率已超过25/10万,其中高发区之肝癌标准化发病率达49.17/10万人口。据统计,我国每年新增近30余万肝癌患者,占全世界每年新增肝癌患者的一半。另外,我国每年死于肝癌的病人约为30万人,患者5年生存率仅为2.7%。肝癌患病一般不易察觉、且发展迅速,患者的生存期短、后期生存质量较差。早期肝癌的治疗以手术治疗为首选并辅以放射疗法和或化学疗法;中晚期肝癌及转移性肝癌以放射疗法和或化学疗法为主,一般不建议手术。近年来,随着中药抗肿瘤研究的兴起,天然植物药在癌症治疗中受到了广泛的关注。在前期研究工作中,笔者曾对八月札水提物的抗肝癌作用进行了初步的研究,发现其能够明显降低H22荷瘤小鼠体内肿瘤的重量,对肝癌细胞的生长和增殖具有显着的抑制作用。同时,八月札水提物还能够显着提高H22荷瘤小鼠的免疫水平,提高机体抗氧化应激、清除自由基和维持内环境活性氧动态平衡的能力。由此推测,八月札水提物可能通过诱导肝癌细胞凋亡和上调机体免疫水平而发挥抗肿瘤作用。本研究将八月札的主效成份常春藤皂甙元（Hederagenin,HD）作为研究对象,并通过H22荷瘤小鼠体内试验和Hep G2细胞体外培养试验,应用MTT、RT-PCR、免疫荧光、Western Blot、AO/EB凋亡染色、Hoechst33342凋亡染色、酶联免疫吸附试验、NK细胞活性检测以及流式细胞术等方法,试图探讨HD抗肝癌作用及在肿瘤细胞调控、诱导细胞凋亡和免疫调节等方面的作用及相关机制,并获得如下结果。1.在HD对H22荷瘤小鼠抗肝癌作用的研究中,首先建立H22荷瘤小鼠模型,随机分为5组,每组12只,即对照组、环磷酰胺（CTX）阳性对照组、HD低剂量组（100mg/Kg）、HD中剂量组（200 mg/Kg）和HD高剂量组（400 mg/Kg）。经不同剂量的HD连续干预H22荷瘤小鼠14 d后,可观察到H22荷瘤鼠肿瘤组织的生长和增殖受到明显的抑制,小鼠的生存状态和生命体征与对照组比较得到明显的改善。HD各试验组（100mg/Kg、200 mg/Kg和400 mg/Kg）均能显着地抑制H22荷瘤小鼠肿瘤的生长（P<0.01）,肿瘤抑制率分别为29.67%、42.75%和40.26%。通过HE染色观察H22荷瘤小鼠肝脏和肾脏的组织结构,以及对肝和肾功能相关指标的检测,发现HD对小鼠无明显的毒副作用。通过免疫荧光法检测各试验组H22荷瘤小鼠肿瘤组织中突变型P53、P21和Bcl-2蛋白的表达情况,研究结果显示,对照组小鼠的肿瘤组织中突变型P53和Bcl-2蛋白呈高表达,而P21蛋白则相反呈现低表达。经HD和CTX处理后的小鼠肿瘤组织中突变型P53和Bcl-2蛋白的表达显着降低（P<0.01）,而P21蛋白的表达则显着升高（P<0.01）。以上结果揭示HD可能通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用。2.在HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡作用研究中,应用免疫荧光、RT-PCR和Western blot等技术,对肿瘤组织中Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8基因在转录和翻译水平的表达进行了研究。与对照组比较,HD各试验组H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞中Bcl-2在转录和翻译水平的表达均显着降低（P<0.01）,而Bax、Fas、Fas L、Caspase-3、Caspase-8在转录和翻译水平的表达均显着升高（P<0.01）。以上结果揭示HD可能通过激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡,从而发挥其抗肿瘤作用。3.在HD对H22荷瘤小鼠免疫功能的影响研究中,通过分析HD治疗前后小鼠免疫器官组织结构和功能的变化,发现HD各试验组均可以明显的改善H22荷瘤小鼠的胸腺指数和脾指数（P<0.05）,初步判定HD能够促进H22荷瘤小鼠胸腺和脾脏两大免疫器官的修复。同时,HD能够显着提高H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞的增殖能力（P<0.01）,显着提高小鼠免疫器官中的NK细胞的杀伤能力（P<0.05）;HD能够显着增加CD4+T淋巴细胞的数量,提升CD4+/CD8+的比值（P<0.05）,表明HD能通过调节T淋巴细胞亚群的数目和比例进而改善细胞免疫应答。另外,HD还能够调节H22荷瘤小鼠外周血中IL-2和TNF-α的表达水平,尤其HD 200 mg/Kg和400 mg/Kg组作用显着（P<0.05）。以上结果揭示HD可能通过修复免疫器官、调控细胞免疫应答和改善细胞因子水平而发挥抗肿瘤作用。4.在HD体外抑制Hep G2细胞作用的研究中,经不同浓度的HD（浓度为0、30、60、90、120和180μg/m L）干预Hep G2细胞24 h和48 h后,HD对Hep G2细胞增殖的抑制作用不断增强,并呈剂量时间依赖关系。HD各试验组对Hep G2细胞的生长和增殖均表现出显着的抑制作用,差异具有统计学意义（P<0.01）;24 h的抑制率分别为5.26%、8.73%、11.00%、16.44%和27.72%;48 h的抑制率分别为1.80%、11.01%、19.38%、27.76%和42.01%。经HE染色和激光共聚焦检测,HD干预48 h后,Hep G2细胞呈煎蛋样改变,出现膜小泡和凋亡小体,核染色质分布不均匀,并且核膜破损,呈典型的细胞凋亡形态学改变。另外,通过Annexin V–FITC双染观察,经HD处理48 h后,Hep G2细胞出现明显的细胞凋亡现象,进一步证明了HD能够诱导Hep G2细胞发生凋亡。当浓度为120和180μg/m L时,HD诱导Hep G2细胞的发生凋亡的百分比分别为12.10%和17.90%,显着高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.05）。以上结果揭示HD可能是通过诱导Hep G2细胞凋亡而发挥其抗肝癌作用。5.在HD体外诱导Hep G2细胞凋亡机制的研究中,应用免疫荧光和Western blot技术,对Hep G2细胞中突变型P53、Bcl-2、Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8的表达变化情况进行研究。与对照组比较,经HD处理的Hep G2细胞中突变型P53和Bcl-2蛋白的表达水平明显降低（P<0.01）,而Bax、Fas、Fasl、Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达显着升高（P<0.01）,进一步表明HD诱导Hep G2凋亡作用可能与其激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径密切相关。本研究通过动物模型体内试验和细胞培养体外试验两个途径,探讨了HD对H22荷瘤小鼠和Hep G2细胞的抗肿瘤作用及相关机制,通过药理学、病理学、生物化学和分子生物学等相关技术和方法,对与肿瘤发生和发展密切相关的细胞因子、m RNA、蛋白和细胞凋亡（细胞凋亡相关调控通路）等指标进行了系统的检测和分析,证实HD在体内和体外均具有明显的抑制肿瘤细胞生长和增殖的作用,这可能与HD能够激活细胞凋亡的线粒体途径和死亡受体途径密切相关,通过本研究可以为临床使用HD协助治疗肝癌提供理论和试验依据。
刘军[6]（2013）在《基于选择性致死癌细胞的蓝舌病毒对不同荷瘤模型体内靶向抗癌作用和特征的研究》文中研究说明肿瘤是严重危害人类的疾病,肿瘤的发生与防治是现代医学研究的重点和热点。传统的治疗方法主要采用手术切除、化学治疗、放射治疗等。由于这些抗癌手段缺乏靶向性,而在抗癌治疗过程中几乎同等地杀死人体正常细胞、破坏人体正常组织和器官,以至临床抗癌治疗常常归于失败。真正意义上的靶向抗癌治疗,即只杀癌细胞而不杀正常细胞的靶向性抗癌治疗技术、手段和药物一直都是有志征服癌症的科学工作者和医疗工作者追求和为之奋斗的目标,也是广大癌症患者及其家属的祈求。所谓溶癌病毒（Oncolytic Virus）就是指能有效地专性杀死某些种类的恶性肿瘤细胞,又不损伤人体正常细胞的病毒。溶癌病毒研究是近年抗癌研究和病毒生物技术研究的新思维,这种科学思维是现代病毒分子生物学、分子肿瘤学、分子生物学及分子遗传学等领域理论研究成果和研究技术进步的结晶。科学家们正在采用生物工程技术改造病毒基因组结构的方法发展靶向性溶癌病毒,同时也在寻找对人体无致病性的天然病毒（包括异源病毒和人源病毒）以发展靶向性溶癌病毒。蓝舌病毒（Bluetongue Virus, BTV）为呼肠孤病毒科环状病毒属成员,能引起绵羊和某些野生反刍动物的蓝舌病。人类早已结论,蓝舌病毒不感染人体正常细胞。近年,我们还发现,其dsRNA基因组能诱导干扰素的产生,从而进一步确立了蓝舌病毒潜在的利用价值和应用前景。本研究内容包括：（1）不同血清型蓝舌病毒体外选择性杀死人肝癌细胞的研究；（2）蓝舌病毒16型（BTV-16）的急性毒性实验；（3）借助同源小鼠肝癌H22荷瘤模型探讨BTV-16对恶性肿瘤的治疗作用；（4）借助裸鼠荷人肝癌Hep-3B异源移植动物模型探讨BTV-16体内靶向抗癌作用；（5）借助BTV-16感染并选择性杀死人肝癌Hep-3B细胞、人宫颈癌Siha细胞和小鼠乳腺癌MA782细胞的细胞模型系统初步探讨BTV致癌细胞死亡的模式及其机理。研究工作首先探究了蓝舌病毒4型、9型、16型和21型对人肝癌Hep-3B细胞的作用,结果显示这4个血清型蓝舌病毒均能引起人肝癌Hep-3B的病变,并导致癌细胞凋亡的发生,从而进一步证实了BTV体外选择性杀死癌细胞的作用；亦为潜在的蓝舌病毒抗癌临床应用时,在需要反复应用BTV治疗的情况下,为规避因单一血清型BTV应用所产生的免疫反应和抗性而提供不同血清型蓝舌病毒交替使用创造了物质条件。继而利用昆明小鼠检测蓝舌病毒16型对机体的急性毒性实验,结果证明蓝舌病毒在小鼠体内安全性好。同时用ELISA方法检测了小鼠体内抗蓝舌病毒16型抗体,获得了受试动物体内抗BTV-16抗体随时间变化的规律,为尔后临床蓝舌病毒注射应用提供实验室理论依据。确证蓝舌病毒16型在小鼠体内安全后,进一步利用小鼠肝癌H22细胞成功构建了免疫完善的BALB/C小鼠荷同源异体肝癌H22动物模型,借此模型系统在体内探讨了蓝舌病毒16型在免疫完善的小鼠体内抗癌的靶向性和安全性,证实了蓝舌病毒在免疫完善的小鼠体内能有效地抑制肝癌H22的生长,显示了其体内抗癌的靶向性、有效性和安全性。在上述体外和体内研究的基础上,进一步较系统地在试验动物体内探讨了该株病毒体内靶向抗人癌研究。试验首先成功建立了裸鼠荷人肝癌Hep-3B异源移植动物模型；借助该模型系统,以临床上首选的抗肝癌药物阿霉素（ADM）作对照,借助临床观察、病理解剖、组织病理学、超微结构学、血液常规、生物化学指标测定等技术系统地观察了BTV-16抗癌的临床效果和安全性,在一个新的水平上评估该病毒靶向性溶癌的潜能。实验结果显示：未用BTV-16处理的荷人肝癌Hep-3B的对照组裸鼠生活状态极差,肿瘤持续增长；阳性药物阿霉素对照组临床肿瘤治疗能抑制肿瘤生长,但实验动物出现明显的毒副反应；BTV-16抗人肝癌Hep-3B有效率达100%,且动物生活状态良好,无死亡；各不同浓度BTV-16治疗组裸鼠血液学指标和生化指标无显着性差异。这就进一步揭示了BTV-16抗人癌的有效性、安全性和靶向性。为了探讨蓝舌病毒16型致人肝癌Hep-3B细胞、人宫颈癌Siha细胞和小鼠乳腺癌MA782细胞的死亡模式,我们借助不同肿瘤细胞体外培养系统,结合流式细胞仪检测结果分析和电镜观察结果分析的应用开展了研究。结果发现：（1）BTV-16靶向感染这些癌细胞并在其中有限增殖是其实现靶向抗癌的重要分子事件；（2）BTV-16有效感染这些肿瘤细胞并诱导它们进入凋亡而实现靶向抗肿瘤；（3）内质网应激途径可能是BTV-16诱导这些肿瘤细胞凋亡的重要信号通路之一；（4）BTV-16靶向感染某些种类癌细胞并在其中有限增殖为其根治这些癌瘤奠定了物质基础。我们强烈地感到,蓝舌病毒具有靶向抗癌临床应用潜能,因为它不需要基因改造和减毒,并且不携带对人体有害的物质；它能在很多人肿瘤细胞中快速生长并在其间轻易传播；而且在人体内不存在抗蓝舌病毒的中和抗体,因而在最初的单独注射或联合其它抗癌药物注射时不会被免疫抑制。显然,本研究为潜在的临床提供了有价值的依据和有力的支持,蓝舌病毒有望成为新一代的溶癌病毒领跑者。
陈万远[7]（2012）在《不同淋巴道转移潜能的小鼠肝癌克隆细胞株的分离和建立》文中提出目的：肿瘤的侵袭与移转是恶性肿瘤最基本的生物学特性之一，也是肿瘤患者死亡的重要原因。然而，有关转移的确切机制目前尚不十分清楚。因此，肿瘤转移一直是肿瘤学研究的一个热点。建立理想的肿瘤转移动物模型对深入研究肿瘤转移机制具有重要的意义。小鼠腹水型肝癌H22细胞瘤株属于小鼠的肝细胞癌，接种于小鼠皮下呈结节状增长，移植于小鼠腹腔呈腹水型增长。建立H22实验性转移模型对研究H22肿瘤本身及筛选控制癌转移的药物等方面的基础研究具有非常重要的意义。HCa-F和HCa-P是从H22腹水癌克隆出的具有高低不同淋巴道转移潜能的细胞株，高转移株HCa-F淋巴道转移率可达到70-80%，而低转移株HCa-P淋巴道转移率仅为0-20%。这种小鼠腹水癌（H22）实验性淋巴道转移模型是一个较适用的并符合自然转移规律的动物模型，此模型已广泛地应用于肿瘤基础研究及药物筛选，成为研究中医药抗肿瘤的作用及机制的一个公认的肿瘤模型。研究肿瘤的淋巴道转移机制，不论是在组织病理学水平、细胞生物学水平、还是在分子生物学水平，有一个良好的参比对照系统是非常重要的。但该模型的缺点是缺乏无转移株对照，因此分离与建立包括无转移株在内的具有不同淋巴道转移力的单克隆株模型对可为推动深入研究肿瘤淋巴道转移机制、寻找预测转移的新指标、筛选防治新策略奠定工作基础。本文以小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株HCa-P为瘤源，采取有限稀释法克隆出细胞株，经过小鼠足垫接种实验检测其淋巴道转移潜能，从细胞形态、细胞生长曲线、群体倍增时间、基质金属蛋白酶2和9（MMP-2，MMP-9）的分泌、细胞迁移与侵袭等方面检测克隆细胞株的生物学特性，目的是筛选出具有不同淋巴道转移潜能的小鼠腹水型肝癌细胞株，为建立转移力逐级增高的阶梯转移小鼠肝癌细胞模型系统奠定基础，为肿瘤淋巴道转移机制的研究提供一个更为理想的实验模型。方法：细胞单克隆：利用小鼠腹水型肝癌淋巴道低转移细胞株HCa-P为瘤源克隆细胞，采用有限稀释法从中分离出单个细胞，在96孔板中进行克隆细胞培养，按细胞株在96孔板中的位置分别命名。在体外进行克隆细胞培养。待96孔板内细胞长满板底，转移到24孔板继续培养，再转移至培养瓶加液扩大培养，每个细胞独立生长成细胞株。将各细胞株接种于小鼠脚垫，检测成瘤率和淋巴结的转移率。筛选出转移潜能不同的细胞株。生物学特性检测：检测各克隆细胞株和HCa-P生物学特性，通过同步化培养在倒置显微镜下观察细胞形态，通过绘制生长曲线的方法检测和对比各细胞株生长速度，并且以生长曲线计算各细胞株的群体倍增时间。采用Western Blot测定各细胞株中基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达水平；利用明胶酶谱实验检测各细胞株分泌基质金属蛋白酶2和9（MMP-2，MMP-9）的量。运用侵袭和迁移实验检测各细胞株的运动能力的差异。结果：通过有限稀释法从小鼠腹水型肝癌低淋巴道转移株HCa-P中分离得到四株克隆细胞株，分别命名为G2、H5、B8、E10。经615小鼠脚垫皮下接种的各克隆细胞株（G2、H5、B8、E10）和Hca-P的淋巴结转移率分别为33.3%、0、13.3%、20%、26.7%。得到的G2细胞株的转移率为33.3%，高于HCa-P细胞株。H5细胞株转移率为零，与HCa-P和G2细胞株差异显着（x2检验，P<0.05）。B8和E10细胞株的转移率与源细胞株Hca-P无差异。各细胞株之间在一些生物学方面存在差异。细胞形态分析显示，G2细胞株含大细胞的数量明显多于其它各株。细胞倍增时间G2为5.76±0.86h，H5为18.18±1.43h，差异显着（t检验，P<0.05）。Western Blot实验显示细胞内基质金属蛋白酶2（MMP-2）的表达量在G2与H5中差异显着（t检验，P<0.05）。明胶酶谱实验结果表明细胞外分泌基质金属蛋白酶2、9（MMP-2、MMP-9）在G2与H5中差异显着（t检验，P<0.05）。Transwell小室检测迁移的结果显示G2细胞24小时迁移数178.6±3.5个；H5细胞24小时迁移数23.6±1.5个，差异显着（t检验，P<0.05）。Transwell小室检测侵袭的结果显G2细胞24小时侵袭数138.6±7.6个。H5细胞24小时侵袭数18.6±3.2个，差异显着（t检验，P<0.05）。结论：通过有限稀释法从小鼠腹水型肝癌低淋巴道转移株HCa-P中得到的四株克隆细胞株G2、H5与B8、E10。其中H5为无转移株（HCa-P/0），G2为低转移株（HCa-P/L）。E10、B8与亲本细胞HCa-P之间无差异。G2、H5之间在淋巴结转移率、细胞形态、细胞生长曲线、群体倍增时间、基质金属蛋白酶2和9（MMP-2，MMP-9）分泌、细胞迁移与侵袭方面有显着差异。
胡洁[8]（2009）在《人胎儿源间充质干细胞的分离鉴定及其在免疫性肝损伤中的免疫双效作用研究》文中研究指明目的:近年来,间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）以其能在自体、同种异体甚至异种异体体内,旺盛地增殖和多向地分化,有效修复甚至完全重建功能严重受损甚或几近缺如的组织器官而不被排斥,已经成为组织修复和再生重建领域内备受关注的研究热点。在人源MSC中,胎儿源MSC与成人源者相比,因其发育上更早、更少被病原体感染、安全性更高、获取和制备相对更为捷易等优点,更是成为人们多愿选择的来源。现代免疫学研究已经揭示,自体和同基因个体（如同卵孪生和纯系内个体）间的组织器官移植之所以不被排斥,是因供体与受体的组织相容性抗原一致或几近一致所致。而同种异体间,尤其是异种异体间的组织器官移植一定会被排斥,是因供体和受体间组织相容性抗原不一致而致,且两者间的组织相容性抗原相差越远,则排斥反应的发生就越迅速、越强烈。由是,在人类为修复或重建功能已严重受损甚至已几近缺如的组织器官,除同卵孪生外,因实难觅组织相容性抗原一致或几近一致的供体,不得已而在移植后必须长期应用昂贵的免疫抑制剂维持,但随之又会带来易发严重感染甚至肿瘤的危险。由此,既不难理解为何人们会对人源尤其是胎儿源MSC寄予厚望而备受关注,同时也强烈提示,同种异体特别是异种异体MSC移植不被排斥,是否是其本身具有介导和启动有效免疫抑制作用机制所致;如是,则在其应用之后是否有抑制机体免疫功能特别是招致肿瘤发生的风险性,势必就成为该领域中必须予以高度重视和深入探索的重要课题。迄今,已有许多研究小组对MSC在组织修复和免疫耐受重建等领域的实验研究和临床应用,进行了多方面的大胆探索和勇敢尝试。有关心肌修复、骨疾病及代谢性疾病的MSC细胞治疗的临床试验已在世界各地先后开展;而Le Blanc及其同事应用同种异体MSC于移植物抗宿主病（graft versus host disease, GVHD）的大胆尝试,更坚定了人们将其应用于免疫损伤性疾病治疗的信心。还有将自体或同种异体MSC以不同给药方式（局部、静脉和腹腔）治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）及Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎（collagenⅡ-induced arthritis, CIA）模型的研究均获成功。更兼我们惊奇地发现经与未经预处理的人胎儿源MSC,对ConA诱导的免疫性肝损伤有双效作用,因这确是在世界上尚无报道,而极大地激发了我们对人胎儿源MSC免疫生物学特性及其与肿瘤免疫学关系的浓厚研究兴趣。为此,本课题分离鉴定了胎儿骨髓源和羊水源MSC以优化来源,研究其免疫抑制功能特别是对ConA诱导免疫性肝损伤的双效作用,在分析其介导的免疫抑制分子的基础上,探索其之致瘤的风险性,为MSC的进一步研究和应用提供新的理论和实验依据。方法:贴壁消化传代培养法,自人胎儿骨髓及羊水细胞获取,并经形态学、细胞表面标记和分化潜能鉴定,确系为人胎儿源MSC（以下简写为hMSC）。MTS法评价hMSC对ConA诱导小鼠脾细胞增殖的抑制作用。获取ConA刺激小鼠脾细胞增殖的培养上清,以其培养hMSC而获取经预处理的hMSC;观察其生长增殖、细胞表型、染色体核型等细胞生物学特性。参照Tiegs等的方法建立ConA诱导免疫性肝损伤动物模型,肝损伤指标包括小鼠存活率、血清谷丙转氨酶（glutamate-pyruvate transaminase,ALT）和谷草转氨酶（glutamic-oxalacetic transaminase,AST）含量以及肝组织病理损伤情况等。以模型动物肝损伤指标为对照,观察经或未经预处理的hMSC对模型动物肝损伤的影响,评价其对肝损伤的保护或促进作用。裸鼠皮下移植,排除hMSC成瘤可能;选择人肝癌细胞系MHCC/97H肿瘤细胞和小鼠肝癌细胞系H22肿瘤细胞为对象,观察hMSC对肿瘤细胞体内/外细胞周期、体外克隆形成能力、荷瘤小鼠生存期、皮下移植瘤体内生长增殖以及体内/外侵袭转移等的影响,评价其致瘤的风险性。结果:1人胎儿骨髓源及羊水源MSC的分离鉴定及其免疫抑制作用贴壁消化传代培养法,自人胎儿骨髓及羊水细胞获取,连续传代培养35代后,其形态学、细胞表面标记和分化潜能鉴定,均具人MSC典型特征,确系获得了合格的hMSC。ConA刺激小鼠脾细胞增殖实验显示,hMSC有显着的、剂量依赖式的免疫抑制作用（P<0.05）。2未预处理的hMSC对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的作用未预处理的hMSC可显着降低ConA诱导免疫性肝损伤模型小鼠存活率（P<0.05）、升高模型小鼠血清中肝功能指标ALT和AST含量（P<0.05）并促进肝组织的病理损伤（P<0.05）。显示未预处理的hMSC对ConA诱导免疫性肝损伤有显着的促进作用。3未预处理的hMSC对模型小鼠肝损伤的促进作用与HLA分子表达及补体C3介导的关系HLA-A,B,C（+）/HLA-DR（-）及HLA-A,B,C（-）/HLA-DR（-）的hMSC均可显着升高模型小鼠血清中肝损伤指标ALT的含量（P<0.05）,显示未预处理的hMSC对模型小鼠肝损伤的促进作用,与其表面HLA分子表达无关;各组小鼠血清ALT和补体C3含量测定及回归分析,显示未预处理的hMSC促进模型小鼠肝损伤亦与补体C3介导无关。4未预处理的hMSC对正常小鼠肝脏组织的影响小鼠肝组织病理切片HE染色结果显示,未预处理的hMSC组与正常组小鼠相比,肝小叶周边、界板肝细胞及汇管区的点灶状溶解性坏死、凋亡小体及汇管区炎等病理指标差异明显（P<0.05）;提示未预处理的hMSC腹腔注射可致正常小鼠肝组织轻微病理损伤。5经预处理的hMSC对ConA诱导小鼠免疫性肝损伤的作用。经预处理的hMSC可显着升高ConA诱导免疫性肝损伤模型小鼠存活率（P<0.05）、降低模型小鼠血清中肝功能指标ALT含量（P<0.05）并显着降低肝组织的病理损伤程度（P<0.05）;显示经预处理的hMSC对ConA诱导免疫性肝损伤有显着的保护作用。6经预处理的hMSC对模型小鼠肝组织FasL表达和脾Treg亚群细胞比例的影响。经预处理的hMSC可显着减少模型组小鼠肝组织FasL表达（P<0.05）并增加早期时相（3h）脾细胞Treg亚群细胞比例（P<0.05）。提示使模型鼠肝组织FasL表达减少和脾Treg细胞比例增加,可能是经预处理的hMSC对模型小鼠免疫性肝损伤具有保护作用的分子机制。7经与未经预处理的hMSC相关细胞因子分泌差异经预处理的hMSC其IL-6、IL-8及RANTES等细胞因子分泌,较未预处理的hMSC增多。提示,经预处理的hMSC有可能藉增加这些细胞因子的分泌,参与对ConA诱导免疫性肝损伤的保护作用。8经预处理的hMSC的自身成瘤性以ConA刺激小鼠脾细胞增殖的培养上清对hMSC行预处理后, hMSC的细胞周期被阻于G0/G1期,增殖指数显着降低（P<0.05）;细胞表型和染色体核型保持不变;接种于裸鼠皮下,亦无肿瘤形成。提示预处理未导致hMSC的自身成瘤性。9经预处理的hMSC的促瘤性经与未经预处理的hMSC,均可使人肝癌细胞系MHCC/97H肿瘤细胞及小鼠肝癌细胞系H22肿瘤细胞阻滞于G0/G1期,显着降低两种肿瘤细胞的增殖指数（P<0.05）;均可使MHCC/97H肿瘤细胞体外克隆形成能力显着降低（P<0.05）;预处理与否,不影响hMSC对这两种肿瘤细胞发挥上述这些抑制作用的强度（P>0.05）。经与未经预处理的hMSC,对MHCC/97H肿瘤细胞和H22肿瘤细胞体内移植瘤的生长增殖、体内/外侵袭转移及荷瘤小鼠生存期无影响（P>0.05）。提示预处理未导致hMSC的促瘤性。结论:1贴壁消化传代培养法可有效从骨髓和羊水,获取合格的人胎儿源MSC。2人胎儿源MSC对ConA刺激的T细胞增殖有显着的免疫抑制作用。3经或未经ConA刺激T细胞增殖的培养上清预处理,可显着改变人胎儿源MSC对ConA诱导免疫性肝损伤的影响模式,此结果与结论国内外未见报道。4未预处理的人胎儿源MSC对ConA诱导免疫性肝损伤有显着的促进作用。5经预处理的人胎儿源MSC对ConA诱导免疫性肝损伤有显着的保护作用。6未预处理的人胎儿源MSC对ConA诱导免疫肝损伤的促进作用与其表面HLA分子表达及补体C3的介导作用无关。7经预处理的人胎儿源MSC对ConA诱导免疫肝损伤的保护作用与其致肝组织FasL表达降低及脾细胞早期时相（3h）Treg亚群细胞比例增高有关。8经预处理的人胎儿源MSC,其IL-6、IL-8及RANTES细胞因子表达增加。9人胎儿源MSC在观察期内未见成瘤性和促瘤活性,初步判断其在所观察期内不具有致瘤风险性。
王险峰,陈森洲,刘福英[9]（2008）在《应用RAPD技术检测小鼠肝癌H22细胞克隆株的遗传学改变》文中认为目的:用RAPD技术检测小鼠肝癌H22细胞克隆株的遗传变异。方法:小鼠肝癌H22细胞的4个克隆株H22-H8D8、H22-H2G4、H22-H2E10、H22-H2C4,用47条随机引物经PCR扩增,对扩增产物进行电泳,凝胶分析系统观察结果并照相。结果:47条引物均能扩增出明显的条带,条带数多为410条,片段大小在2002000 bp之间。其中4条引物的扩增条带具有多态性,表现为带的有无、移动和强弱差异。结论:RAPD技术可以用来对小鼠肝癌H22细胞克隆株进行遗传检测。
王险峰,张焕铃,刘福英,王俊霞,尤红煜[10]（2007）在《小鼠肝癌H22细胞克隆株的RAPD分析》文中研究指明目的应用随机扩增多态性DNA（RAPD）技术检测小鼠肝癌H22细胞克隆株的遗传变异。方法用47条引物对小鼠肝癌H22细胞的4个克隆株H22-H8D8,H22-H2G4,H22-H2E10,H22-H2C4基因组DNA进行RAPD分析。结果47条引物均能扩增出明显的条带,条带数多为410条,片段大小在2002000 bp之间。其中4条引物的扩增条带具有多态性,表现为带的有无、移动和强弱差异。结论RAPD技术可以用来检测小鼠肝癌H22细胞克隆株基因组之间的差异。
二、小鼠肝癌H_(22)细胞克隆株的选择及其细胞特性比较（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、小鼠肝癌H_(22)细胞克隆株的选择及其细胞特性比较（论文提纲范文）
（1）基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 引言 |
| 2 肝癌研究现状 |
| 2.1 肝癌的发生机制 |
| 2.2 肝癌的治疗 |
| 2.3 肝癌动物模型研究进展 |
| 2.4 结语 |
| 3 复方苦参注射液应用与研究 |
| 3.1 复方苦参注射液化学成分研究 |
| 3.2 复方苦参注射液抗肿瘤药理作用 |
| 3.3 复方苦参注射液抗肿瘤作用机制 |
| 3.4 结语 |
| 4 网络药理学概述 |
| 4.1 网络药理学的理论基础 |
| 4.2 网络药理学研究方法 |
| 4.3 网络药理学在中药研究中的应用 |
| 4.4 结语 |
| 5 本课题的研究意义、研究思路、技术路线、研究内容及主要创新点 |
| 第二章 复方苦参注射液抗肝癌作用研究 |
| 第一节 复方苦参注射液对人肝癌SMMC-7721 细胞的作用 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 细胞培养 |
| 1.3.2 细胞存活率测定 |
| 1.3.3 克隆形成实验 |
| 1.3.4 细胞粘附实验 |
| 1.3.5 伤口愈合细胞划痕实验 |
| 1.3.6 Transwell细胞侵袭实验 |
| 1.3.7 细胞趋化运动能力实验 |
| 1.3.8 数据处理 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞活力的影响 |
| 1.4.2 复方苦参注射液对L02 细胞活力的影响 |
| 1.4.3 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞克隆形成能力的影响 |
| 1.4.4 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞粘附能力的影响 |
| 1.4.5 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞迁移能力的影响 |
| 1.4.6 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞侵袭能力的影响 |
| 1.4.7 复方苦参注射液对SMMC-7721 细胞趋化运动能力的影响 |
| 1.5 讨论与小结 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 复方苦参注射液对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的药理作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物分组、造模及给药 |
| 2.3.2 样本收集 |
| 2.3.3 病理组织分析 |
| 2.3.4 血清生化测试 |
| 2.3.5 数据处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌模型的动态变化研究 |
| 2.4.2 复方苦参注射液对二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌的作用研究 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三章 基于计算系统药理学模型的复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分群研究 |
| 第一节 复方苦参注射液中主要化学成分UPLC-MS定性分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 小结与讨论 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 基于计算系统药理学模型的复方苦参注射液抗肝癌药效成分群研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞核磁备样方法、检测条件 |
| 2.3.2 细胞液质代谢组学备样方法、液相质谱条件及数据处理 |
| 2.3.3 统计分析 |
| 2.3.4 复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的代谢酶预测 |
| 2.3.5 复方苦参注射液靶点预测 |
| 2.3.6 复方苦参注射液成分-靶点-互作蛋白-疾病基因网络构建 |
| 2.3.7 传播模型计算 |
| 2.3.8 数据处理 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 复方苦参注射液抗肝癌表型数据的整合及分析 |
| 2.4.2 复方苦参注射液靶向基因型数据的获取与分析 |
| 2.4.3 基于基因型-表型数据传播模型的构建 |
| 2.4.4 复方苦参注射液抗肝癌药效成分群的预测 |
| 2.4.5 复方苦参注射液抗肝癌药效成分群验证 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第四章 基于定量成分导向网络药理学的复方苦参注射液抗肝癌机制研究 |
| 第一节 定量成分导向网络药理学预测复方苦参注射液抗肝癌机制 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 活性成分筛选和验证 |
| 1.3.2 靶点收集 |
| 1.3.3 网络构建和分析 |
| 1.3.4 通路预测 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 复方苦参注射液抗肝癌活性成分筛选和验证 |
| 1.4.2 复方苦参注射液抗肝癌网络分析 |
| 1.4.3 复方苦参注射液抗肝癌通路分析 |
| 1.5 讨论与小结 |
| 1.5.1 小结 |
| 1.5.2 讨论 |
| 第二节 基于Wnt/β-catenin信号通路的复方苦参注射液抗肝癌机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Western Blot实验 |
| 2.3.2 免疫荧光测定 |
| 2.3.3 伤口愈合细胞划痕实验 |
| 2.3.4 Transwell细胞侵袭实验 |
| 2.3.5 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 复方苦参注射液对网络药理学预测的关键蛋白表达的影响 |
| 2.4.2 复方苦参注射液对上皮间质转化过程蛋白表达的影响 |
| 2.4.3 复方苦参注射液对Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达的影响 |
| 2.4.4 复方苦参注射液抑制LiCl诱导的SMMC-7721细胞Wnt/β-catenin通路激活 |
| 2.4.5 复方苦参注射液通过Wnt/β-catenin信号通路抑制LiCl诱导的SMMC-7721 细胞上皮间质转化、迁移和侵袭 |
| 2.5 小结与讨论 |
| 2.5.1 小结 |
| 2.5.2 讨论 |
| 第三节 基于代谢组学研究复方苦参注射液调节肝癌代谢紊乱的作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 肝脏核磁备样方法及检测条件 |
| 3.3.2 血清核磁备样方法及检测条件 |
| 3.3.3 数据处理 |
| 3.3.4 代谢物和代谢酶测试 |
| 3.3.5 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 核磁图谱分析 |
| 3.4.2 寻找相关的生物标志物 |
| 3.4.3 复方苦参注射液对肝癌大鼠代谢轮廓的调节作用 |
| 3.4.4 柠檬酸和乳酸含量变化定量分析 |
| 3.4.5 复方苦参注射液对糖酵解中关键酶活性的作用 |
| 3.4.6 c-Myc介导复方苦参注射液对糖酵解的抑制作用 |
| 3.5 小结与讨论 |
| 3.5.1 小结 |
| 3.5.2 讨论 |
| 总结与展望 |
| 1 研究工作总结 |
| 2 不足和展望 |
| 参考文献 |
| 主要缩略词表 |
| 攻读学位期间取得成果 |
| 致谢 |
| 个人情况及联系方式 |
（2）肿瘤细胞来源微颗粒的软硬度调控纳米药物递送效率（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 肿瘤干细胞 |
| 1.2.1 肿瘤干细胞的概念 |
| 1.2.2 肿瘤干细胞的耐药机制 |
| 1.2.3 肿瘤干细胞生存调控机制 |
| 1.3 纳米载药系统及其在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.3.1 纳米载药系统的特性 |
| 1.3.2 纳米载药系统在肿瘤治疗中的应用 |
| 1.3.3 纳米载药系统在肿瘤干细胞治疗中的应用 |
| 1.3.4 纳米载药系统在肿瘤治疗中面临的挑战 |
| 1.4 理想的用于肿瘤细胞治疗的纳米载药系统的特点 |
| 1.4.1 稳定性的调变 |
| 1.4.2 表面修饰调变 |
| 1.4.3 粒径调变 |
| 1.4.4 软硬度调变 |
| 1.5 胞外囊泡载药系统及应用 |
| 1.5.1 胞外囊泡的概念 |
| 1.5.2 EVs调节肿瘤细胞间的通讯及肿瘤发展 |
| 1.5.3 EVs在肿瘤诊断中的应用 |
| 1.5.4 EVs作为靶向传递系统的应用 |
| 1.6 本文研究意义以及主要内容 |
| 1.6.1 本文的研究意义 |
| 1.6.2 本文主要研究内容 |
| 2 肿瘤干细胞来源载药微颗粒药效学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与仪器 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、传代与冻存 |
| 2.3.2 TRCs筛选及培养 |
| 2.3.3 TRCs来源载药MPs的制备 |
| 2.3.4 载药MPs的鉴定 |
| 2.3.5 MPs载药量检测 |
| 2.3.6 载药MPs的表征 |
| 2.3.7 载药MPs在不同pH值溶液中的释放 |
| 2.3.8 载药MPs体内抑制肿瘤效果 |
| 2.3.9 载药MPs的生物安全性评价 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 3D-MPs的表征 |
| 2.4.2 DOX@3D-MPs的稳定性研究 |
| 2.4.3 3D-MPs的药物负载 |
| 2.4.4 DOX@3D-MPs在不同pH值溶液中的药物释放 |
| 2.4.5 Drug@3D-MPs体内抗肿瘤效果 |
| 2.4.6 DOX@3D-MPs的生物安全性评价 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 肿瘤干细胞来源载药微颗粒的体内过程研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与仪器 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 正常细胞、肿瘤细胞和TRCs培养 |
| 3.3.2 DOX@3D-MPs的制备 |
| 3.3.3 DOX@3D-MPs在荷瘤小鼠肿瘤内的蓄积 |
| 3.3.4 DOX@3D-MPs在荷瘤小鼠体内的组织分布 |
| 3.3.5 DOX@3D-MPs体内肿瘤深部穿透行为 |
| 3.3.6 小鼠背部皮窗模型研究DOX@3D-MPs体内肿瘤深部穿透行为 |
| 3.3.7 斑马鱼模型研究DOX@3D-MPs体内肿瘤深部穿透行为 |
| 3.3.8 DOX@3D-MPs体外肿瘤深部穿透行为 |
| 3.3.9 普通肿瘤细胞对DOX@3D-MPs的体外摄取及其毒性研究 |
| 3.3.10 TRCs对 DOX@3D-MPs的体外摄取及其毒性研究 |
| 3.3.11 DOX@3D-MPs胞内过程研究 |
| 3.3.12 DOX@3D-MPs体外对巨噬细胞及血管内皮细胞的毒性研究 |
| 3.3.13 DOX@3D-MPs在体内的细胞摄取研究 |
| 3.3.14 DOX@3D-MPs体内对巨噬细胞及血管内皮细胞的毒性研究 |
| 3.3.15 DOX@3D-MPs在体内肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞内的蓄积 |
| 3.3.16 DOX@3D-MPs在体内对H22 小鼠皮下瘤模型中TRCs的杀伤 |
| 3.3.17 DOX@3D-MPs在体内对B16-F10 肺转移黑色素瘤中TRCs的杀伤 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 DOX@3D-MPs在荷瘤小鼠的肿瘤蓄积 |
| 3.4.2 DOX@3D-MPs体内肿瘤深部穿透行为 |
| 3.4.3 小鼠背部皮窗模型研究DOX@3D-MPs体内肿瘤深部穿透行为 |
| 3.4.4 斑马鱼模型研究DOX@3D-MPs体内肿瘤深部穿透行为 |
| 3.4.5 3D肿瘤球研究DOX@3D-MPs在肿瘤深部穿透行为 |
| 3.4.6 肿瘤细胞对DOX@3D-MPs的体外摄取及其毒性研究 |
| 3.4.7 DOX@3D-MPs胞内过程研究 |
| 3.4.8 DOX@3D-MPs在体内肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞内的蓄积 |
| 3.4.9 DOX@3D-MPs在体内对TRCs的杀伤 |
| 3.4.10 DOX@3D-MPs对肿瘤细胞的靶向性 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 软硬度对肿瘤干细胞来源载药微颗粒体内过程的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与仪器 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 肿瘤细胞和TRCs培养 |
| 4.3.2 3D-MPs制备 |
| 4.3.3 2D-MPs和3D-MPs软硬度分析 |
| 4.3.4 2D-MPs和3D-MPs在不同渗透压下的变形性 |
| 4.3.5 2D-MPs和3D-MPs软硬度的改变 |
| 4.3.6 软硬度对MPs肿瘤蓄积的影响 |
| 4.3.7 软硬度对MPs体内肿瘤深部穿透行为的影响 |
| 4.3.8 软硬度对MPs在体内肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞内蓄积的影响 |
| 4.3.9 软硬度对MPs在3D肿瘤球深部穿透的影响 |
| 4.3.10 细胞对不同软硬度MPs的摄取 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 2D-MPs和3D-MPs软硬度及变形性分析 |
| 4.4.2 软硬度对MPs在肿瘤组织蓄积的影响 |
| 4.4.3 软硬度对MPs肿瘤组织深部穿透的影响 |
| 4.4.4 软硬度对MPs在体内肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞内蓄积的影响 |
| 4.4.5 TRCs对不同软硬度MPs的摄取 |
| 4.4.6 巨噬细胞对不同软硬度MPs的摄取 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 调控肿瘤干细胞来源载药微颗粒软硬度的分子机制研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与仪器 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 肿瘤细胞和TRCs培养 |
| 5.3.2 MPs和载药MPs制备 |
| 5.3.3 2D-MPs和3D-MPs的蛋白质组学分析 |
| 5.3.4 Western blot检测cytospin-A的表达 |
| 5.3.5 RNA干扰 |
| 5.3.6 Cytospin-A si RNA转染后MPs的软硬度分析 |
| 5.3.7 Cytospin-A对 MPs肿瘤蓄积的影响 |
| 5.3.8 Cytospin-A对载阿霉素MPs肿瘤组织分布的影响 |
| 5.3.9 Cytospin-A对 MPs及载阿霉素MPs体内肿瘤深部穿透行为的影响 |
| 5.3.10 Cytospin-A对MPs及载阿霉素MPs在体内肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞蓄积的影响 |
| 5.3.11 Cytospin-A对载药MPs体内抑制肿瘤效果的研究 |
| 5.4 结果与讨论 |
| 5.4.1 2D-MPs和3D-MPs的蛋白质组学分析 |
| 5.4.2 Western blot检测cytospin-A的表达 |
| 5.4.3 Cytospin-A si RNA转染后对2D-MPs软硬度的影响 |
| 5.4.4 Cytospin-A对 MPs及其负载药物在肿瘤部位蓄积的影响 |
| 5.4.5 Cytospin-A对 MPs及其负载药物在肿瘤部位肿瘤深部穿透的影响 |
| 5.4.6 Cytospin-A对MPs及其负载DOX在体内肿瘤组织中的肿瘤细胞及侧群细胞内蓄积的影响 |
| 5.4.7 Cytospin-A对载药MPs体内抗肿瘤效果的研究 |
| 5.5 本章小结 |
| 6 全文总结与展望 |
| 6.1 主要结果 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 研究展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读博士学位期间发表的论文 |
（3）半枝莲和白花蛇舌草提取物对HBV相关性肝细胞癌的作用及对circRNAs差异表达的影响（论文提纲范文）
| 英文缩略词索引 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 半白提取物对肝细胞癌体内外生长的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药物、细胞株和动物 |
| 1.2 主要试剂和溶液配制 |
| 1.3 主要仪器和耗材 |
| 1.4 半枝莲和白花蛇舌草乙醇提取物的制备 |
| 1.5 细胞培养 |
| 1.6 CCK-8实验 |
| 1.7 平板克隆形成实验 |
| 1.8 细胞周期 |
| 1.9 细胞凋亡 |
| 1.10 Western Blot测定相关蛋白的表达 |
| 1.11 细胞划痕实验 |
| 1.12 Transwell小室迁移和侵袭实验 |
| 1.13 细胞形态和自噬小体超微结构的观察 |
| 1.14 免疫荧光检测自噬相关蛋白的表达 |
| 1.15 RT-PCR检测细胞中HBsAg、HBV-DNA的表达 |
| 1.16 裸鼠成瘤实验 |
| 1.17 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 半枝莲和白花蛇舌草乙醇提取物的制备 |
| 2.2 半白提取物对HepG2.2.15和Hep3B细胞生长的影响 |
| 2.3 半白提取物对细胞平板克隆的影响 |
| 2.4 半白提取物对细胞周期的影响 |
| 2.5 半白提取物对细胞凋亡的影响 |
| 2.6 半白提取物对细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 2.7 半白提取物对细胞划痕愈合的影响 |
| 2.8 半白提取物对细胞Transwell迁移的影响 |
| 2.9 半白提取物对细胞Transwell侵袭的影响 |
| 2.10 半白提取物对细胞形态和自噬体超微结构的影响 |
| 2.11 半白提取物对细胞自噬相关蛋白表达的影响 |
| 2.12 半白提取物对裸鼠致瘤性的影响 |
| 2.13 半白提取物对细胞、肝组织、血清和移植瘤中HBV活性的影响 |
| 第二部分 半白提取物对circRNAs差异表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 药物和细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 样品及分组信息 |
| 1.5 样品准备 |
| 1.6 文库构建 |
| 1.7 簇生成和测序 |
| 1.8 生物信息学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 circRNAs转录组比对 |
| 2.2 差异circRNAs表达谱和鉴定 |
| 2.3 差异circRNAs聚类分析 |
| 2.4 差异表达circRNAs来源基因GO功能分析 |
| 2.5 差异表达circRNAs来源基因KEGG通路分析 |
| 2.6 circRNA-miRNA相互作用预测 |
| 2.7 circRNA-miRNA-gene共表达网络构建 |
| 2.8 circRNAs可视化 |
| 讨论 |
| 1 现代医学对肝细胞癌的认识 |
| 1.1 流行病学研究 |
| 1.2 发病机理 |
| 1.3 肝细胞癌的治疗 |
| 2 中医药抗肝细胞癌研究概述 |
| 2.1 中医药抗肝细胞癌机制的研究 |
| 2.2 中医药抗肝细胞癌的现状 |
| 3 本次研究的理论和实验基础 |
| 3.1 半枝莲治疗肝细胞癌的临床及实验研究 |
| 3.2 白花蛇舌草治疗肝细胞癌的临床及实验研究 |
| 3.3 半枝莲和白花蛇舌草抗肝癌的研究基础 |
| 3.4 CircRNAs对肝细胞癌的研究意义 |
| 3.5 从CircRNAs角度研究半白提取物影响HCC生长的背景 |
| 4 本次研究结果分析 |
| 4.1 半白提取物对肝细胞癌体内外生长的结果分析 |
| 4.2 半白提取物对circRNAs差异表达的结果分析 |
| 5 不足和展望 |
| 创新点 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 :HepG2.2.15细胞部分结果 |
| 附录二 :文库制备的接头和引物 |
| 附录三 :综述 半枝莲和白花蛇舌草抗肝细胞癌作用及机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录四 :在校期间发表学术论文、获奖情况及参加学术会议 |
（4）PID1促进胰岛素抵抗和肝癌发生的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 主要缩略词 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 PID1在肝癌中的的作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 PID1抑制抗肿瘤免疫的作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 PID1负调控胰岛素抵抗的作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 肥胖相关胰岛素抵抗促肝癌的机制研究进展 |
| 综述 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间撰写和发表的论文 |
（5）常春藤皂甙元抗肝癌作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 课题背景及研究目的和意义 |
| 1.2 肝癌的病因及发病机制 |
| 1.3 肝癌的治疗 |
| 1.4 八月札的药理作用 |
| 1.5 常春藤皂甙元的药理作用及研究进展 |
| 1.6 主要研究内容 |
| 第二章 常春藤皂甙元对H22荷瘤小鼠抗肝癌作用研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.3 试验数据的统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 H22瘤源鼠的制备 |
| 2.3.2 H22荷瘤小鼠模型的建立 |
| 2.3.3 H22荷瘤小鼠生存状态观察 |
| 2.3.4 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 2.3.5 HD对H22荷瘤小鼠肝脏和肾脏的组织结构和功能的影响 |
| 2.3.6 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤组织的病理学影响 |
| 2.3.7 免疫荧光法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中相关蛋白的表达 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 H22荷瘤小鼠模型的评价 |
| 2.4.2 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 2.4.3 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤细胞形态学的影响 |
| 2.4.4 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中相关蛋白表达的影响 |
| 2.4.5 HD对H22荷瘤小鼠的毒副作用 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 常春藤皂甙元诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.3 试验数据的统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 HD对H22荷瘤小鼠体重和肿瘤生长的影响 |
| 3.3.2 HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤细胞凋亡的形态学变化 |
| 3.3.3 RT-PCR法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡相关基因mRNA表达 |
| 3.3.4 免疫荧光法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.3.5 Western blot法检测H22荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞发生凋亡的形态学变化 |
| 3.4.2 HD诱导H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞发生凋亡的分子机制 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 常春藤皂甙元对H22荷瘤小鼠免疫功能影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.2.3 试验数据的统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 H22荷瘤小鼠模型的建立 |
| 4.3.2 H22荷瘤小鼠生存状态观察 |
| 4.3.3 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 4.3.4 HD对H22荷瘤小鼠免疫器官免疫功能的调节作用 |
| 4.3.5 HD对H22荷瘤小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响 |
| 4.3.6 HD对H22荷瘤小鼠NK细胞活性的影响 |
| 4.3.7 HD对H22荷瘤小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.3.8 HD对H22荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 HD对H22荷瘤小鼠生存状态的影响 |
| 4.4.2 HD对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的抑制作用 |
| 4.4.3 HD对H22荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数的调节作用 |
| 4.4.4 HD对H22荷瘤小鼠细胞免疫功能的影响 |
| 4.4.5 HD对H22荷瘤小鼠非特异性免疫功能的影响 |
| 4.4.6 HD对H22荷瘤小鼠血清中IL-2、TNF-α的影响 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 常春藤皂甙元对HEPG2细胞抑制作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.2.3 试验数据的统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 HD对HepG2细胞增殖的影响 |
| 5.3.2 HD诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化 |
| 5.3.3 免疫荧光检测HD诱导HepG2细胞凋亡 |
| 5.3.4 流式细胞仪检测HD诱导HepG2细胞凋亡 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 HD对HepG2细胞增殖能力的抑制作用 |
| 5.4.2 HD诱导HepG2细胞凋亡形态学变化 |
| 5.4.3 Annexin V-FITC凋亡检测结果评价 |
| 5.5 本章小结 |
| 第六章 常春藤皂甙元诱导HEPG2细胞凋亡机制研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.2.3 试验数据的统计分析 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 HD对HepG2细胞增殖的影响 |
| 6.3.2 HD诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化 |
| 6.3.3 免疫荧光法检测HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达 |
| 6.3.4 Western blot法检测HepG2细胞中凋亡相关蛋白的表达 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 HD对HepG2细胞增殖能力的影响 |
| 6.4.2 HD诱导HepG2细胞凋亡的形态学变化 |
| 6.4.3 HD诱导HepG2细胞凋亡的分子机制 |
| 6.5 本章小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词语表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间承担的科研任务与主要成果 |
（6）基于选择性致死癌细胞的蓝舌病毒对不同荷瘤模型体内靶向抗癌作用和特征的研究（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 一、肿瘤发病率及死亡率在世界范围内的现状 |
| 二、肿瘤治疗的进展 |
| 三、基因治疗的载体 |
| 四、蓝舌病毒概况 |
| 五、细胞死亡机制 |
| 第一部分 蓝舌病毒4型、9型、16型和21型作用肿瘤细胞的溶癌性研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 第二部分 蓝舌病毒16型在小鼠体内的毒性试验 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 第三部分 蓝舌病毒16型在免疫功能完善的杂交鼠体内抗肝癌H #22的实验研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 第四部分 BTV-16在裸鼠体内抗人肝癌Hep-3B的实验研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 第五部分 蓝舌病毒16型在体外抗Hep-3B细胞、Siha细胞、MA782细胞死亡机制初步研究 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 第六部分 总结 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
（7）不同淋巴道转移潜能的小鼠肝癌克隆细胞株的分离和建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（8）人胎儿源间充质干细胞的分离鉴定及其在免疫性肝损伤中的免疫双效作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 人胎儿源间充质干细胞的分离鉴定及其在免疫性肝损伤中的免疫双效作用研究 |
| 引言 |
| 第一部分 人胎儿源间充质干细胞的分离鉴定及其免疫抑制作用的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图、附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 未预处理的人胎儿源间充质干细胞对ConA 诱导小鼠免疫性肝损伤的促进作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图、附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 经预处理的人胎儿源间充质干细胞对ConA 诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图、附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 经预处理的人胎儿源间充质干细胞致瘤风险性的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图、附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述一 间充质干细胞:细胞免疫治疗的新剂型 |
| 综述二 细胞及其释放细胞因子在 ConA 诱导免疫性肝损伤中的作用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、小鼠肝癌H_(22)细胞克隆株的选择及其细胞特性比较（论文参考文献）
- [1]基于新型网络药理学策略解析复方苦参注射液抗肝癌主要药效成分与作用机制[D]. 王珂欣. 山西大学, 2021(01)
- [2]肿瘤细胞来源微颗粒的软硬度调控纳米药物递送效率[D]. 梁清乐. 华中科技大学, 2020
- [3]半枝莲和白花蛇舌草提取物对HBV相关性肝细胞癌的作用及对circRNAs差异表达的影响[D]. 杨培伟. 上海中医药大学, 2019(03)
- [4]PID1促进胰岛素抵抗和肝癌发生的作用及机制研究[D]. 许倩倩. 华中科技大学, 2019(01)
- [5]常春藤皂甙元抗肝癌作用研究[D]. 白雪. 西北农林科技大学, 2017(11)
- [6]基于选择性致死癌细胞的蓝舌病毒对不同荷瘤模型体内靶向抗癌作用和特征的研究[D]. 刘军. 武汉大学, 2013(05)
- [7]不同淋巴道转移潜能的小鼠肝癌克隆细胞株的分离和建立[D]. 陈万远. 大连医科大学, 2012(01)
- [8]人胎儿源间充质干细胞的分离鉴定及其在免疫性肝损伤中的免疫双效作用研究[D]. 胡洁. 河北医科大学, 2009(10)
- [9]应用RAPD技术检测小鼠肝癌H22细胞克隆株的遗传学改变[J]. 王险峰,陈森洲,刘福英. 广西医科大学学报, 2008(06)
- [10]小鼠肝癌H22细胞克隆株的RAPD分析[J]. 王险峰,张焕铃,刘福英,王俊霞,尤红煜. 中国比较医学杂志, 2007(03)
标签：肝癌论文; 肿瘤论文; 肿瘤细胞论文; 复方苦参注射液论文; 肝癌晚期治疗方法论文;