一、BRM释介素体外抑瘤作用与诱导癌细胞凋亡（论文文献综述）
亓润智[1]（2021）在《基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制》文中进行了进一步梳理研究背景肺癌在我国及世界范围内的发病率、死亡率均居前列。尽管越来越多的肺癌被早期诊断和治疗,新的免疫治疗药物不断问世,放射治疗技术得到不断提升,肺癌患者的总生存时间仍没有得到明显延长,生活质量没有得到明显改善。ⅠA期肺癌患者的5年生存率为83%,ⅢA期患者仅为36%,晚期肺癌患者5年生存率仅3.5%。肺癌的整体中位生存期仍未突破1年。如何减少早期肺癌患者术后复发转移,延长晚期肺癌患者生存期,抑制肺癌进展仍然是目前亟待解决的医学难题。随着大量临床研究证实中医药防治肺癌的有效性,以及基础实验研究对中医药防治肺癌的机制探讨不断深入,中医药在肺癌防治中的地位也逐渐上升。越来越多的研究发现中医药防治肺癌的机制可能与调控肿瘤微环境密切相关。肺癌属中医学“肺积”范畴。《医宗必读》中提到:“积之成也,正气不足,而后邪气踞之”。邪之所凑,其气必虚,正气亏虚则气血阴阳失和,脏腑机能紊乱,气机升降失调。随着中医肿瘤理论的发展,“正虚”是肺癌重要的发病基础已逐渐成为中医肿瘤学术界的共识。肺癌的病机多为虚实夹杂,虚证常见阴虚或气阴两虚,实证多见气滞、痰凝及血瘀,病位在肺,与脾、肾密切相关。气阴两虚、瘀血内阻是肺癌形成与进展的重要因素。肺为娇脏,易受外邪,伤及肺气与肺阴,肺主气功能受损,一身之气不足则邪毒内盛,气不行血、癌毒阻络,则见瘀血内停,瘀毒互结,逐渐形成癌肿。益气养阴活血法是防治肺癌的重要治法之一。双参颗粒由三七、西洋参、冬虫夏草组成,三七活血化瘀兼能补血;西洋参健脾益气而不燥,并能养阴生津;冬虫夏草补益肺肾。三药共奏益气健脾养阴、补益肺肾、金水相生之效,扶正以治本,活血化瘀以治标。临床研究也证明,益气养阴活血法是中医药防治肺癌的重要治法,在临床应用广泛并取得良好疗效。但由于中医临床证候的复杂性,以及中医辨证论治处方的多样性,使中医“益气养阴活血法”防治肺癌的理论未能在细胞分子层面得到很好的验证。我们前期预实验发现双参颗粒可以抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的生长,减少自发肺癌小鼠模型肺部肿瘤形成。同时,对双参颗粒干预后的自发肺癌小鼠与未经过双参颗粒干预的小鼠肺组织进行全转录组测序分析。结果提示在经过双参颗粒干预后,巨噬细胞迁移抑制因子（Macrophage migration inhibitory factor,MIF）,巨噬细胞标志蛋白（MannosereceptorCtype 1,MRC1/CD206）,含锌指转录因子（Kruppel-like factors,KLF）家族如 KLF4、KLF2,基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）家族,以及非编码 RNA（Non-coding RNA）如microRNA-34a（miR-34a）、microRNA-21（miR-21）的表达以及外泌体相关基因表达存在差异。这些差异基因都与肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAMs）表型、功能调控以及外泌体功能密切相关,基于TAMs极化在调控肿瘤微环境影响肿瘤生长中的重要作用,我们从TAMs与肿瘤细胞外泌体入手,探讨双参颗粒抑制荷Lewis肺癌的作用是否与肿瘤细胞外泌体调控TAMs表型和功能相关。研究目的本研究拟通过体内实验与体外实验,借助分子生物学技术,探明双参颗粒抑制肿瘤生长是否与肺癌细胞外泌体调控TAMs表型与功能相关,以及初步探讨双参颗粒通过外泌体影响TAMs极化的机制是否与MIF-miR-34a-KLF4通路相关,为中医药“益气养阴活血法”防治肺癌提供客观依据。研究方法1.构建荷Lewis肺癌小鼠模型,以高、中、低三个剂量的双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠进行干预,观察各组小鼠移植瘤的体积、移植瘤质量,验证以益气养阴活血为治法的双参颗粒对小鼠肺癌的抑制作用。2.通过流式细胞术、免疫荧光染色法,分别对小鼠脾脏、移植瘤组织的M1型与M2型TAMs进行检测,观察双参颗粒对TAMs表型的影响。3.通过Lewis与M1型巨噬细胞混合皮下接瘤的方法,构建M1型TAMs过表达的小鼠肺癌移植瘤模型。观察移植瘤体积与质量,并通过流式细胞术检测小鼠M1型TAMs比例、M2型TAMs比例;免疫组织化学染色检测M1型TAMs标志蛋白一氧化氮合酶（inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS）表达;Western Blot法检测肿瘤组织中精氨酸酶1（Arginase-1,ARG1）、iNOS的表达,探讨双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用与TAMs极化的相关性。4.通过流式细胞术、Western Blot法检测小鼠体内调节性T细胞（Regulatory T cells,Tregs）比例、记忆T细胞比例,肿瘤组织中转化生长因子-β（Transforming growth factor-β,TGF-β）、血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）、MMP-9、MIF的表达,探讨双参颗粒调控肿瘤微环境,调节TAMs功能与调控TAMs极化的相关性。5.构建MIF+/+Lewis稳定转染细胞株、shMIF Lewis稳定转染细胞株,通过双参颗粒含药血清的干预,观察双参颗粒对小鼠肺癌细胞MIF表达的影响。6.提取各组肺癌细胞外泌体,qPCR法检测外泌体中miR-34a表达,观察双参颗粒对Lewis细胞来源外泌体中MIF下游靶基因miR-34a的影响,探讨双参颗粒是否通过影响MIF调节外泌体miR-34a的表达。7.收集双参颗粒干预后的MIF+/+Lewis细胞、MIF+/+Lewis细胞、Lewis细胞、shMIF Lewis细胞来源外泌体;并将各组外泌体对巨噬细胞进行干预,观察各组外泌体对巨噬细胞表型的影响,探讨双参颗粒能否通过肺癌细胞来源外泌体影响巨噬细胞极化,以及这一作用与MIF的关系。8.观察各组肺癌细胞外泌体干预后的巨噬细胞中KLF4基因的表达;探讨经双参颗粒干预后的肺癌细胞外泌体影响巨噬细胞极化与功能的作用是否与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。研究结果1.经双参颗粒干预后,荷Lewis肺癌小鼠移植瘤体积与质量减小,随着双参颗粒剂量的增加,其抑制肿瘤体积与质量的作用逐渐增强,高剂量双参颗粒对肿瘤体积与质量的抑制作用最强。2.高、中、低三个剂量的双参颗粒均能减少小鼠脾脏M2型TAMs 比例,增加M1型TAMs比例,但双参颗粒抑制M2型TAMs比例的作用未表现出与双参颗粒剂量有明确负相关。小鼠脾脏M1型TAMs 比例与双参颗粒剂量呈正相关,随双参颗粒剂量增大M1型TAMs比例逐渐增加。移植瘤组织中CD86的表达与双参颗粒的剂量呈正相关,CD206的表达与双参颗粒的剂量呈负相关。3.与经典的荷Lewis肺癌小鼠模型比较,荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型的肿瘤体积减小,脾脏M1型TAMs比例明显升高。双参颗粒对Lewis+M1混合移植瘤小鼠模型进行干预后,M1型TAMs 比例增加,小鼠肿瘤体积进一步减小,提示双参颗粒抑制Lewis肺癌的作用可能与增加M1型TAMs比例相关。4.双参颗粒可以减少荷Lewis+M1混合移植瘤小鼠肿瘤组织中肿瘤微环境因子 ARG1、TGF-β、MMP-9、VEGF、MIF 的表达,增加 iNOS 的表达。5.双参颗粒能够增加CD8+中枢性记忆T细胞比例,并且与M1型TAMs 比例呈正比;降低CD8+效应性记忆T细胞比例,与M1型TAMs比例呈反比。同时,双参颗粒可以增加CD4+CD25+T细胞比例,减少CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞比例。6.通过慢病毒稳定转染细胞技术成功构建了 MIF+/+Lewis、shMIFLewis稳定转染肺癌细胞株,并分别在基因与蛋白水平进行了验证。7.MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a表达减少。双参颗粒含药血清在体外可以抑制MIF+/+Lewis细胞MIF蛋白与RNA的表达,同时增加MIF+/+Lewis细胞外泌体中miR-34a的表达。8.成功提取MIF+/+Lewis、shMIFLewis、Lewis细胞来源外泌体,并对巨噬细胞进行干预,成功检测到巨噬细胞吞噬外泌体过程。MIF+/+Lewis细胞来源外泌体在体外可以增加M2型巨噬细胞比例,降低M1型巨噬细胞比例;而经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞,其外泌体能够逆转这一作用,增加M1型巨噬细胞比例。9.MIF+/+Lewis细胞外泌体在体外可以增加巨噬细胞中KLF4基因的表达;经双参颗粒含药血清干预后的MIF+/+Lewis细胞外泌体能够减少巨噬细胞KLF4基因的表达。研究结论1.双参颗粒可以抑制小鼠肺癌,其作用机制可能与调控小鼠TAMs向M1型极化相关;肺癌细胞中的MIF可能是双参颗粒的作用靶点之一。2.双参颗粒可以通过肺癌细胞来源的外泌体调控TAMs极化,其机制可能与MIF-miR-34a-KLF4 通路相关。3.中医益气养阴活血法防治肺癌的分子生物学机制可能与调节肿瘤细胞外泌体,调控TAMs极化与功能,重塑肿瘤微环境相关。
张欣蕊[2]（2021）在《毛兰素及其转铁蛋白脂质体抗肝癌活性研究》文中进行了进一步梳理癌症现已被认为是全球性问题,然而目前并没有有效可行的解决方案,癌症已经是继心血管疾病之后的第二大死亡原因,并且发病率和死亡率逐年上升。其中肝癌是最常见的一种癌症,而且肝癌在我国是一种高发癌症。目前治疗肝癌的方式有手术治疗,放射治疗,系统化疗,免疫治疗和中医治疗等,但每种治疗方式都有很多局限性,而且各种治疗引起的免疫系统紊乱,脏器损伤等副作用仍然困扰着广大患者。毛兰素（Erianin）是从鼓槌石斛和铁皮石斛中提取得到的一种低分子量天然产物,近20-30年的研究表明,毛兰素是一个具有潜力的抗癌药物。但是毛兰素水溶性较差,生物利用度低,这极大的影响了其作为治疗药物的开发,因此,选择合适的药物递送载体显得尤为重要。因此,本文主要研究了毛兰素对肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721的抗肿瘤活性,设计并制备了毛兰素转铁蛋白脂质体药物传递系统并对其抗肝癌活性进行了评价。体外实验表明,毛兰素可以通过活性氧（reactive oxygen species,ROS）介导的线粒体通路诱导肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721凋亡,同时外源性凋亡通路也参与其中。具体表现为:毛兰素可以抑制肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721的细胞活力,集落形成以及细胞迁移。并且毛兰素可以激活细胞内半胱天冬酶（Caspase）的活性,增强细胞内Caspase-3,-8和-9的活性,诱导细胞在G2/M期发生细胞阻滞并诱导肝癌细胞凋亡。同时毛兰素还可以增强细胞内ROS的水平并降低线粒体膜电位（Mitochondrial membrane potential,MMP）。免疫印迹（Western blot）实验结果显示,毛兰素可以引起肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721中的半胱天冬酶的激活,引起Caspase级联反应,并引起其底物多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1（poly ADP-ribose polymerase-1,PARP-1）的切割。同时毛兰素可以降低抗凋亡蛋白B-淋巴细胞瘤-2基因（B-cell lymphoma-2,Bcl-2）的表达,并增强促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein,Bax）,Bcl-2相关启动子（Bcl-2 associated death promoter,Bad）,Bcl-2死亡介导物（Bcl-2 interacting mediator of cell death,Bim）和p53上调凋亡调控因子（p53 upregulated modulator of apoptosis,PUMA）的表达。体内实验结果表明,在Hep G2和SMMC-7721裸鼠异位瘤模型中,毛兰素可以抑制Hep G2和SMMC-7721异种移植瘤的生长,并对其体重无明显的影响,病理切片结果显示,给药组与空白组相比,肝细胞和脾细胞结构均一,无明显炎性浸润,说明毛兰素对正常组织无明显毒性作用。经过14天毛兰素的治疗,荷瘤裸鼠肿瘤组织内Cleaved Caspase-3,-8和-9显着增加,并且Cleaved PARP-1也显着增加,与生理盐水对照组相比,毛兰素还增加了肿瘤组织中促凋亡蛋白Bax,Bad,Bim和PUMA的表达并降低了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,这一结果与体外实验结果相一致。在BALB/c小鼠异位瘤模型中,我们发现毛兰素可以降低脾脏细胞中的氧化应激水平,抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）的磷酸化,从而调节炎症因子的分泌,增强机体的抗肿瘤免疫反应。具体表现为:毛兰素可以抑制BALB/c小鼠异位瘤的生长,并且毛兰素对小鼠体重以及脏器组织结构无明显影响,抗体芯片结果表明毛兰素可以引起肿瘤组织中一些细胞因子的变化,即在Hep G2和SMMC-7721荷瘤小鼠肿瘤组织中,分别有38种和15种细胞因子变化大于50%。酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）结果表明毛兰素可以增强荷瘤小鼠血清中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的含量,降低基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9以及白介素（interleukin,IL）-6,IL-10,CC类趋化因子配体（Chemokine C-C motif ligand,CCL）2,CCL11,CCL21,趋化因子（C-X-C基元）配体（chemokine（C-X-C motif）ligand,CXCL）11,CXCL13,CXCL16的表达。毛兰素含有多个甲氧基,可溶解于甲醇、乙醇等有机溶剂,但其水中溶解度低,这极大的影响了其作为治疗药物的开发。因此我们设计了毛兰素脂质体药物传递系统,并对其进行转铁蛋白修饰。本文采用乙醇注入法制备毛兰素脂质体（LP-Erianin）,之后对LP-Erianin进行靶向修饰,得到毛兰素转铁蛋白脂质体（Tf-LP-Erianin）。LP-Erianin和Tf-LP-Erianin在场发射电子扫描显微镜下显示表面光滑,粒径均一,且其粒径分别为62.60 nm和88.63 nm分散系数均小于0.3,符合药典标准。并且在48 h内,粒径稳定性良好。LP-Erianin和Tf-LP-Erianin电位分别是14.5±1.21 m V和2.36±0.36 m V。LP-Erianin和Tf-LP-Erianin中毛兰素的包封率分别是69.5%和68.5%。实验结果显示LP-Erianin和Tf-LP-Erianin具有合理的理化性质,适合对其进行体内体外的活性研究。之后对毛兰素转铁蛋白脂质体进行了抗肝癌活性评价。在体外,毛兰素转铁蛋白脂质体可以抑制Hep G2和SMMC-7721细胞活力,降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡,增强肿瘤细胞对毛兰素的摄取。在体内,我们通过裸鼠异位瘤模型和BALB/c小鼠异位瘤模型证明毛兰素转铁蛋白脂质体药物传递系统可以成功递送毛兰素,并且可以增强毛兰素在体内的抗肿瘤效果,具体表现为:毛兰素脂质体和毛兰素转铁蛋白脂质体均可以抑制异位瘤的生长,并改善毛兰素在裸鼠体内的组织分布,活体成像结果显示,给药后,随着给药时间的延长,毛兰素转铁蛋白脂质体更多的分布于肿瘤组织中,减少了对其他组织的损伤。在BALB/c小鼠异位瘤模型中,毛兰素脂质体和毛兰素转铁蛋白脂质体还可以降低脾脏内的氧化应激水平,增强其免疫调节功能,调节小鼠血清内基质金属蛋白酶,白细胞介素和趋化因子的表达,增强毛兰素的抗肿瘤免疫反应。综上所述,本文通过体内体外实验证明毛兰素可以通过ROS介导的线粒体通路诱导肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721凋亡。同时毛兰素还可以降低脾脏细胞中的氧化应激水平,抑制NF-κB的磷酸化,从而调节炎症因子的分泌,增强机体的抗肿瘤免疫反应。此外,本文成功建立了毛兰素转铁蛋白脂质体药物传递系统,并且从体内体外均证明了毛兰素转铁蛋白脂质体药物传递系统具有抗肝癌活性并且可以增强毛兰素的抗肿瘤效果。用转铁蛋白修饰的脂质体递送毛兰素是一个具有潜力的治疗肝癌的策略。
刘皎皎[3]（2021）在《“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究》文中指出目的:采用随机对照临床试验（RCT）方法观察“补肾生髓成肝”法治疗晚期肝癌的临床疗效,并探究其改善肝癌肝再生微环境的疗效机制,为临床推广应用提供较高级别的循证医学证据。方法:1.采用随机分组法将2017年1月至2020年6月就诊于陕西省中医医院肝病科的入选晚期肝癌患者共126例,基于随机数字表法简单随机分成3组,即西医对照组42例（以下简称西医组）,采用西医综合治疗方案;补肾生髓成肝单独治疗组42例（以下简称中医组）,采用地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减治疗方案;补肾生髓成肝综合治疗组42例（以下简称中西医组）,采用西医治疗组方案基础上加上地五养肝方、抗毒软坚方、左归丸合方化裁,辨证加减。入选后有10例患者脱落（中医组6例,3例因失访脱落,3例因不能坚持治疗脱落;西医组4例,2例因异地就医不便退出,2例因不能坚持治疗脱落）,最终纳入统计分析病例资料的共116例,西医对照组（西医组）38例、补肾生髓成肝综合治疗组（中西医组）42组、补肾生髓成肝单独治疗组（中医组）36例。该研究通过湖北省中医院伦理审查,在中国临床试验注册中心（世界卫生组织国际临床试验平台一级注册机构）完成临床试验注册,注册号:Chi CTR-IOR-17011439。参与研究的患者均自愿签署了知情同意书。对比三组治疗3个月及治疗6个月的生存率及生存期,对比治疗前、治疗后3个月血常规、粪常规加潜血、肝功、血糖、血脂、肾功等指标,对比三组治疗前后的中医证候评分、生存质量评分,并对患者生存期的独立影响因素进行分析。2.依据治疗方案治疗3个月后分别收集中医组、西医组、中西组每组20名患者血清,共60份,正常人群血清18份。收集的血清-80℃冻存于陕西省中医医院肝病实验室。通过悬液芯片系统检测患者血清肝再生相关细胞因子粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony Factor,G-CSF）、肝细胞生长因子（Hepatocyte Growth Factor,HGF）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）、白介素-6/8/18（Interleukin-6,IL-6,Interleukin-8,IL-8,Interleukin-18,IL-18）、血小板源性生长因子（Platelet Derived Growth Factor,PDGF-BB）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Nnecrosis Factor-α,TNF-α）的含量,观察体现“补肾生髓成肝”的中药对这些细胞因子的影响。结果:（1）三组患者治疗前后生存率及生存期比较:治疗3个月及6个月后,中西医组、中医组和西医组生存率比较,有统计学差异（88.10%VS72.22%VS52.63%）、（71.43%VS58.33%VS34.21%）（P<0.05）。治疗后中西医组、中西组和西医组患者生存期比较,具有统计学差异（23.86±17.55VS20.08±19.86VS15.95±16.44）（P<0.05）。（2）三组患者治疗前后肿瘤大小比较:中西医组、中医组和西医组组间比较及前后测量时间比较,差异不具有统计学意义（P>0.05）。（3）三组患者治疗前后肝功指标比较:中西医组患者治疗后直接胆红素水平、间接胆红素水平、谷丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶水平较治疗前显着降低（P<0.05）,组间比较无统计学差异（P>0.05）。中医组治疗后胆碱酯酶水平较治疗前显着升高,组间比较不具有统计学意义（P>0.05）。三组患者治疗前后白蛋白水平比较,具有统计学意义（P<0.05）;两两比较,中西医组及中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（4）三组患者治疗前后其他生化指标比较:三组患者治疗后血常规指标中白细胞水平、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板水平,中西医组、中医组与西医组比较,差异均具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后肌酐水平比较,中西医组、中医组与西医组比较,具有统计学意义（P<0.05）。（5）三组患者治疗前后中医证候评分比较:三组患者治疗前后中医证候评分以时间因素为源的主体内差异及以组别为源的主体间效应,具有统计学意义（P<0.05）。三组患者治疗后的中医证候评分均显着低于治疗前,差异具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组显着低于西医组的中医证候评分,差异具有统计学意义（P<0.05）。（6）三组患者治疗前后生存量表积分比较:三组患者生理机能积分方面治疗后积分均显着高于治疗前,具有统计学意义（P<0.05）。治疗后中西医组、中医组与西医组的社会功能评分比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。三组患者在生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,有统计学意义（P<0.05）,且两两组间比较后中西医组与中医组、西医组的生理职能、躯体疼痛、一般健康状况三个维度的积分组间比较,差异具有统计学意义（P<0.05）。（7）HGF表达水平比较:西医组明显高于中西医组、中医组及正常人群组,差异具有统计学意（2255.17VS1097.76VS1072.39VS882.67）（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制HGF的过度表达。（8）IL-6表达水平比较:中医组、中西医组及西医组均低于正常人群组,且组间差异具有统计学意义（5638.03VS5166.45VS12842.5VS24559.34）（P<0.05）。中西医组、中医组IL-6表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗可在一定程度上抑制IL-6的过度表达。（9）IL-18表达水平比较:西医组、中西医组及中医组,比较差异不具有统计学意义（120.345VS82.61VS78.58）（P>0.05）,但均较正常人群组升高（75.165）。提示单用“补肾生髓成肝”或配合西医综合治疗同样可以促进IL-18的表达。（10）PDGF-BB表达水平比较:中医组相对中西医组、西医组降低,差异不具有统计学意义（4677.18VS6140.6VS5534.885）（P>0.05）。但中医组低于西医组及中西医组,且更接近正常人群组（4401.67）。提示单用“补肾生髓成肝”可以抑制PDGF-BB的过度表达。（11）TNF-α表达水平比较:西医组、中西医组、中医组及正常人群组比较差异具有统计学意义（735.955VS244.93VS573.46VS1037.25）（P>0.05）。中西医组TNF-α表达水平明显低于正常人群组,差异具有统计学意义（P<0.05）。提示单用“补肾生髓成肝”可以更好的抑制TNF-α的过度表达。结论:“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌能够显着提高晚期肝癌患者3个月及6个月的生存率及生存期,改善晚期肝癌患者临床症状同时,改善患者各种生化指标。明显降低晚期肝癌患者的中医证候评分,提高患者的生存质量,为临床推广应用提供了较高级别的循证医学证据。“补肾生髓成肝”治疗晚期肝癌患者的疗效机制之一可能是通过抑制晚期肝癌患者HGF、PDGF-BB、TNF-α、IL-6的过度表达,同时升高晚期肝癌患者IL-18的表达,改善肝癌的肝再生微环境及其相关的炎症微环境、免疫微环境、血管新生微环境等。
韩敏敏[4]（2021）在《钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究》文中研究表明目的:本论文主要从体外与体内两方面分别探讨钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究。体外水平主要探究藻蓝蛋白对肿瘤细胞是否具有直接抑制作用,并从蛋白表达的水平研究藻蓝蛋白的抗肿瘤作用机制。体内实验的主要内容为藻蓝蛋白介导的光动力疗法治疗小鼠SW1990细胞瘤的抗肿瘤作用的研究,探讨藻蓝蛋白的体内抑瘤效果以及从机体免疫调节的角度初步探讨抑瘤作用。通过体外细胞培养实验和裸鼠荷瘤实验,分别检测钝顶螺旋藻藻蓝蛋白在体内外的抗肿瘤作用效果,并对其抗肿瘤作用机制进行初步探讨,为藻蓝蛋白的临床抗肿瘤应该提供实验依据。方法:本论文探讨了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其作用机制的研究,主要包括3个方面。（1）钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的体外抑瘤作用的研究。即采用8种肿瘤细胞（人肺鳞癌SK-MES-1细胞、人舌癌Tca-8113细胞、人胃癌SGC-7901细胞、人膀胱癌EJ细胞、人食道癌Eca-109细胞、人卵巢癌A2780细胞、人肝癌MHCC97-H细胞和人胰腺癌SW1990细胞）作为体外模型进行抗肿瘤活性初筛实验,探究藻蓝蛋白对肿瘤细胞的生长是否具有直接抑制的作用。根据初筛实验结果得出藻蓝蛋白对人肝癌细胞（MHCC97-H）和人胰腺癌细胞（SW1990）的抑制作用最强。随后测定了藻蓝蛋白对这2株肿瘤细胞和1株正常肝细胞（L-O2）的体外增殖影响,初步探究藻蓝蛋白对肿瘤细胞的抑制作用及量效和时效关系。利用倒置显微镜从形态学角度直观观察藻蓝蛋白对2株肿瘤细胞凋亡后引起的细胞形态的改变。（2）藻蓝蛋白介导光动力疗法治疗小鼠SW1990细胞瘤的抗肿瘤作用研究。采用BALB/c纯系裸鼠接种人胰腺癌SW1990细胞,构建异体移植瘤动物模型。结合光动力疗法初步探讨藻蓝蛋白的体内抗肿瘤效果,以及从能否提高机体免疫调节功能的角度研究其抗肿瘤作用及机制。（3）钝顶螺旋藻藻蓝蛋白抗肿瘤作用机制的研究。为进一步探究藻蓝蛋白如何抑制肿瘤细胞的生长与促进肿瘤细胞的凋亡,本论文采用流式细胞术检测细胞凋亡变化情况并利用Western Blot技术检测凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bcl-xl、Bax、Bad）的表达水平。利用体外划痕修复实验初步检测藻蓝蛋白处理后的肿瘤细胞的体外迁移能力,进一步检测迁移相关基蛋白（MMP9和MMP2）的表达水平。结果:（1）体外培养条件下采用MTT法检测不同浓度的藻蓝蛋白（终浓度为10、20、40、80、160、320μg/mL）对肿瘤细胞生长的影响。初筛实验结果显示,与对照组相比,藻蓝蛋白对8种肿瘤细胞的生长均有不同程度的抑制效果,并随着其作用浓度和作用时间的延长,抑制作用表现出显着的浓度—剂量依赖性效应。其中,藻蓝蛋白对人肝癌MHCC-97H细胞和人胰腺癌SW1990细胞的抑制效果最强。随后检测藻蓝蛋白对2株肿瘤细胞和1株正常细胞的体外增殖影响。结果显示藻蓝蛋白对2株肿瘤细胞均存在显着的量效与时效关系,但对正常细胞L-O2无抑制作用。根据初筛实验结果设定藻蓝蛋白的最佳作用浓度范围,后续将藻蓝蛋白抗肿瘤活性验证实验的作用浓度统一调整为三个具有代表性的浓度（80、160、320μg/mL）。倒置显微镜下观察藻蓝蛋白对2株肿瘤细胞形态的影响,镜下观察发现藻蓝蛋白能使MHCC97-H细胞表面发生皱缩,尾部边缘呈伸长趋势,细胞间隙变大。能使SW1990细胞由贴壁状态转为游离状态,细胞边缘不规则且皱缩。形态观察显示出藻蓝蛋白能引起2株肿瘤细胞的形态发生异常性改变,初步认为藻蓝蛋白能促使肿瘤细胞发生凋亡。（2）体内实验分析结果表明,激光照射组、藻蓝蛋白组以及藻蓝蛋白+激光照射组对裸鼠异体移植瘤的抑瘤率分别高达39.90%、45.12%、75.51%。因此,经过激光照射和藻蓝蛋白作用后均具有显着抑制肿瘤生长的效果,而二者合用后抑瘤效果更加明显。激光和藻蓝蛋白处理后均能促进小鼠脾脏生长发育,以及增加脾器指数,二者联合处理效果更加显着（P<0.01）。利用ELISA法测定小鼠脾细胞培养液和血清中TNF-α的表达水平,以及小鼠血清IL-6的表达含量。实验结果显示,与模型组相比,激光和藻蓝蛋白均能增加TNF-α和IL-6的表达量,说明其能增强肿瘤小鼠的机体免疫力,从而发挥抑制肿瘤生长的作用。（3）利用流式细胞术检测藻蓝蛋白作用后的肿瘤细胞凋亡的变化情况,结果表明藻蓝蛋白处理后的2株肿瘤细胞的早期和晚期凋亡比例随其浓度的增加而增加。为进一步验证藻蓝蛋白对凋亡蛋白的调控机理,选取凋亡效果最佳的浓度320μg/mL进行Western Blot检测。实验结果发现,藻蓝蛋白能上调促凋亡蛋白（Bax和Bad）和下调抑凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xl）的表达水平。表明藻蓝蛋白能通过调控凋亡蛋白的表达而导致细胞凋亡。再者,依据肿瘤细胞的迁移特性进行细胞划痕修复实验来探究藻蓝蛋白对肿瘤细胞的体外迁移能力的影响。结果表明,细胞迁移率随藻蓝蛋白作用浓度的而增加而降低,表明藻蓝蛋白能抑制2株肿瘤细胞的体外迁移。随后进一步检测了与2株肿瘤细胞有关的迁移蛋白（MMP9和MMP2）的表达情况,结果显示藻蓝蛋白能够通过下调MMP9和MMP2蛋白的表达水平来发挥抑制细胞体外迁移的能力。结论:钝顶螺旋藻藻蓝蛋白对体外不同肿瘤细胞系均有广谱抗肿瘤活性,其通过诱导肿瘤细胞凋亡蛋白和促进肿瘤细胞迁移蛋白来发挥抗肿瘤的作用机制。体内实验部分主要为藻蓝蛋白结合光动力疗法治疗小鼠SW1990细胞瘤的研究,探讨藻蓝蛋白通过增强机体的免疫系统功能以达到抑制肿瘤生长的目的,从而发挥抗肿瘤的作用。
时莹歌[5]（2021）在《刺激响应聚氨基酸水凝胶的制备及其抗肿瘤应用研究》文中指出近年来,人们对肿瘤微环境的认识逐渐增加。调节肿瘤微环境也日益成为肿瘤治疗中的重要组成部分。免疫逃逸是肿瘤细胞演变出来逃避免疫系统“追杀”的一种机制。目前研究发现,肿瘤免疫逃逸主要借助于两个免疫检查点通路,包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）通路和程序性细胞死亡受体-1/程序性细胞死亡配体-1（PD-1/PD-L1）通路。而且,肿瘤免疫逃逸过程也与肿瘤弱酸性、乏氧和高间质压的微环境密切相关。这三大特征既是肿瘤恶性增殖的结果也是促进肿瘤增殖和转移的诱因。随肿瘤细胞大量增殖,局部氧含量降低,肿瘤细胞代谢方式逐渐转变为糖酵解,产生大量乳酸,在肿瘤细胞内转化后以H+形式排出。加之肿瘤恶性增殖导致的血管扭曲,肿瘤局部代谢产物不能被及时运出,造成H+堆积,加剧酸性特征。缺氧和酸性特征共同刺激血管生成素分泌,大量结构不完整的非功能性血管形成,造成血管“泄露”,肿瘤间质压力升高。而且,肿瘤微环境复杂多变。通过温敏性可注射水凝胶局部给药可以降低化疗药物通过全身给药方式造成的全身毒性,增加病灶部位的药物浓度,延长药物释放时间。本论文以可注射聚氨基酸水凝胶为载体,针对免疫检查点阻断与肿瘤微环境调节,结合使用化疗药物,设计了载药水凝胶体系用于抗肿瘤联合治疗。具体研究内容和主要结论如下:（1）构筑了负载化疗药物阿霉素（Dox）和免疫检查点抑制剂aPD-L1抗体的温敏可注射聚氨基酸水凝胶治疗平台。通过胺基封端甲氧基聚乙二醇（mPEG-NH2）引发γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧基环内酸酐（ELGNCA）开环聚合,合成了PEG-PELG两嵌段共聚物,具有在体温下热敏成胶的特性。细胞毒性实验证明材料没有细胞毒性。体外降解实验说明水凝胶具有可降解性。将药物和聚合物溶液混合后体外成胶验证了该水凝胶药物缓释的功能。体外细胞实验结果显示负载Dox和aPD-L1水凝胶会引起B16F10细胞膜表面钙网蛋白（CRT）表达。进一步研究了该载药体系对移植B16F10黑色素瘤的C57BL/6N小鼠的肿瘤抑瘤效果。体内抑瘤实验结果证明了水凝胶缓释药物延长药物作用时间有利于增强抗肿瘤效果,Dox和aPD-L1联用可以提高肿瘤的抑制率、延缓肿瘤生长和延长小鼠生存期。（2）开发了生理相关温度和pH双重响应PEG-聚氨基酸可注射水凝胶。在第一部分工作中使用的温敏性材料的基础上,通过增加氨基酸单元并经侧链“点击”反应引入可质子化的双N取代哌嗪,通过改变聚氨基酸链长、可质子化链段比例和嵌段聚合物结构等,合成出一系列具有温度敏感性和可质子化的聚氨基酸材料。材料的最小成胶浓度达1.5%（w/v）,成胶浓度范围大,成胶温度可以控制在0～70℃。聚氨基酸链段可以通过改变pH发生质子化和去质子化转变,进而产生溶胶-凝胶可逆相变。该系列水凝胶材料可以对于生理相关pH变化（pH 6.5～7.4）产生响应。同时发现,该系列聚合物所制备的水凝胶对多种材质具有粘附性。其中,对PMMA的黏附能有一定的pH依赖性。（3）研究了可质子化双响应PEG-聚氨基酸水凝胶用于Dox和NO供体单硝酸异山梨酯（ISMN）的局部缓释与抗肿瘤性能。该材料制备的水凝胶表现出较好的体外与体内成胶性能、降解性,以及良好的生物相容性。药物释放实验说明可质子化双响应水凝胶具有药物缓释的功能。细胞实验显示负载Dox水凝胶和游离Dox一样,可以引起B16F10细胞CRT外翻。动物实验证明,该水凝胶可以增加肿瘤内的M1型巨噬细胞比例,ISMN可以缓解局部乏氧。通过负载Dox和ISMN的水凝胶对荷瘤小鼠模型瘤内注射,发现载药凝胶可以显着抑制肿瘤生长。
尹良伟[6]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中研究指明自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
李仕存[7]（2020）在《旋毛虫对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究》文中研究指明旋毛虫是一种具有独特生物学特性的食源性人兽共患寄生虫,它的整个生活周期都在同一宿主中完成,并且在不同的发育阶段其在宿主体内寄生的部位也不相同,旋毛虫成虫（Adult worm,Ad）主要寄生于宿主的肠道中,新生幼虫（Newborn larvae,NBL）主要分布在肠道和血液循环系统中,肌幼虫（Muscle larvae,ML）主要寄生于宿主的横纹肌中。为了在宿主体内创造一个适合自身生存的环境,同时又不对宿主产生过度的刺激,旋毛虫能够在各个发育阶段调节宿主的免疫应答,诱导宿主机体产生复杂的免疫反应。研究表明旋毛虫的排泄/分泌产物（Excretory/secretory products,ESP）具有多种生物学功能,ESP可降低旋毛虫入侵宿主细胞时引起的炎症反应、诱导宿主细胞凋亡、参与宿主细胞生理生化特性的改变以及细胞结构的重建等。基于ESP独特的生物学特性以及调控宿主免疫应答的能力,旋毛虫及其ESP已被用于不同疾病的治疗研究。国内外研究表明感染旋毛虫能够提高宿主对肿瘤的抵抗能力,旋毛虫ESP能够在体外抑制肿瘤细胞的增殖。但是目前旋毛虫抗肿瘤作用的具体机制尚不清楚。本研究旨在探究旋毛虫感染以及旋毛虫肌幼虫ESP（ML ESP）和成虫新生幼虫ESP混合物（Ad6 ESP）对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其可能存在的作用机制。本研究采用感染旋毛虫（350条/只）第7 d的BALB/c小鼠,通过右前肢腋下注射5×106个小鼠H22肝癌细胞构建小鼠H22肝癌实体瘤模型,同时设置未感染旋毛虫的实体瘤模型作为对照组,探究旋毛虫感染对小鼠H22肝癌实体瘤的抑制作用,结果显示抑瘤率为63.49%,表明旋毛虫感染能够明显抑制小鼠H22肝癌实体瘤在小鼠体内的生长。为进一步探索旋毛虫感染诱导宿主免疫对抗小鼠H22肝癌实体瘤的作用,本研究将100只BALB/c小鼠随机分成空白组（20只）、旋毛虫组（20只）、荷瘤组（30只）、旋毛虫+荷瘤组（30只）。旋毛虫+荷瘤组小鼠在感染旋毛虫后的第7 d（实验第7天）接种小鼠H22肝癌细胞,荷瘤组与旋毛虫+荷瘤组小鼠接种小鼠H22肝癌细胞的时间点相同。在实验的第7 d,14 d,21 d,28 d,35 d每组各处死3只小鼠并收集脾细胞,一部分细胞用于培养收集上清,一部分细胞-80℃冰箱保存用于提取总RNA。采用qPCR法检测脾细胞中白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的表达量,ELISA法检测脾细胞培养上清中的白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）的含量。结果显示旋毛虫组和旋毛虫+荷瘤组小鼠脾细胞中IL-2和IFN-γ的表达量在实验第7 d、14 d、21 d呈现较高水平的表达,在实验第28d、35 d旋毛虫组和旋毛虫+荷瘤组IL-2和IFN-γ的蛋白表达量下降且与空白组和荷瘤组相比差异不明显,旋毛虫组和旋毛虫+荷瘤组小鼠脾细胞培养上清中IL-4的表达量在实验第14 d、21 d一直处于高表达状态,表明旋毛虫感染早期诱导宿主产生的Th1细胞因子IL-2、IFN-γ可能抑制肿瘤的进一步发展。此外本实验收集旋毛虫不同时期的ESP,于体外探究其对小鼠H22肝癌细胞的细胞增殖和细胞凋亡的影响,通过建立旋毛虫与肿瘤共感染模型于体内探究旋毛虫感染是否能够诱导肿瘤组织内细胞发生凋亡。CCK-8检测结果显示当旋毛虫ML ESP和Ad6 ESP浓度大于0.2 mg/mL时对小鼠H22肝癌细胞的细胞增殖具有明显的抑制作用。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测显示浓度为0.4mg/mL的旋毛虫ML ESP和Ad6 ESP刺激小鼠H22肝癌细胞48h后的凋亡率分别为18.02%和14.89%,Western blotting检测结果显示小鼠H22肝癌细胞和肿瘤组织中Bax/Bcl-2比例和Caspase-3的表达量均上调。结果表明ML ESP和Ad6 ESP能够对小鼠H22肝癌细胞的生长产生抑制作用并诱导其发生凋亡,旋毛虫感染的H22荷瘤小鼠肿瘤组织内促凋亡基因Bax和Caspase-3表达量升高,促进了肿瘤组织内细胞凋亡,抑制了小鼠H22肝癌实体瘤的进一步发展。
吕鹏[8]（2020）在《龙贝逍遥散调控miR-145/c-Myc/TP53信号通路抗乳腺癌机制研究》文中认为乳腺癌是世界最常见的恶性肿瘤之一。我国乳腺癌的死亡率呈持续上升趋势,据世界卫生组织国际癌症研究中心IARC预计,在2030年我国乳腺癌发病数可达到23.4万例。目前,紫杉类药物及蒽环类药物仍是治疗乳腺癌单药有效的化疗药物。然而,临床实践证实仍有30%～50%的乳腺癌患者对其不敏感。中医药在乳腺癌多学科综合治疗方案具有生存时间及生活质量优势。乳腺癌属于中医学“乳岩”及“乳石痈”等范畴。根据乳腺癌“肝郁脾虚、痰瘀互阻”的病机特点,课题组提出乳腺癌的基本治则是“疏肝健脾,活血化痰”。逍遥散具疏肝解郁,健脾养血之功,为疏肝健脾的经典古方。加入具有活血化痰功效的穿山龙、浙贝母组成的龙贝逍遥散辨证加减应用于临床取得较好临床疗效,机制研究发现逍遥散类方剂抗乳腺癌癌作用可能与调控凋亡相关基因及靶蛋白表达有关。乳腺癌是一个多基因、多因素、多阶段及多途径的复杂过程,乳腺癌的发生和发展包括遗传改变和表观遗传的改变。从遗传及表观遗传方面综合深入探索其靶点及作用机制,为临床验方龙贝逍遥散推广应用于乳腺癌的综合治疗方案具有重要意义。目的1.在明确龙贝逍遥散对人正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞增殖与迁移作用,以及miR-145甲基化及低表达对乳腺癌细胞增殖与迁移的作用及作用机制的前提下,明确龙贝逍遥散体外对乳腺癌细胞的作用机制;2.明确龙贝逍遥散对体内乳腺癌移植瘤的作用及作用机制。方法1.体外实验观察龙贝逍遥散抑制乳腺癌细胞增殖与迁移的作用及作用机制研究:①龙贝逍遥散抑制人乳腺癌细胞功能实验:CCK-8法筛选龙贝逍遥散抑制乳腺癌细胞增殖的浓度;根据IC50值的药物浓度进行细胞划痕实验,检测龙贝逍遥散抑制乳腺癌细胞迁移的作用;②慢病毒转染miR-145入乳腺癌细胞系MDA-MB-231,CCK8法及划痕实验检测miR-145对乳腺癌细胞增殖与迁移作用,qPCR法检测miR-145对miR-145/c-Myc/TP53信号通路及凋亡相关基因caspase3、Bcl-2及Bax表达的影响;③BSP及qPCR法检测龙贝逍遥散冻干粉乳腺癌细胞miR-145启动子甲基化及miR-145表达的调控作用,以及龙贝逍遥散冻干粉对miR-145/c-Myc/TP53信号通路及凋亡相关基因caspase3、Bcl-2及Bax表达的影响。2.体内移植瘤实验观察龙贝逍遥散对乳腺癌移植瘤的作用及作用机制研究:构建MDA-MB-231及高表达miR-145的MDA-MB-231的乳腺癌移植瘤模型,设立正常对照组、肿瘤模型组、高表达miR-145移植瘤组、龙贝逍遥散冻干粉组、紫杉醇组、联合用药组（龙贝逍遥散冻干粉联合紫杉醇）进行药物干预,观察裸鼠一般状态;给药结束后剥离瘤体,测量移植瘤长短径,计算瘤体积、移植瘤瘤重和抑瘤率;观察裸鼠生存期;BSP及qPCR方法检测龙贝逍遥散对移植瘤组织miR-145启动子甲基化及miR-145表达的影响,以及龙贝逍遥散对miR-145/c-Myc/TP53通路及凋亡相关基因caspase3、Bcl-2及B ax表达的影响。结果1.体外实验龙贝逍遥散抑制乳腺癌细胞增殖与迁移的作用及作用机制:①龙贝逍遥散冻干粉对三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231的IC50值,48h为0.7613mg/ml,72h为0.7664mg/ml。龙贝逍遥散冻干粉对ER阳性乳腺癌细胞株MCF-7的IC50值,48h为1.261mg/ml,72h为1.095mg/ml。龙贝逍遥散冻干粉对人正常乳腺上皮细胞 MCF-10A 的 IC50 值,48h 为 2.891mg/ml,72h 为 2.423mg/ml。MDA-MB-231细胞IC50值最小,对中药最为敏感,而正常乳腺上皮细胞MCF-10A的IC50值最大,表明该细胞对中药处理最为耐受;且龙贝逍遥散冻干粉在MCF-7及MDA-MB-231的IC50值内对MCF-10A无明显抑制作用甚至促增殖作用。相同条件培养48h后,根据MDA-MB-231及MCF-7的IC50值浓度,龙贝逍遥散冻干粉能明显抑制乳腺癌细胞迁移（P<0.05）,而对人正常乳腺上皮细胞迁移无明显抑制作用（P>0.05）。②荟萃分析结果表明,miR-145在乳腺癌组织中的表达明显低于癌旁组织和正常乳腺组织,SMD为-2.90（95%CI=-3.11,-2.70）。此外,ER阳性和HER-2阳性乳腺癌组织中miR-145表达明显低于ER及HER-2阴性乳腺癌组织。miR-145在淋巴结转移阴性或直径小于2cm的乳腺癌患者中的表达明显高于淋巴结转移阳性或直径大于2cm的乳腺癌患者（P<0.001）。MCF-7及MDA-MB-231乳腺癌细胞miR-145启动子处于高甲基化状态,其miR-145表达明显低于人正常乳腺上皮细胞MCF-10A;慢病毒转染miR-145入MDA-MB-231细胞后,发现miR-145能抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖与迁移。过表达miR-145可上调MDA-MB-231细胞Bax及caspase3 mRNA表达水平（P<0.01）,下调c-Myc及Bcl-2的mRNA表达水平（P<0.01;P<0.001）,但对TP53无显着影响（P>0.05）。③龙贝逍遥散冻干粉0.8mg/ml干预MDA-MB-231细胞24h后,可部分下调MDA-MB-231细胞miR-145启动子的甲基化状态,并可上调MDA-MB-231细胞miR-145、TP53、Bax 及 caspase3 mRNA 表达水平（P<0.01）,下调 c-Myc 及 Bcl-2 的mRNA表达水平（P<0.05;P<0.01）。2.龙贝逍遥散对体内乳腺癌移植瘤的作用及作用机制:①miR-145高表达移植瘤组、龙贝逍遥散冻干粉组、联合用药组及正常对照组裸鼠状态较好,反应灵敏,活动及饮食、饮水量正常,皮肤红润;模型对照组及紫杉醇组裸鼠一般状态较差。②各组裸鼠腋下移植瘤持续增长,模型对照组裸鼠瘤块生长速度从给药后第4天开始明显快于miR-145高表达移植瘤组、紫杉醇组、龙贝逍遥散冻干粉组、联合用药组。药物干预10天后取材,肿瘤模型组、高表达miR-145移植瘤组、龙贝逍遥散冻干粉组、PTX组及联合用药组瘤重分别为1.01±0.20g、0.73±0.13g、0.55±0.10g、0.53±0.10g及0.42±0.04g。高表达miR-145移植瘤组、龙贝逍遥散冻干粉组、PTX组及联合用药组的抑瘤率分别为27.72%、45.54%、47.52%及58.42%,联合用药组对三阴性乳腺癌移植瘤的抑瘤率最高。③利用Log-rank（Mantel-Cox）test（conservative）统计分析生存期,龙贝逍遥散组生存期优于联合用药组优于高表达miR-145移植瘤组优于PTX组优于肿瘤模型组,但差异均无统计学意义（P>0.05）。④体内机制研究表明,经过药物干预后,龙贝逍遥散冻干粉分及联合用药组移植瘤组织细胞miR-145表达较肿瘤模型组比较明显上升（P<0.01）,PTX组较肿瘤模型组具有上升趋势（P>0.05）。与肿瘤模型组比较,龙贝逍遥散冻干粉组、PTX组及联合用药组TP53、caspase3及BAX相对表达量不同程度上升,c-Myc及BCL-2相对表达量呈现不同程度下调,且龙贝逍遥散冻干粉联合应用PTX较单纯应用PTX比较,在TP53、c-Myc及BCL-2mRNA相对表达量上具有协同作用（P<0.05）。结论1.龙贝逍遥散能抑制乳腺癌细胞MCF-7及MDA-MB-231的增殖与迁移,在抑制乳腺癌细胞的有效剂量内对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A无明显增殖抑制作用,显示出一定的靶向性,尤其对于三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞最为敏感;2.基于文献荟萃分析及细胞实验证实miR-145启动子甲基化及低表达与乳腺癌发生发展密切相关,miR-145可通过调节miR-145/c-Myc/TP53信号通路及凋亡相关基因表达抑制乳腺癌细胞增殖与迁移;3.龙贝逍遥散抑制乳腺癌细胞增殖与迁移的机制可能与通过miR-145启动子去甲基化调控miR-145/c-Myc/TP53信号通路及凋亡相关基因caspase3、Bcl-2及Bax等表达有关;4.龙贝逍遥散可改善乳腺癌移植瘤小鼠的一般状态,提高小鼠生存质量,延长小鼠生存期,抑制小鼠乳腺癌移植瘤的生长,与紫杉醇联合应用能提高紫杉醇的抑瘤作用,其作用机制可能通过miR-145启动子去甲基化调控miR-145/c-Myc/TP53信号通路及凋亡相关基因caspase3、Bcl-2及Bax等发挥抗小鼠移植瘤作用。
郑佳彬[9]（2020）在《复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究》文中提出立题依据:研究背景:恶性淋巴瘤（ML）是一组起源于淋巴系统的恶性肿瘤,多发生于淋巴结和（或）结外部位淋巴组织,通过肿瘤细胞表面的白细胞分化抗原不同可将其分为T细胞来源淋巴瘤及B细胞来源淋巴瘤两大类。T细胞淋巴瘤临床较B细胞淋巴瘤较为少见,仅约占所有淋巴瘤的10%-15%。但这类淋巴瘤由于其亚洲人群高发病率、明显的个体异质性、广泛的症状特异性、较差的治疗预后和转归及大多数在治疗2-3年内复发的特点,也一直受到国内外学者的广泛重视。复方苦参注射液由于其抗肿瘤、镇痛、增强免疫等功效,常用于晚期患者的维持治疗及放化疗辅助治疗。中国中医科学院首席研究员、中国中医科学院广安门医院肿瘤科前主任林洪生教授在多年的淋巴瘤患者诊治过程中发现复方苦参注射液在治疗缓慢进展的T细胞淋巴瘤,尤以伴以多种形式皮肤损伤的患者效果显着,填补了缓慢进展或除皮肤受累症状外并无其他淋巴结或结外器官受累症状的患者等待观察期无药可用的空白,缓解了患者症状,显着改善生活质量。研究目的:本研究分别通过体内及体外实验设计,探索复方苦参注射液对不同人源淋巴瘤细胞系的干预作用,并在小鼠体内模型中进一步验证和探索其免疫调控作用机制。为复方苦参注射液临床有效性是否源于其对淋巴瘤抑制调节作用提供进一步科学依据。研究方法:1.复方苦参注射液对淋巴瘤细胞增殖、凋亡、细胞周期的影响1.1复方苦参注射液对不同淋巴瘤细胞系增殖的影响及筛选分别培养Hut78（人源皮肤T细胞淋巴瘤细胞株）、Loucy（人源T淋巴细胞白血病细胞株）、Jurkat（人源T淋巴细胞白血病细胞株）、Raji（人源B细胞淋巴瘤细胞株）、EL4（鼠源T淋巴细胞白血病细胞株）5种不同淋巴瘤细胞株。通过比较CCK8及prestoblue敏感度及复方苦参注射液颜色带来的影响,选择prestoblue法作为细胞活力检测试剂。使用prestoblue法及细胞计数法重复验证不同浓度（0.039-5mg/ml）复方苦参注射液对不同细胞株干预后24h、48h、72 h、96h后对其增殖的影响。从而筛选增殖抑制有效及敏感的细胞株。1.2复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞周期的调节作用对上一步筛选敏感细胞株Hut78、Loucy细胞采用PI染色,通过流式细胞仪检测细胞周期,分析不同剂量复方苦参注射液对细胞周期的调节作用。1.3复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞凋亡的影响对敏感细胞株Hut78、Loucy细胞采用7AAD/AnnexinV双染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分析不同剂量复方苦参注射液对细胞凋亡的诱导作用。并通过Western Blot法检测凋亡相关内切酶casepase3、casepase7表达进一步证实凋亡的发生。2.复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞信号调控通路蛋白表达的影响应用反向蛋白阵列术（RPPA）检测敏感细胞株Hut78经不同剂量复方苦参注射液干预24h后蛋白表达差异,聚类分析潜在作用通路,蛋白质印迹法（WB）验证相关有效通路蛋白在复方苦参注射液干预的Hut78、Loucy细胞蛋白表达中的影响,明确复方苦参注射液抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等生物学行为的调控机制。3.复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞能量代谢的影响使用高压液相和质谱联用的方法定量检测敏感细胞株Hut78、Loucy经不同剂量复方苦参注射液干预24h后代谢产物表达差异,明确复方苦参注射液影响肿瘤细胞能量代谢生物学行为的调控机制。4.复方苦参注射液对EL4淋巴瘤动物模型的体内实验研究4.1复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型生存期的影响使用C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,将荷瘤小鼠随机分为低、中、高剂量（2ml/kg、4ml/kg、8ml/kg）复方苦参注射液组,甲氨喋呤（MTX）组,生理盐水组以腹腔注射方式干预荷瘤小鼠14天,观察记录其对瘤体大小、小鼠体重及生存期的影响,探索CKI治疗的最佳剂量。4.2复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型免疫调节及肿瘤能量代谢的影响使用C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,将荷瘤小鼠随机分为最佳剂量复方苦参注射液组（2ml/kg,4ml/kg）及生理盐水组以腹腔注射方式干预荷瘤小鼠7天,观察比较瘤体大小,绘制瘤体生长曲线;通过免疫细胞亚群测定检测小鼠肿瘤及脾脏免疫细胞分型表达;通过高压液相和质谱联用的方法进行肿瘤组织代谢产物检测。以进一步验证探索复方苦参注射液体内作用机制;小鼠肿瘤组织石蜡切片的制作及Cleave Casepase3 IHC染色用以检测肿瘤组织凋亡情况。以进一步验证探索复方苦参注射液体内作用机制。研究结果:1.通过细胞活力鉴定的方法学摸索,CCK8及Prestoblue均具有良好的敏感性,但复方苦参注射液颜色对Prestoblue读数的影响程度更小。因此选择prestoblue法及细胞计数法重复验证CKI在淋巴瘤细胞增殖中发挥的作用。Prestoblue法结果显示复方苦参注射液对5种淋巴瘤细胞均显示出生长抑制作用。其中T细胞淋巴瘤细胞系Hut-78、EL4、Loucy、Jurkat要显着强于B细胞淋巴瘤细胞Raji,在人源T细胞淋巴瘤细胞系中,复方苦参注射液对Hut-78（人源皮肤T细胞淋巴瘤细胞）抑制效果最强,Loucy（人源T淋巴细胞白血病细胞株）的抑制效果次之,均呈现显着的剂量及时间依赖性。细胞计数法结果与Prestoblue检测结果趋势一致,也进一步验证Prestoblue细胞增殖-活力检测方法检测结果的真实性及准确性。细胞周期检测结果显示CKI处理后Hut-78、Loucy细胞的细胞周期G0-G1,S,G2/M期并未见明显的周期停滞作用。但是subG 1期的比例呈明显剂量依赖性增加,提示细胞凋亡在CKI的作用机制中或许扮演着重要作用。细胞凋亡检测结果显示CKI可以诱导Hut-78、Loucy细胞的凋亡,凋亡相关内切酶casepase3、casepase7蛋白表达的Western Blot检测也进一步证实了这一点。不同的是,CKI在48h更多的引起Hut-78细胞的早期凋亡,其凋亡率增高明显;但在Loucy细胞中,晚期凋亡和坏死细胞比率更多,这说明CKI诱导Loucy细胞死亡的方式或机制与Hut-78可能纯在差异。2.通过分析反向蛋白阵列术（RPPA）结果发现CKI的潜在作用通路可以聚焦在 PI3K/Akt/mTOR、NF-KB、MEK/ERK 等通路,其中 PI3K/Akt/mTOR 通路的多数蛋白表达调节符合CKI调节分子机制的构想。Western Blot验证结果证实CKI可通过下调Hut-78细胞中PI3K/Akt/mTOR通路蛋白表达,进一步调控其下游AMPK/TSC1/mTor/S6通路,从而影响细胞增殖或诱导凋亡。这种现象在Loucy细胞中同样可见。可见,调控PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/TSC1/mTor/S6通路也许是CKI作用T细胞淋巴瘤的主要分子机制。3.高压液相和质谱联用的方法检测提示CKI具有潜在调控谷氨酸及乳酸代谢的作用。CKI可以通过直接减少谷氨酸或乳酸代谢的途径抑制糖解途径酵,减少肿瘤能量代谢。Western Blot蛋白表达验证结果证实CKI具有潜在下调GLS1、LDHA蛋白表达的作用,从而干预肿瘤能量代谢途径,减少肿瘤能量供应。4.通过对C57BL/6J小鼠构建EL4淋巴瘤动物模型,我们发现CKI、MTX干预相比生理盐水组可显着提高生存率,延长生存期,相较于化疗药物MTX,CKI表现出非劣势的作用。比较两个实验的小鼠瘤体生长曲线,发现CKI干预后瘤组织的瘤体积增长速度呈降低趋势,与生存期研究结果相一致,相较于化疗药物MTX,CKI依然表现出非劣势的肿瘤抑制作用。免疫细胞亚群结果提示CKI可以选择性上调T细胞亚群（CD3+）,而其中发挥作用的主要免疫细胞群体可能是上调辅助T细胞（CD3+CD4+）、调节性T细胞（CD4+FoxP3）,或下调Th17细胞（CD3+CD4+IL17）比例达成的。这一发现提示CKI的抗肿瘤作用可能与免疫调控有关。通过对肿瘤组织代谢产物的高压液相和质谱联用的方法发现CKI在谷氨酸途径代谢中,可以显着降低谷氨酰胺、谷氨酸及乳酸含量。这与Hut-78及Loucy的实验结果相一致,也进一步提示CKI可以通过抑制谷氨酸及糖酵解途径影响肿瘤能量代谢,降低肿瘤供能,从而发挥抑制肿瘤生长的作用。小鼠肿瘤组织石蜡切片的制作及Cleave Casepase3 IHC染色的结果显示CKI的抑瘤作用可能是通过诱导细胞凋亡产生的,这也进一步印证了体外实验的结论。研究结论:1.复方苦参注射液对淋巴瘤细胞均显示出生长抑制作用。其中对T细胞淋巴瘤要显着强于B细胞淋巴瘤。其发挥细胞增殖抑制的作用可能是通过诱导细胞凋亡完成;2.调控PI3K/Akt/mTOR通路及AMPK/TSC1/mTor/S6通路也许是CKI作用T细胞淋巴瘤的主要分子机制;3.CKI具有降低谷氨酸及乳酸代谢的作用,从而抑制糖解酵途径,减少肿瘤能量代谢,这一点在体内外实验中均得到了验证;4.CKI干预EL4淋巴瘤动物模型可以提高生存率,延长生存期,降低肿瘤生长速度,相较于化疗药物MTX,CKI表现出非劣势的作用;5.CKI发挥肿瘤免疫调节的机制可能是下调Th17（CD3+CD4+IL17）/Treg（CD4+FoxP3）比例,提示CKI的抗肿瘤作用可能是通过抑制肿瘤相关性炎症发挥的。
庞晨[10]（2020）在《铁皮石斛对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用和对自噬相关因子、肿瘤相关因子表达影响的研究》文中认为目的:通过裸鼠体内移植瘤实验研究,初步探讨鲜铁皮石斛对人肺腺癌细胞移植瘤的抑制作用及其机制。方法:1、培养实验所需细胞并通过HE染色和免疫组织化学染色对其种属和来源进行相关的鉴定。2、建立A549肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型并进行实验研究:将裸鼠随机分为6组,包括空白对照组、阴性对照组（模型组）、阳性对照组（环磷酰胺组,CTX）、铁皮石斛低浓度组、铁皮石斛中浓度组、铁皮石斛高浓度组。裸鼠空白对照组和阴性对照组生理盐水灌胃（每天30m L/kg）、环磷酰胺组腹腔注射给药（每隔一天给药,0.025 g/kg）,低浓度铁皮石斛、中浓度铁皮石斛、高浓度铁皮石斛每天分别以6.25g/kg、12.5g/kg、25 g/kg灌胃给药,在给药期间,每隔一天测量一次瘤体积。停药次日,处死裸鼠,剥离瘤体称重测量后待用。3、HE染色法观察各组移植瘤组织的病理形态学变化;免疫组织化学法观察铁皮石斛对裸鼠移植瘤瘤组织中自噬相关因子Beclin1以及增值指数Ki67的蛋白表达的影响。4、RT-PCR技术检测铁皮石斛对裸鼠移植瘤组织中的抑癌基因p53、p16以及EGFR基因表达的影响。结果:1、鉴定实验表明目标细胞为人的肺腺癌细胞株且成功建立A549肺腺癌细胞裸鼠移植瘤模型。2、与阴性对照组（模型组）相比,阳性对照组以及铁皮石斛低、中、高浓度组药物均可减缓裸鼠移植瘤生长,缩小肿瘤体积,且差异有统计学意义（P<0.05）;环磷酰胺组和低中高3个浓度剂量的抑瘤率分别达到62%、51%、52%、56%,并呈剂量依赖关系。3、免疫组化结果显示:同阴性对照组相比,中浓度铁皮石斛组、高浓度铁皮石斛组、阳性对照组的Beclin1阳性表达率逐渐升高;高浓度铁皮石斛组、阳性对照组的Ki67阳性率逐渐降低。4、RT-PCR结果显示:与阴性对照组相比,中浓度和高浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的EGFR m R N A水平均显示下调且高浓度铁皮石斛给药组差异性有统计学意义（P<0.05）;各浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的p53和p16 m RNA水平均显示上调;其中与阴性对照组相比,中浓度和高浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的p 1 6 m R N A差异性有统计学意义（P<0.0 5）;各浓度铁皮石斛给药组裸鼠移植瘤组织中的p53 m RNA差异性均有统计学意义（P<0.0 5）。结论:铁皮石斛具有抑制肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤组织生长的作用,其作用机制可能与上调自噬相关因子B e c l i n 1和抑癌基因p 1 6和p 5 3的表达、下调E G F R的表达相关;可能通过启动细胞自噬从而诱导细胞凋亡。
二、BRM释介素体外抑瘤作用与诱导癌细胞凋亡（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、BRM释介素体外抑瘤作用与诱导癌细胞凋亡（论文提纲范文）
（1）基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 肺癌微环境中外泌体的生物学功能及其临床应用 |
| 1 研究背景 |
| 2 外泌体的形成和特征 |
| 3 外泌体的释放 |
| 4 肺癌微环境中外泌体的功能 |
| 5 外泌体在化疗耐药与靶向治疗耐药中的作用 |
| 6 外泌体在临床诊断和治疗中的应用 |
| 7 肿瘤微环境中外泌体可以作为肺癌的预测指标 |
| 8 讨论 |
| 参考文献 |
| 附表1 外泌体肺癌微环境不同细胞之间的调控 |
| 附表2 外泌体在治疗、诊断与预后中的相关研究 |
| 综述二 中医药调控肿瘤微环境防治肺癌研究进展 |
| 1 肿瘤免疫微环境 |
| 2 中医药对肿瘤相关巨噬细胞极化与功能的调控 |
| 3 中医药对髓源性抑制细胞的调节 |
| 4 中医药对T、B淋巴细胞、NK细胞及免疫靶点的调控 |
| 5 中医药对调节性T细胞的调控 |
| 6 中医药重塑上皮间质转化 |
| 7 中医药对血管生成的作用 |
| 8 中医药对肿瘤相关成纤维细胞的调控 |
| 9 中医药对肿瘤相关树突状细胞的作用 |
| 10 中医药对肿瘤微环境炎症因子的调控 |
| 11 中医药对微环境中外泌体及非编码RNA表达的作用 |
| 12 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 双参颗粒抑制荷Lewis肺癌小鼠移植瘤的药效学实验 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 双参颗粒对荷Lewis肺癌小鼠肿瘤相关巨噬细胞表型的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 双参颗粒干预荷M1型巨噬细胞与Lewis肺癌细胞混合移植瘤小鼠模型的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 双参颗粒对小鼠TAM细胞功能因子、记忆T细胞、Treg细胞的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验五 MIF基因过表达与MIF基因干扰稳定转染Lewis细胞株的构建 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验六 双参颗粒含药血清对MIF~(+/+)Lewis及shMIF-Lewis细胞中MIF蛋白表达的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验七 双参颗粒含药血清对Lewis来源外泌体及外泌体中MicroRNA-34a的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验八 双参颗粒含药血清干预MIF~(+/+)Lewis细胞来源外泌体对巨噬细胞表型及KLF4的影响 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附件 |
（2）毛兰素及其转铁蛋白脂质体抗肝癌活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词索引表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 毛兰素研究概况 |
| 1.1.1 毛兰素来源 |
| 1.1.2 毛兰素药理活性 |
| 1.1.2.1 毛兰素与炎症 |
| 1.1.2.2 毛兰素与银屑病 |
| 1.1.2.3 毛兰素与糖尿病 |
| 1.1.2.4 毛兰素抗肿瘤活性 |
| 1.2 肝癌的研究现状 |
| 1.3 抗肿瘤作用机制 |
| 1.3.1 细胞周期 |
| 1.3.2 细胞凋亡 |
| 1.3.3 免疫治疗与肿瘤 |
| 1.4 药物传递系统与抗肿瘤 |
| 1.4.1 聚合物胶束 |
| 1.4.2 纳米粒 |
| 1.4.3 脂质体 |
| 1.5 本课题研究的目的,意义和内容 |
| 1.5.1 本课题的研究意义 |
| 1.5.2 本课题的研究内容 |
| 第二章 毛兰素抗肝癌活性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器与材料 |
| 2.2.1 主要仪器与设备 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 溶液配制 |
| 2.2.4 试剂盒 |
| 2.2.5 抗体 |
| 2.2.6 细胞株 |
| 2.2.7 实验动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 毛兰素抗肝癌活性体外评价 |
| 2.3.3 毛兰素抗肝癌活性体内评价—裸鼠异位瘤模型 |
| 2.3.4 毛兰素抗肝癌活性体内评价—BALB/c小鼠异位瘤模型 |
| 2.3.5 统计方法学 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 毛兰素抗肝癌活性体外评价结果 |
| 2.4.2 毛兰素抗肝癌活性体内评价结果—裸鼠异位瘤模型 |
| 2.4.3 毛兰素抗肝癌活性体内评价结果—BALB/c小鼠异位瘤模型 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 毛兰素转铁蛋白脂质体制备表征及其体外抗肿瘤活性评价 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验仪器与试剂 |
| 3.2.1 实验仪器 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 毛兰素含量测定方法的建立 |
| 3.3.2 脂质体制备 |
| 3.3.3 脂质体理化性质的表征 |
| 3.3.4 粒径稳定性考察 |
| 3.3.5 毛兰素转铁蛋白脂质体体外抗肿瘤活性评价 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 毛兰素含量测定方法的建立 |
| 3.4.2 脂质体理化性质表征 |
| 3.4.3 稳定性实验结果 |
| 3.4.4 毛兰素转铁蛋白脂质体体外抗肿瘤活性评价 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 毛兰素转铁蛋白脂质体体内抗肝癌活性评价 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验仪器与材料 |
| 4.2.1 主要仪器与设备 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 试剂盒 |
| 4.2.4 抗体 |
| 4.2.5 溶液配制 |
| 4.2.6 细胞株 |
| 4.2.7 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 Tf-LP-Erianin与 LP-Erianin制备 |
| 4.3.3 裸鼠异位瘤模型建立及治疗方案 |
| 4.3.4 组织分布 |
| 4.3.5 凋亡相关蛋白检测 |
| 4.3.6 BALB/c小鼠异位瘤模型的建立 |
| 4.3.7 免疫相关因子的检测 |
| 4.3.8 氧化应激相关蛋白检测 |
| 4.3.9 组织病理学分析 |
| 4.3.10 统计方法学 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 裸鼠异位瘤模型中Tf-LP-Erianin的抗肝癌活性评价 |
| 4.4.2 BALB/c小鼠异位瘤模型中Tf-LP-Erianin的抗肝癌活性评价 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文名称缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察 |
| 1 一般资料 |
| 2 研究方法 |
| 2.1 纳入标准 |
| 2.2 排除标准 |
| 2.3 剔除标准 |
| 2.4 退出标准 |
| 2.5 中止标准 |
| 2.6 观察指标:包括安全性观察指标和疗效性观察指标 |
| 2.7 疗效判断 |
| 3 治疗方法 |
| 4 统计学分析 |
| 5 结果 |
| 5.1 三组患者基线资料比较 |
| 5.2 三组患者治疗前后生存率及生存期比较 |
| 5.3 三组患者治疗前后肿瘤大小比较 |
| 5.4 三组患者治疗前后生化指标水平比较 |
| 5.5 三组患者中医证候评分比较 |
| 5.6 三组患者生存质量评分比较 |
| 5.7 观察指标对患者疗效及预后的影响 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”对晚期肝癌患者生存率及生存期的影响 |
| 2 肝癌肝再生微环境及“补肾生髓成肝”的改善作用 |
| 3 “补肾生髓成肝”对患者中医证候评分及生存质量的影响 |
| 4 “补肾生髓成肝”对患者并发症及预后的影响 |
| 参考文献 |
| 第二部分 “补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的疗效机制研究 |
| 1 研究样本及方法 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验操作流程 |
| 2 统计学处理方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 肝再生相关细胞因子正态性检验结果 |
| 3.2 肝再生相关细胞因子在各组人群中表达的差异性 |
| 3.3 肝再生相关细胞因子表达水平之间的相关性分析 |
| 讨论 |
| 1 “补肾生髓成肝”疗法相关研究进展 |
| 2 “补肾生髓成肝”改善肝再生微环境防治肝癌的疗效机制 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 文献综述一 肝癌微环境的研究现状 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 中医药影响肝癌微环境的研究进展 |
| 参考文献 |
| 中医证候评分量表 |
| SF-36 |
| 在校期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（4）钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一章 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白体外抑瘤作用的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器设备 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 细胞株 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 藻蓝蛋白样品的预处理 |
| 2.2 细胞复苏 |
| 2.3 细胞传代 |
| 2.4 细胞冻存 |
| 2.5 藻蓝蛋白抗肿瘤活性的初筛 |
| 2.6 MTT法检测藻蓝蛋白对人肝癌MHCC97-H细胞、人胰腺癌SW1990和人正常肝细胞L-O2增殖的量效与时效关系 |
| 2.7 倒置显微镜下观察藻蓝蛋白对人肝癌MHCC97-H细胞和人胰腺癌SW1990细胞形态的影响 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 藻蓝蛋白抗肿瘤活性的初筛实验结果 |
| 3.2 藻蓝蛋白对人肝癌MHCC97-H细胞和人胰腺癌SW1990细胞增殖的量效与时效关系 |
| 3.2.1 藻蓝蛋白对人肝癌MHCC-97H细胞生长的影响 |
| 3.2.2 藻蓝蛋白对人胰癌SW1990细胞生长的影响 |
| 3.3 藻蓝蛋白对人肝癌MHCC97-H细胞和人胰腺癌 SW1990细胞形态的影响 |
| 3.3.1 藻蓝蛋白对人肝癌MHCC97-H细胞的形态影响 |
| 3.3.2 藻蓝蛋白对人胰腺癌SW1990细胞的形态影响 |
| 4 讨论 |
| 第二章 藻蓝蛋白介导光动力疗法治疗小鼠SW1990细胞瘤的抗肿瘤作用研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 药物 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验器材 |
| 1.5 试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 动物模型的建立 |
| 2.2 分组与给药 |
| 2.2.1 分组 |
| 2.2.2 给药 |
| 2.3 指标测定 |
| 2.4 细胞因子的测定 |
| 2.4.1 小鼠脾细胞培养液和血清中TNF-α水平的测定 |
| 2.4.2 小鼠血清中IL-6 水平的测定 |
| 2.5 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 实验小鼠一般情况观察 |
| 3.2 小鼠瘤重、瘤体积及抑瘤率的测定 |
| 3.3 藻蓝蛋白和激光对小鼠免疫器官的影响 |
| 3.4 评价藻蓝蛋白对小鼠免疫系统功能的影响 |
| 3.4.1 ELISA法检测小鼠肿瘤坏死因子TNF-α的表达水平 |
| 3.4.2 检测小鼠血清中IL-6 水平的表达 |
| 4 讨论 |
| 第三章 钝顶螺旋藻藻蓝蛋白抗肿瘤作用机制的研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验仪器设备 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 细胞株 |
| 1.4 相关试剂的配制 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 划痕修复实验检测人肝癌MHCC97-H细胞和人胰腺癌SW1990细胞的体外迁移能力 |
| 2.2 检测人肝癌MHCC97-H细胞和人胰腺癌SW1990细胞的凋亡情况 |
| 2.3 WesternBlot检测凋亡和迁移相关蛋白的表达水平 |
| 2.3.1 提取细胞总蛋白 |
| 2.3.2 BCA法测定细胞蛋白浓度 |
| 2.3.3 蛋白变性 |
| 2.3.4 SDS-PAGE |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 藻蓝蛋白对人肝癌MHCC97-H细胞和人胰腺癌SW1990细胞体外迁移能力的影响 |
| 3.1.1 藻蓝蛋白对人肝癌MHCC97-H细胞体外迁移能力的影响 |
| 3.1.2 藻蓝蛋白对人胰腺癌SW1990细胞体外迁移能力的影响 |
| 3.2 流式细胞术检测细胞凋亡的情况 |
| 3.2.1 检测人肝癌MHCC97-H细胞的凋亡情况 |
| 3.2.2 检测人胰腺癌SW1990细胞的凋亡情况 |
| 3.3 Western blot检测相关蛋白的表达 |
| 3.3.1 藻蓝蛋白影响凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.3.2 藻蓝蛋白影响迁移相关蛋白的表达 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 藻蓝蛋白抗肿瘤活性及其作用机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（5）刺激响应聚氨基酸水凝胶的制备及其抗肿瘤应用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 水凝胶 |
| 1.1.1 温度敏感性水凝胶 |
| 1.1.2 pH敏感性水凝胶 |
| 1.1.3 生物大分子敏感性水凝胶 |
| 1.1.4 外界因素 |
| 1.2 癌症治疗 |
| 1.2.1 传统治疗 |
| 1.2.2 免疫相关疗法 |
| 1.2.3 联合疗法 |
| 1.3 抗肿瘤药物载体 |
| 1.3.1 纳米抗肿瘤药物载体 |
| 1.3.2 水凝胶抗肿瘤药物载体 |
| 1.4 本论文的选题依据和主要研究内容 |
| 第2章 温敏聚氨基酸水凝胶递送Dox和aPD-L1用于黑色素瘤联合治疗 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料及测试方法 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 测试仪器及方法 |
| 2.2.3 实验细胞和动物 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 mPEG-NH_2合成 |
| 2.3.2 γ-乙基-L-谷氨酸酯(ELG)及γ-乙基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐(ELG NCA)合成 |
| 2.3.3 聚乙二醇-b-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯)(mPEG-b-PELG)合成 |
| 2.3.4 mPEG-b-PELG自组装 |
| 2.3.5 二级结构 |
| 2.3.6 凝胶相图 |
| 2.3.7 水凝胶微观形貌 |
| 2.3.8 流变测试 |
| 2.3.9 水凝胶体外降解实验 |
| 2.3.10 药物体外释放实验 |
| 2.3.11 细胞培养 |
| 2.3.12 细胞毒性实验 |
| 2.3.13 体内原位成胶实验 |
| 2.3.14 CRT检测 |
| 2.3.15 抗肿瘤实验 |
| 2.3.16 免疫细胞因子分析 |
| 2.3.17 免疫细胞分析 |
| 2.3.18 组织病理学分析 |
| 2.3.19 统计分析 |
| 2.4 结果与讨论 |
| 2.4.1 mPEG-b-PELG的合成与表征 |
| 2.4.2 mPEG-b-PELG的自组装 |
| 2.4.3 mPEG-b-PELG的溶胶-凝胶相转变 |
| 2.4.4 水凝胶的体外降解和药物释放 |
| 2.4.5 水凝胶的细胞相容性和体内成胶 |
| 2.4.6 CRT检测 |
| 2.4.7 水凝胶载带aPD-L1和Dox联合抑瘤实验 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 生理相关pH和温度双响应聚氨基酸粘附性水凝胶的制备 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料及测试 |
| 3.2.1 试剂 |
| 3.2.2 测试仪器及方法 |
| 3.2.3 实验细胞和动物 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 γ-丙炔基-L-谷氨酸酯(PLG)及γ-丙炔基-L-谷氨酸酯-N-羧酸酐(PLGNCA)合成 |
| 3.3.2 1-叠氮乙基-4-甲基哌嗪(AMP)的合成 |
| 3.3.3 单甲醚聚乙二醇-b-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯-co-γ-丙炔基-L-谷氨酸酯)(mPEG-b-P(ELG-co-PLG)和聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯-co-γ-丙炔基-L-谷氨酸酯)-b-聚乙二醇-b-聚(γ-乙基-L-谷氨酸酯-co-γ-丙炔基-L-谷氨酸酯)(P(ELG-co-PLG)-b-PEG-b-P(ELG-co-PLG)的合成 |
| 3.3.4 AMP修饰mPEG-b-P(ELG-co-PLG)和P(ELG-co-PLG)-b-PEG-b-P(ELG-co-PLG) |
| 3.3.5 材料质子化能力验证 |
| 3.3.6 材料的二级结构 |
| 3.3.7 材料的临界胶束浓度 |
| 3.3.8 胶束的粒径和电位 |
| 3.3.9 胶束的微观图像 |
| 3.3.10 溶胶-凝胶相图 |
| 3.3.11 水凝胶的pH可逆转变 |
| 3.3.12 水凝胶的变温核磁 |
| 3.3.13 水凝胶的微观结构 |
| 3.3.14 水凝胶的力学强度 |
| 3.3.15 细胞毒性 |
| 3.3.16 水凝胶的生物降解性和生物相容性 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 PLG及PLGNCA的合成 |
| 3.4.2 AMP的合成 |
| 3.4.3 mPEG-b-P(ELG-co-PLG)和P(ELG-co-PLG)-b-PEG-b-P(ELG-co-PLG)的合成 |
| 3.4.4 EG_(45)(E_xPA_y)_m和(E_xPA_y)_mEG_(45)(E_xPA_y)_m的合成 |
| 3.4.5 材料质子化能力验证 |
| 3.4.6 温度和pH响应成胶 |
| 3.4.7 溶胶-凝胶相图 |
| 3.4.8 水凝胶的流变学测试 |
| 3.4.9 水凝胶的黏附性 |
| 3.4.10 水凝胶的成胶机制 |
| 3.4.11 生物降解性和生物相容性 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 可质子化双响应聚氨基酸水凝胶递送Dox和ISMN用于黑色素瘤治疗 |
| 4.1 引言 |
| 4.2. 实验材料及测试方法 |
| 4.2.1 试剂 |
| 4.2.2 测试仪器及方法 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 mPEG-b-P(ELG-co-PLG/AMP)合成 |
| 4.3.2 水凝胶的温度刺激响应性 |
| 4.3.3 水凝胶及载药水凝胶的力学强度 |
| 4.3.4 载药水凝胶的微观结构 |
| 4.3.5 水凝胶的体外降解和药物释放 |
| 4.3.6 水凝胶的生物降解性和生物相容性 |
| 4.3.7 水凝胶的缓冲作用 |
| 4.3.8 M1和M2极化 |
| 4.3.9 ISMN的细胞毒性 |
| 4.3.10 划痕实验 |
| 4.3.11 CRT检测 |
| 4.3.12 载带ISMN可质子化水凝胶对肿瘤内血管和乏氧的影响 |
| 4.3.13 载药可质子化水凝胶的抑瘤效果 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 水凝胶和载药水凝胶的温度刺激响应性 |
| 4.4.2 水凝胶的体外降解和药物释放 |
| 4.4.3 水凝胶的体内降解和生物相容性 |
| 4.4.4 水凝胶的缓冲能力 |
| 4.4.5 ISMN对细胞的影响 |
| 4.4.6 CRT表达 |
| 4.4.7 载ISMN可质子化双响应水凝胶对肿瘤乏氧情况的影响 |
| 4.4.8 载Dox和ISMN可质子化双响应水凝胶的抑瘤效果 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（7）旋毛虫对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 寄生虫对肿瘤发生与发展的影响 |
| 1.1 寄生虫对癌症发生的正向调控 |
| 1.2 寄生虫对肿瘤发生发展的负向调控 |
| 1.3 小结 |
| 第二章 旋毛虫抗肿瘤研究进展 |
| 2.1 旋毛虫抗肿瘤作用研究进展 |
| 2.2 旋毛虫相关抗原的抗肿瘤作用研究进展 |
| 2.3 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 旋毛虫感染对H22荷瘤小鼠实体瘤抑制作用研究 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 旋毛虫感染对H22荷瘤小鼠体内细胞因子的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 旋毛虫对H22肝癌细胞的体内外凋亡作用研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介及在学期间成果 |
| 致谢 |
（8）龙贝逍遥散调控miR-145/c-Myc/TP53信号通路抗乳腺癌机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 乳腺癌相关miRNA研究进展及miR-145临床病理的荟萃分析 |
| 1 miRNA概述 |
| 2 miRNA在乳腺癌发生发展中作用研究 |
| 3 miRNA在乳腺癌诊断治疗中作用研究 |
| 4 miR-145与乳腺癌临床病理意义的荟萃评价 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 综述二 中药单药及复方抗乳腺癌基础研究进展 |
| 1 单味中药抗乳腺癌基础研究 |
| 2 中药复方抗乳腺癌基础研究 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 实验一 龙贝逍遥散冻干粉对乳腺癌细胞增殖与迁移的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二 龙贝逍遥散冻干粉对乳腺癌细胞作用机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三 龙贝逍遥散对乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用与机制研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（9）复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 文献综述 |
| 文献综述一: T细胞淋巴瘤的治疗现状及进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二: 复方苦参注射液抗肿瘤作用及其机制实验研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 第二部分 复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究 |
| 实验一 复方苦参注射液对不同淋巴瘤细胞系增殖的影响及筛选 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞周期的调节作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验三 复方苦参注射液对T细胞淋巴瘤Hut78、Loucy细胞凋亡的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第三部分 复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞信号调控通路蛋白表达的影响 |
| 方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第四部分 复方苦参注射液对Hut78、Loucy细胞能量代谢的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 第五部分 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤动物模型体内实验研究 |
| 实验一 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型生存期的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 实验二 复方苦参注射液对EL4淋巴瘤模型免疫调节及肿瘤能量代谢的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 结论 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简历 |
| 中医药科技查新报告书 |
（10）铁皮石斛对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用和对自噬相关因子、肿瘤相关因子表达影响的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 :肺腺癌细胞株在种植裸鼠移植瘤前的鉴定 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 :铁皮石斛对肺腺癌裸鼠移植瘤大小及对自噬相关基因、抑癌基因表达影响的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表或索引 |
| 综述 铁皮石斛抑制上皮源性恶性肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介及攻读学位期间获得的科研成果 |
四、BRM释介素体外抑瘤作用与诱导癌细胞凋亡（论文参考文献）
- [1]基于肿瘤细胞外泌体调控TAM细胞极化探讨双参颗粒抑制肺癌的作用机制[D]. 亓润智. 中国中医科学院, 2021(02)
- [2]毛兰素及其转铁蛋白脂质体抗肝癌活性研究[D]. 张欣蕊. 吉林大学, 2021(01)
- [3]“补肾生髓成肝”改善肝癌肝再生微环境治疗晚期肝癌的临床疗效观察及机制研究[D]. 刘皎皎. 湖北中医药大学, 2021
- [4]钝顶螺旋藻藻蓝蛋白的抗肿瘤作用及其机制的研究[D]. 韩敏敏. 广西中医药大学, 2021(02)
- [5]刺激响应聚氨基酸水凝胶的制备及其抗肿瘤应用研究[D]. 时莹歌. 中国科学技术大学, 2021(09)
- [6]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [7]旋毛虫对小鼠H22肝癌细胞生长的抑制作用及其机制研究[D]. 李仕存. 吉林大学, 2020(01)
- [8]龙贝逍遥散调控miR-145/c-Myc/TP53信号通路抗乳腺癌机制研究[D]. 吕鹏. 北京中医药大学, 2020(04)
- [9]复方苦参注射液对恶性T细胞淋巴瘤作用机制研究[D]. 郑佳彬. 中国中医科学院, 2020(01)
- [10]铁皮石斛对肺腺癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用和对自噬相关因子、肿瘤相关因子表达影响的研究[D]. 庞晨. 广西中医药大学, 2020(02)