一、重组可溶性PD-1免疫抑制性受体增强抗小鼠H22肝癌的免疫效应（论文文献综述）
李志[1]（2021）在《IL-28B通过下调调节性T细胞抗肝癌的机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景与目的2020年世界卫生组织公布的癌症数据显示,肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）发病率在世界癌症中占第6位,死亡率占第3位。肝癌的治疗目前仍是全球医疗的一大挑战,迫切需要新的治疗方法。调节性T细胞（regulatory T cells,Treg cells）具有抑制抗肿瘤免疫的作用,因此抑制Treg成为HCC免疫治疗的潜在策略。IL-28B是IFN-λ成员之一,已报道IL-28B具有抗肿瘤作用且下调Treg,但目前仍不清楚其抗肿瘤的免疫机制。因此本文评价IL-28B下调Treg对小鼠肝癌的治疗效应,阐明其对免疫微环境中T细胞亚群和细胞因子的影响,并研究IL-28B在体外对Treg生成的影响。研究方法（1）利用HEK 293细胞扩增腺病毒载体rAd-mIL-28B,PCR鉴定目的基因,TCID50法测定病毒滴度。（2）MTT法检测IL-28B体外对宫颈癌TC-1细胞增殖的抑制效应。（3）第0天BALB/c雌性小鼠皮下注射1 × 106个小鼠肝癌H22细胞,分别于第4、7和10天瘤内注瘤组织、脾脏、肺脏、肝脏和胸腺湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第1 1天处死小鼠,称量肿分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,流式细胞术（flow cytometer,FCM）检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清及制备肿瘤组织匀浆,蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。（4）分离BALB/c小鼠脾细胞,利用CD3单抗/CD28单抗、IL-2、TGF-β诱导生成iTreg细胞,在此诱导条件下加入IL-28B培养3天后,FCM检测CD4、CD25 和 Foxp3 分子,RT-PCR 检测 Foxp3 和 PD-1 mRNA 水平,ELISA 检测细胞培养上清IL-10水平。（5）构建H22荷瘤小鼠,每天给予E2-a灌胃治疗,剂量为100 mg/kg/day并于第4、7和10天瘤内注射1 × 108 PFUs rAd-mIL-28B,测量肿瘤直径。第11天处死小鼠,称量肿瘤组织湿重;取肿瘤组织HE染色后观察细胞形态;分离脾脏和肿瘤组织的淋巴细胞,FCM检测T细胞CD4、CD8、Foxp3和PD-1分子的表达;分离血清蛋白芯片技术检测Th1、Th2、Th17、IL-10和单核细胞相关细胞因子水平。研究结果（1）PCR法鉴定扩增的腺病毒载体rAd-mIL-28B含有IL-28B基因,TCID50法检测 rAd-mIL-28B 滴度为 1 × 1010.6 PFU/ml,rAd-EGFP 滴度为 1 X 109.55 PFU/ml。（2）MTT试验证明50 μg/ml IL-28B和100 μg/ml IL-28B作用宫颈癌TC-1细胞72h后,OD值分别为0.80±0.09和0.85±0.08,低于阴性对照组（0.92±0.06）（p<0.05）。（3）在肝癌皮下移植瘤小鼠模型中,rAd-mIL-28B组肿瘤体积为796.74 ±447.58 mm3,低于 rAd-EGFP 组（1415.27±513.37 mm3）（p<0.05）;rAd-mIL-28B组平均肿瘤重量为 0.63±0.30 g,低于 rAd-EGFP 组（1.16±0.34 g）（p<0.05）,抑瘤率为 45.69%;肿瘤组织HE染色后,rAd-mIL-28B组可见肿瘤细胞坏死;rAd-mIL-28B 组的肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）中 CD8+T 细胞占淋巴细胞的比例（8.65±5.49%）高于未治疗组（3.21±1.45%）（p<0.05）;与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组 TME 中 Foxp3+T 和 CD4+Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例无统计学差异（p>0.05）;rAd-mIL-28B组脾脏CD4+Foxp3+占CD4+T 细胞的比例为 16.78±2.93%,低于 rAd-EGFP 组（21.47±4.17%）（p<0.05）;rAd-mIL-28B组脾脏中CD4+PD-1+T细胞占淋巴细胞比例为1.46±0.08%,明显低于 rAd-EGFP 组（2.40±0.31%）（p<0.05）;与 rAd-EGFP 组相比,rAd-mIL-28B 组血清 CXCL13,ICAM-1,MCP-5 和 IL-7 水平降低（p<0.05）,rAd-mIL-28B肿瘤组织内IL-15和sFasL的表达降低（p<0.05）。（4）与未刺激的脾细胞相比,脾细胞刺激组（500 ng/ml CD3单抗/CD28单抗、5 ng/ml IL-2和1.25 ng/ml TGF-β）培养三天后,Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例增加（p<0.05）。与脾细胞刺激组相比,加入50 ng/ml IL-28B后,Foxp3+细胞占淋巴细胞的比例下降,Foxp3 mRNA的水平显着降低（p<0.05）,PD-1 mRNA的水平无明显差异（p>0.05）,细胞培养上清IL-10的水平显着降低（p<0.05）。（5）E2-a联合rAd-mIL-28B作用于H22荷瘤小鼠后抑制了肿瘤体积（p<0.05）;与未治疗组相比,E2-a 联合 rAd-mIL-28B 组 TME 中 Foxp3+、CD4+Foxp3+、CD8+Foxp3+和PD-1+Foxp3+细胞比例明显增加（p<0.05）;血清细胞因子IL-1α、IL-12p40、TNFRI 明显降低,而 MIP-1γ 明显升高（p<0.05）。研究结论（1）rAd-mIL-28B可通过下调H22荷瘤小鼠Treg抑制肿瘤生长。（2）rAd-mIL-28B可影响H22荷瘤小鼠肿瘤免疫微环境。（3）IL-28B具有体外直接抑制Treg细胞生成的作用。（4）rAd-mIL-28B联合E2-a未增强E2-a的抗肿瘤作用。
鲍欣[2]（2021）在《CA4纳米粒子联合DC101协同抗PD-1抗体增强肝癌治疗疗效及机制研究》文中研究说明研究背景:在全世界范围内,肝细胞癌（简称肝癌）位居癌症相关致死原因的第四位。临床上,晚期肝癌的治疗方法相当有限。近期,免疫检查点抑制剂抗PD-1抗体在肝癌的治疗中显现出一定疗效。但抗PD-1抗体的疗效在临床上仅限于少部分肝癌患者,其客观缓解率为20%或更低。考虑到抗PD-1抗体一旦发挥作用其抗肿瘤效率将达到空前水平,因此如何提高抗PD-1抗体治疗肝癌的疗效是目前迫切需解决的问题。免疫检查点分子PD-1与它的配体PD-L1相结合致使T细胞耗竭。抗PD-1抗体具有阻止PD-1与PD-L1相结合的作用,释放对包括CD8+T细胞在内的T细胞的抑制效应。预先存在的CD8+T细胞数被用来预测抗PD-1抗体治疗的反应性,但在临床上仍不理想。新证据表明,抗PD-1抗体在癌症治疗中失败的一个主要原因是CD8+T细胞与肿瘤负荷之间的不平衡,且抗PD-1抗体的疗效与该比例呈正相关。当较大肿瘤和较小肿瘤内CD8+T细胞数量相等时,较大肿瘤中CD8+T细胞可能不足以有效的抑制肿瘤生长。因此,可以从减小肿瘤负荷和增加CD8+T细胞数量来提高抗PD-1抗体在HCC治疗中的疗效。肿瘤由血管供给氧气和营养。阻断肿瘤的血管会引起肿瘤的减小,降低肿瘤负荷。有研究表明,抗血管药物联合PD-1免疫检查点抑制剂成功地用于不可手术切除的肝癌患者。因此,对于肝癌这种富血管肿瘤,抗血管药物治疗可以有效减小荷肝癌小鼠的肿瘤负荷。抗血管药物中的血管阻断剂可以选择性地破坏肿瘤内已经建立的血管。CA4是血管阻断剂代表药,其磷酸前药CA4P已进入III期临床试验。我们课题组合成的CA4纳米粒子（CA4-NPs）与CA4P相比具有更强的肿瘤血管被动靶向作用,纳米粒子在肿瘤血管的低渗透性使其具有更强的肿瘤抑制作用,可以更有效地减小荷肝癌小鼠的肿瘤负荷。在促血管生成大于抗血管生成因素作用下形成的异常的肿瘤血管系统抑制T细胞在内皮细胞的滚动、粘附,最终使肿瘤内浸润的T细胞减少。被正常化的肿瘤血管结构和功能更接近正常血管,肿瘤内浸润的T细胞增多。我们想利用肿瘤血管正常化增加肝癌内T细胞数量,可以通过增加抗血管生成因素,打破肿瘤内的抗血管生成因素和促血管生成因素的不平衡。近期研究表明阻断VEGF/VEGF受体（VEGFR）2信号通路可以暂时正常化肿瘤的血管,增加肿瘤内CD8+T细胞数量。VEGF/VEGFR2抑制剂具有阻断CA4-NPs作用后升高的VEGF功能,使肿瘤血管系统暂时正常化增加肿瘤内CD8+T数量。因此,CA4-NPs和VEGF/VEGFR2抑制剂的联合具有减小荷肝癌小鼠的肿瘤负荷同时增加肿瘤内浸润的CD8+T细胞的潜力。在这项研究中,我们用CA4-NPs联合VEGF/VEGFR2抑制剂DC101减小荷肝癌小鼠的肿瘤负荷同时增加肿瘤内CD8+T数量协同抗PD-1抗体增强肝癌治疗疗效。研究目的:本研究在H22肝癌皮下肿瘤模型中验证CA4-NPs联合DC101协同抗PD-1抗体增强肝癌治疗疗效及其机制。揭示CA4-NPs对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷及DC101对肝癌血管正常化和肿瘤内T细胞数量变化的影响。研究CA4-NPs联合DC101对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷和肿瘤内T细胞数量变化的影响。验证抗PD-1抗体在CA4-NPs联合DC101的协同作用下对H22荷瘤小鼠肿瘤的抑制作用和肿瘤内CD8+T细胞的数量变化的影响。方法:1.CA4-NPs对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷的影响:构建皮下H22鼠源性肝癌动物模型,利用CD31免疫组化染色评估CA4-NPs对肿瘤血管的影响;Ki67免疫组化染色评估CA4-NPs对肿瘤细胞增殖的影响;应用H&E染色观察CA4-NPs给药后肿瘤组织的形态学改变。肿瘤长径评估H22荷瘤小鼠肿瘤负荷。2.DC101对肝癌血管正常化的作用和肿瘤内CD8+T细胞数量的影响:用免疫荧光染色评估肝癌血管结构、肝癌血管灌注及肿瘤内缺氧;流式细胞术检测分析DC101对肝癌内T细胞数量的影响。3.CA4-NPs联合DC101对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷及肿瘤内CD8+T细胞数量的影响:用Ki67免疫组化染色评估CA4-NPs联合DC101对肝癌细胞增殖的影响;应用H&E染色观察CA4-NPs联合DC101给药后肝癌组织内的坏死情况;免疫荧光实验评估CA4-NPs联合DC101对肝癌血管正常化的影响;流式细胞术检测CA4-NPs联合DC101治疗后肝癌组织内CD4+T细胞及CD8+T细胞数量变化。4.CA4-NPs联合DC101协同抗PD-1抗体治疗肝癌疗效评估:在H22肝癌皮下肿瘤模型中观察荷瘤小鼠的抑瘤情况、体重变化和生存时间;利用流式细胞术检测CA4-NPs联合DC101协同抗PD-1抗体对H22荷瘤小鼠肿瘤内CD8+T细胞数量的影响;ELISA检测H22荷瘤小鼠肿瘤内的细胞因子。结果:1.CA4-NPs对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷的影响:与PBS组相比,CA4-NPs治疗组肝癌组织切片中的CD31染色阳性的血管数量明显减少（P<0.0001）,同时肝癌细胞的增殖降低（P<0.01）,肝癌组织细胞坏死增多（P<0.001）。CA4-NPs有效的减小H22荷瘤小鼠肿瘤负荷（P<0.01）。2.DC101对肝癌组织内CD8+T细胞数量的影响:与PBS组相比,DC101治疗组肝癌血管周细胞包被增加（P<0.05）,肝癌血管灌注FITC标记的番茄凝集素（P<0.001）和Hechst 33342（P<0.01）增多,缺氧减少（P<0.05）;与PBS组相比,DC101使肝癌组织内CD4+T细胞（P<0.01）及CD8+T细胞（P<0.001）数量增加。3.CA4-NPs联合DC101对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷及肿瘤内CD8+T细胞数量的影响:与PBS组相比,CA4-NPs联合DC101抑制肝癌细胞的增殖（P<0.05）、引起肝癌的坏死增多（P<0.01）,同时CA4-NPs联合DC101增加肝癌血管周细胞包被（P<0.01）、增加肝癌血管FITC标记的番茄凝集素（P<0.01）和Hechst33342（P<0.01）的灌注,减少肝癌组织内缺氧（P<0.05）。与PBS组相比,CA4-NPs联合DC101增加了肝癌组织内CD4+T细胞（P<0.05）和CD8+T细胞（P<0.001）数量。4.CA4-NPs联合DC101协同抗PD-1抗体治疗肝癌疗效评估:CA4-NPs+DC101+anti-PD-1三药联合组在第10天肿瘤抑制率达到86.4%,明显高于CA4-NPs+DC101组（63.5%）及anti-PD-1组（16.8%）,CA4-NPs+DC101和抗PD-1抗体之间协同作用的Q值为1.24,表明CA4-NPs+DC101与anti-PD-1有明显的协同作用。三药联合组H22荷瘤小鼠的生存期（23天）明显延长,是anti-PD-1组（12天）的1.9倍。在治疗方案的第11天肿瘤组织Ki67免疫组化染色定量分析表明三药联合组阳性细胞数占比最少,肿瘤组织H&E染色定量分析揭示三药联合组坏死面积最大。治疗方案的第11天,三药联合组肝癌组织的CD8+T细胞数量较PBS组,CA4-NPs+DC101组及anti-PD-1组显着增加,同时ELISA结果表明三药联合治疗组肝癌组织内IFN-γ、TNF-α和IL-2明显增高。结论:1.CA4-NPs阻断肝癌血管,抑制肝癌细胞增殖,导致肝癌细胞坏死。CA4-NPs有效的减小H22荷瘤小鼠肿瘤负荷。2.DC101使肝癌血管结构和功能正常化,增加了肿瘤内的CD8+T细胞数量。3.CA4-NPs+DC101减小H22荷瘤小鼠肿瘤负荷,增加了肝癌组织内CD8+T细胞数量。4.CA4-NPs联合DC101协同抗PD-1抗体增加肝癌内CD8+T细胞数量。CA4-NPs+DC101和抗PD-1抗体三药联合具有较强的协同作用,明显抑制肿瘤生长,延长了H22荷瘤小鼠的生存期。
赵亚楠[3]（2021）在《NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究》文中认为第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究研究背景:弥漫性大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）,占所有NHL的30-35%。利妥昔单抗联合化疗作为一线治疗手段显着提高了疗效,但仍有三分之一以上的患者难治或复发。90%的难治/复发病例不能通过常规挽救化疗和自体干细胞移植得到缓解。免疫疗法近年来在肿瘤治疗领域取得重要进展,例如免疫检查点阻断剂（ICB）、CAR-T疗法等,已在多种实体瘤中取得一定的疗效,但在DLBCL患者中反应欠佳。因此,探索DLBCL发病过程中调节免疫稳态的相关机制,评估高危因素,对于提高DLBCL的治疗效果十分重要。炎症反应是肿瘤发生的关键因素之一。炎症小体可介导炎性细胞因子释放,产生炎症级联反应,促进形成适合肿瘤细胞生长的炎性微环境。NLRP3炎性小体是研究最广泛的炎症小体,外来病原体入侵或体内细胞的损伤和死亡,可招募、组装并激活NLRP3炎症小体,活化caspase-1,切割IL-1β和IL-18前体,产生有活性的IL-1β和IL-18,从而介导机体的免疫应答,促进机体清除病原体和内源性损伤。此外,NLRP3炎症小体在肿瘤的发生发展中起着重要的调节作用。既往研究表明,NLRP3炎症小体在乳腺癌、纤维肉瘤和胃癌等多种恶性肿瘤中发挥促癌作用,并且NLRP3及其效应细胞因子IL-1β和IL-18可促进免疫抑制性肿瘤微环境形成,参与肿瘤的免疫逃逸。因此,NLRP3炎症小体诱导的免疫抑制可能是肿瘤发生的机制之一。本课题组前期研究发现,初诊NHL患者血清中IL-18升高,治疗缓解后降低;且淋巴瘤细胞株中的NLRP3炎症小体可被活化,伴随NLRP3炎症小体相关基因的表达升高。然而,NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用尚不清楚。肿瘤细胞可通过多种方式抑制机体的抗肿瘤免疫应答,逃逸宿主的免疫监视。免疫检查点是免疫细胞或肿瘤细胞上表达的调节免疫稳态的分子,对防止自身免疫反应过度激活起着重要作用。然而,肿瘤中过度表达的免疫检查点可使机体免疫功能受到抑制,导致肿瘤的免疫逃逸,例如肿瘤细胞表达的程序性细胞死亡配体1（PD-L1）,与活化T细胞上表达的程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）结合并传递抑制性信号,诱导肿瘤免疫耐受。免疫抑制也是淋巴系统恶性肿瘤发生发展的重要因素之一。研究表明,恶性B淋巴细胞可通过高表达PD-L1逃避免疫监视。另外,肿瘤免疫微环境还存在髓系来源的抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）及调节性T细胞（Tregs）等抑制免疫功能的细胞。研究证实,DLBCL中MDSCs可通过IL-10、S100A12及PD-L1介导T细胞功能抑制。近期研究报道,NLRP3炎症小体/IL-1β途径可促进头颈部鳞状细胞癌的肿瘤发生,阻断该途径延缓了肿瘤生长,并伴随着效应T细胞数量的增加和免疫抑制性细胞的减少。鉴于NLRP3炎症小体在肿瘤发生和免疫抑制中的重要作用,我们推测,DLBCL中NLRP3炎症小体异常活化通过介导肿瘤免疫逃逸促进淋巴瘤发生发展。目前,DLBCL中免疫抑制的调节机制尚不明确,对于DLBCL中NLRP3炎症小体的作用及免疫调节机制的深入认识,有助于识别新的生物标志物,逆转免疫抑制状态,并改善DLBCL患者免疫治疗反应。研究目的:本课题拟研究NLRP3炎症小体在DLBCL发病中的作用及其对肿瘤免疫应答的影响,分析其与临床特征和预后的相关性;体内验证NLRP3炎症小体对淋巴瘤小鼠发病的影响;探讨NLRP3炎症小体对T细胞表型和功能的影响及其参与淋巴瘤免疫抑制的作用及机制;探索NLRP3抑制剂对免疫检查点阻断疗法的影响。预期目标的实现,将揭示NLRP3炎症小体介导的免疫失衡在DLBCL发生发展中的作用及机制,为DLBCL提供新的预后标志物和治疗靶点。研究方法:1.收集35例初诊DLBCL肿瘤组织和35例正常淋巴组织（14例扁桃体组织,7例腋窝淋巴结,7例支气管淋巴结和7例胃周淋巴结）,制备微阵列组织芯片。（1）免疫组化染色评估DLBCL肿瘤组织和正常组织中NLRP3炎症小体效应细胞因子（IL-1β、IL-18）的水平,分析NLRP3炎症小体活化与DLBCL临床特征的关系。（2）免疫组化染色检测PD-L1的水平,分析PD-L1的表达与临床特征的关系。（3）分析IL-1β或IL-18表达与PD-L1表达的关系。2.收集初诊、缓解和难治/复发阶段的DLBCL患者外周血标本,同时收集健康对照者及其他类型NHL患者外周血标本,分离外周血单个核细胞（PBMCs）。（1）检测DLBCL患者抗肿瘤免疫应答能力:流式细胞术检测外周血中T细胞和NK细胞比例,检测T细胞和NK细胞表面免疫检查点分子（TIM-3、PD-1、BTLA、CTLA-4、LAG-3、TIGIT、CD160）的表达,检测T细胞分泌细胞因子能力（IFN-γ、TNF-α）及NK细胞脱颗粒能力（颗粒酶、穿孔素、CD107a）,判断T细胞和NK细胞功能是否受损。分析外周血T细胞表达免疫检查点水平与DLBCL临床特征和预后的关系。（2）流式细胞术检测外周血中MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs、M-MDSCs）和Tregs的比例,判断免疫抑制性细胞在DLBCL中是否扩增。（3）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测NLRP3炎症小体相关基因（IL1B、IL18、NLRP3、ASC、CASP1、NFKB1）在PBMCs中的表达,比较DLBCL患者和健康对照中的表达差异。3.体外培养DLBCL细胞株（OCI-LY3、RC和DB）,对细胞株进行不同处理:①对照组:PBS处理;②活化组:利用脂多糖（LPS）和三磷酸腺苷（ATP）活化NLRP3炎症小体;③抑制组:在加入LPS和ATP同时,利用NLRP3抑制剂MCC950抑制NLRP3炎症小体活化。（1）提取不同处理组细胞的总蛋白,Western Blot方法验证各组DLBCL细胞株NLRP3炎症小体活化状态。（2）将不同处理组的OCI-LY3和RC细胞株分别与健康志愿者的PBMCs进行间接共培养,分别共培养3、7、10天后,收集共培养体系的PBMCs,进行流式细胞术检测,分析T细胞的比例和表型。4.NLRP3炎症小体介导淋巴瘤免疫失衡的体内研究:（1）A20淋巴瘤小鼠模型构建:体外培养小鼠淋巴瘤细胞株A20细胞,接种于4周龄雌性BALB/c小鼠前肢背部皮下,设置:①对照组:腹腔注射无菌PBS;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950阻断NLRP3炎症小体活化。比较两组小鼠淋巴瘤生长情况,分析阻断NLRP3炎症小体活化对小鼠淋巴瘤生长的影响。（2）ELISA检测淋巴瘤小鼠肿瘤匀浆和血浆中IL-1β和IL-18的水平,Western Blot检测小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,评估体内应用MCC950是否能抑制小鼠NLRP3炎症小体活化。（3）WesternBlot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析抑制NLRP3炎症小体对PD-L1表达及相关信号通路的影响。（4）淋巴瘤小鼠抗肿瘤免疫应答检测:分离对照组和NLRP3抑制组小鼠PBMCs、脾细胞、腋窝/腹股沟淋巴结细胞和肿瘤细胞,流式细胞术检测不同部位T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,T细胞比例及其产生IFN-γ、TNF-α和Granzyme B的能力,以及免疫抑制性细胞MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断NLRP3炎症小体活化后荷瘤小鼠体内免疫应答的变化。（5）对A20淋巴瘤小鼠分别注射anti-IL-1β和anti-IL-18抗体,观察抑制IL-1β和IL-18活性对小鼠淋巴瘤生长的作用。流式检测小鼠外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤等部位T细胞比例及其表面PD-1、TIM-3的表达,以及MDSCs、TAMs和Tregs的比例,分析阻断IL-1β和IL-18活性对淋巴瘤小鼠免疫应答的影响。Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,分析阻断IL-1 β和IL-18活性对PD-L1表达的影响。（6）对A20淋巴瘤小鼠分别注射PD-L1抗体、NLRP3抑制剂MCC950,观测对小鼠淋巴瘤生长的抑制作用,分组如下:①PD-L1抗体组:腹腔注射抗小鼠PD-L1抗体;②NLRP3抑制组:腹腔注射MCC950;③联合组:腹腔注射MCC950和PD-L1抗体;④对照组:腹腔注射等量IgG。比较各组小鼠抗肿瘤免疫应答的差异:流式检测外周血、脾脏、淋巴结和肿瘤中T细胞的比例、表型和功能,以及免疫抑制性细胞的比例变化,分析NLRP3抑制剂和PD-L1抗体之间的相互作用。5.统计分析:使用SPSS 21和GraphPad Prism 7软件对数据进行分析。数据表示为平均值±标准差或中位数±数据范围或四分位数间距。所用数据为三次独立重复实验的结果。利用Student t检验和Mann-Whitney U检验评估P值,用Pearson相关系数检验相关性,P值小于0.05表示差异具有统计学意义。研究结果:1.IL-18在DLBCL肿瘤组织中显着升高且与PD-L1表达呈正相关。（1）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织IL-18表达水平明显升高,且与生发中心型DLBCL（GCB-DLBCL）相比,非GCB型（non-GCB）DLBCL具有更高水平的IL-18。进一步亚组分析发现,IL-18和IL-1β在CD10（-）和MUM1（+）的患者中表达水平更高。（2）组织芯片染色结果显示,DLBCL肿瘤组织PD-L1表达水平较正常淋巴组织明显上调,且PD-L1表达与DLBCL生存不良的独立预测因子Ki-67表达成正相关。而且,肿瘤微环境中PD-L1与IL-18的表达水平成正相关。（3）RT-qPCR结果显示,与健康对照相比,DLBCL患者PBMCs中的IL1B和IL18基因表达明显上调。2.流式细胞术检测发现,DLBCL患者抗肿瘤免疫应答受到抑制。（1）流式检测T细胞和NK细胞产生细胞因子水平,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血CD3+T细胞分泌TNF-α和IFN-γ的水平明显减少,NK细胞（CD3-CD56+）比例显着降低,NK细胞产生穿孔素和颗粒酶的水平明显下降。（2）流式检测免疫检查点分子表达,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中T细胞表面PD-1和TIM-3的阳性率明显上升,NK细胞表面TIM-3和BTLA的表达明显升高。进一步分析患者临床资料发现,PD-1+T细胞比例与血清乳酸脱氢酶（LDH）水平呈正相关。而且,T细胞表达PD-1和TIM-3水平与淋巴瘤Ann Arbor分期和国际预后指数（IPI）有关,Ann Arbor Ⅲ/Ⅳ期的DLBCL患者较Ⅰ/Ⅱ期的患者外周血中PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,IPI≥3分的患者较IPI0-2分的患者PD-1+T细胞和TIM-3+T细胞比例明显升高,提示DLBCL患者T细胞表面PD-1和TIM-3表达的增多与不良预后相关。（3）流式检测免疫抑制性细胞比例,发现:与健康对照相比,DLBCL初诊患者外周血中MDSCs和Tregs细胞的比例明显增高,而治疗后缓解的DLBCL患者Tregs比例较初诊患者明显下降,难治/复发DLBCL患者Tregs比例较缓解患者明显升高。3.体外实验证实,DLBCL细胞株的NLRP3炎症小体可被活化并影响PD-L1表达。（1）WesternBlot结果显示:与对照组相比,LPS和ATP处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1蛋白水平明显升高;MCC950处理后,OCI-LY3、RC和DB细胞的蛋白裂解产物中,IL-1β（p17）和PD-L1表达明显下调。（2）体外活化或抑制RC或OCI-LY3细胞的NLRP3炎症小体,并与PBMCs共培养,流式结果显示:共培养7天后,RC细胞和OCI-LY3细胞的共培养体系中,NLRP3炎症小体活化组的CD8+T细胞比例均较对照组显着降低,而NLRP3炎症小体抑制组的CD8+T细胞比例较活化组显着升高。4.体内实验证实,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可抑制淋巴瘤生长,降低PD-L1表达。（1）我们通过向BALB/c小鼠皮下注射同系A20淋巴瘤细胞株建立了小鼠淋巴瘤模型,接种后7天左右,小鼠右侧斜肋部皮下出现肉眼可见的肿瘤,接种后14天左右,小鼠肿瘤负荷明显增加。至观察终点处死小鼠,ELISA结果显示,肿瘤组织匀浆中IL-1β和IL-18水平明显升高。（2）Western Blot结果证实:腹腔注射MCC950使小鼠肿瘤和脾脏中NLRP3炎症小体效应产物IL-1β和IL-18水平显着降低,并且显着下调淋巴瘤小鼠模型肿瘤中的PD-L1和磷酸化STAT3（pSTAT3）的蛋白水平。（3）分析NLRP3炎症小体与小鼠淋巴瘤生长的关系,发现观察终点时,NLRP3抑制组淋巴瘤小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组。5.流式结果显示,MCC950体内阻断NLRP3炎症小体活化可提高淋巴瘤小鼠的T细胞比例及其产生TNF-α的水平,减少PD-1+或TIM-3+T细胞比例,降低免疫抑制性细胞的水平。（1）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠肿瘤浸润CD8+T细胞明显增多,脾脏CD3+、CD4+、CD8+T细胞比例明显升高,脾脏CD3+T细胞产生TNF-α的水平明显增加,而分泌IFN-γ的水平下降。（2）与对照组相比,NLRP3抑制组小鼠脾脏和淋巴结中CD3+T细胞表达PD-1和TIM-3的比例显着降低。（3）与对照组相比,NLRP3抑制组MDSCs和TAMs比例在小鼠肿瘤、外周血、脾脏中显着降低,Tregs细胞比例在肿瘤和脾脏中显着降低。6.体内中和IL-18可抑制淋巴瘤生长,降低免疫抑制性细胞比例。（1）将淋巴瘤小鼠分别注射IL-1β或IL-18中和抗体,发现观察终点时,anti-IL-1β组和anti-IL-18组小鼠淋巴瘤大小均显着低于对照组。（2）流式结果显示:与对照组相比,anti-IL-18组小鼠肿瘤、外周血和淋巴结中CD8+T细胞比例均显着增加;anti-IL-1β组小鼠淋巴结中CD8+T细胞比例增加,而外周血中CD8+T细胞比例降低。（3）流式检测T细胞表面PD-1和TIM-3的表达,结果显示:anti-IL-18组小鼠外周血和淋巴结中CD8+T细胞表达PD-1降低,肿瘤、外周血和脾脏中CD4+T细胞表达PD-1的比例降低,且肿瘤浸润T细胞表达TIM-3降低;而anti-IL-1β组小鼠T细胞表达PD-1百分比无明显变化,肿瘤T细胞表面TIM-3表达升高。（4）流式检测免疫抑制性细胞的比例,发现:anti-IL-18小鼠外周血MDSCs和TAMs比例均明显低于对照组,且anti-IL-18组小鼠肿瘤和脾脏的Tregs比例较对照鼠显着降低;anti-IL-1 β组小鼠外周血MDSCs和TAMs也明显低于对照组,而Tregs比例无明显改变。（5）Western Blot检测小鼠肿瘤组织PD-L1及相关信号通路分子的表达,发现anti-IL-18和anti-IL-1β组小鼠肿瘤组织中PD-L1和pSTAT3蛋白表达水平均较对照显着降低。7.NLRP3炎症小体抑制剂和PD-L1抗体对于抑制淋巴瘤生长具有拮抗作用。（1）在本研究中,我们分别用MCC950、anti-PD-L1抗体单一处理或MCC950联合anti-PD-L1抗体处理淋巴瘤小鼠模型,观察对小鼠淋巴瘤生长的影响,结果显示,单用MCC950或anti-PD-L1抗体均能减小淋巴瘤小鼠的肿瘤负荷,而联用MCC950和anti-PD-L 1抗体降低了肿瘤抑制效果。（2）流式分析发现,与对照相比,anti-PD-L1抗体能显着提高肿瘤浸润性CD8+T细胞和总T细胞的比例,并增加脾脏CD8+T细胞IFN-γ和TNF-α产生;而联合MCC950后,肿瘤CD8+T细胞比例及脾脏CD8+T细胞产生IFN-γ和TNF-α的水平明显低于单用anti-PD-L1组。以上结果说明,NLRP3抑制剂会破坏由PD-L1抗体提高的CD8+T细胞比例和产生细胞因子能力。（3）流式分析发现,anti-PD-L1组小鼠脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞比例明显高于对照组和MCC950组,而联合组小鼠的脾脏和淋巴结中PD-1+T细胞的百分比也明显高于单用MCC950组。此外,与MCC950组相比,anti-PD-L1组肿瘤浸润的MDSCs和TAMs的百分比均显着提高,而且联合用药组小鼠肿瘤中的MDSCs和TAMs比例也明显高于单用MCC950组。可见,PD-L1抗体在一定程度上破坏了由NLRP3抑制剂降低的免疫抑制因素。结论:1.DLBCL患者中NLRP3炎症小体异常活化,肿瘤组织中效应细胞因子IL-18表达上调,且与共抑制配体PD-L1表达成正相关。2.DLBCL患者体内抗肿瘤免疫应答受到抑制,肿瘤微环境中PD-L1表达增加,外周免疫抑制性细胞群体MDSCs、TAMs和Tregs明显扩增,T细胞表达PD-1和TIM-3增加,与DLBCL不良预后相关。3.阻断NLRP3炎症小体活化可显着抑制小鼠淋巴瘤进展,增强抗肿瘤免疫应答,降低免疫抑制性细胞数量。而且,NLRP3炎症小体主要通过效应因子IL-18介导淋巴瘤中免疫应答的调节。4.A20淋巴瘤小鼠模型体内阻断NLRP3炎症小体活化可拮抗PD-L1抗体对肿瘤的抑制作用。第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究研究背景胃粘膜相关淋巴组织（Mucosa-associated lymphoid tissue,MALT）淋巴瘤的发生发展与幽门螺杆菌（Helicobacter Pylori,HP）感染导致的胃粘膜区域免疫稳态失衡密切相关。胃MALT淋巴瘤是慢性炎症转化为肿瘤的典型疾病类型。胃粘膜局部微环境中大量免疫细胞浸润、细胞因子产生等导致的免疫稳态失衡,在胃MALT淋巴瘤的发生发展中起重要作用,因此探究其潜在的免疫调节机制对于明确炎症-肿瘤转化的机制意义重大。髓系来源的抑制细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）由处于早期分化阶段的髓系细胞组成。生理状态下MDSCs处于静息状态,缺乏免疫抑制活性。在各种病理状态下,MDSCs被募集到淋巴器官或肿瘤组织中,通过细胞间接触或可溶性细胞因子的作用,产生广泛的免疫抑制作用。MDSCs主要通过抑制T细胞、NK细胞功能介导肿瘤免疫耐受。研究发现,MDSCs中高活性的精氨酸酶1（Arginase 1,Arg-1）消耗TCR合成的原料L-精氨酸,并抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D3、CDK4的表达,导致T细胞增殖阻滞。MDSCs通过诱导型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase,iNOS）产生一氧化氮,诱导T细胞凋亡。除此之外,MDSCs还能通过促进调节性T细胞（Tregs）聚集发挥免疫抑制作用。由此可见,MDSCs在肿瘤免疫耐受中扮演重要角色。胃粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分,具有独特的结构和功能,其中γδT细胞的富集是胃粘膜区域免疫的重要特性。γδT细胞在胃肠道粘膜中含量丰富,对于维持胃粘膜微环境稳态、抵御外来微生物入侵及调节获得性免疫应答起重要作用。yδT细胞可分泌多种细胞因子,按功能不同可划分为分泌IFN-y的γδT1和分泌IL-17的γδT17,其中的T17的作用日益受到重视。γδT17在纤维肉瘤、皮肤癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的微环境中大量浸润,通过促进血管生成、肿瘤侵袭以及诱导免疫耐受等发挥促癌作用。研究表明,HP感染相关的慢性胃炎可引起γδT细胞大量活化18,而且在胃MALT淋巴瘤微环境中存在IL-17的高表达19,20。然而,关于γδT17在胃MALT淋巴瘤中的作用尚不清楚,有待于进一步研究。近年研究显示,γδT17可通过募集和激活MDSCs来介导结直肠癌和肝细胞癌肿瘤微环境中的免疫耐受。在结肠癌微环境中,IL-23诱导γδT17细胞极化,分泌IL-17、IL-8、TNF-α和GM-CSF等细胞因子,招募并激活MDSCs。在肝癌微环境中,活化的γδT17产生大量IL-17,可促使肿瘤细胞分泌CXCL5,进而招募MDSCs;同时,MDSCs通过分泌IL-23和IL-1β促进γδT17极化,形成正反馈环路,进一步介导肿瘤免疫耐受。由此我们推测,HP感染引起胃粘膜局部慢性炎症,微环境免疫稳态失衡,γδT17被激活,通过分泌IL-17等细胞因子,募集MDSCs,介导肿瘤细胞免疫逃逸,参与胃MALT淋巴瘤发生发展。研究目的本项目拟以胃MALT淋巴瘤区域免疫微环境为切入点,研究γδT17、MDSCs及相关细胞因子在胃MALT淋巴瘤免疫失衡中的关键作用,探索胃MALT淋巴瘤从炎症向肿瘤转化过程中的免疫调节机制。研究方法1.利用H.felis给BALB/c小鼠灌胃,构建小鼠胃MALT淋巴瘤模型,利用快速尿素酶实验和PCR方法检测细菌定植情况,利用H&E染色和免疫组化鉴定小鼠胃粘膜病理特征,动态监测小鼠胃组织成瘤情况。2.H.felis感染后不同时间点（8、11、14、19月）分离小鼠的外周血、脾脏及胃组织,流式细胞术检测MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠中的比例。制备小鼠胃组织的石蜡切片,利用免疫荧光和免疫组化检测胃局部MDSCs（Gr-1+CD 11 b+）的数量及其产生Arg-1和iNOS的水平。3.在胃MALT淋巴瘤小鼠模型发病过程中,利用ELISA和RT-qPCR检测胃组织IL-17蛋白水平和Il17a基因表达的变化,通过流式细胞术分析产生IL-17的三种主要细胞γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例变化,比较γδT17细胞水平在胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠之间的差异,以及随H.felis感染时间延长的变化趋势。4.比较胃MALT淋巴瘤小鼠模型和对照鼠胃局部细胞因子和趋化因子的差异:RT-qPCR检测Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）、细胞因子及趋化因子的表达,ELISA检测IL-1β、IL-23等细胞因子的表达和水平,Western Blot检测NLRP3炎症小体是否在H.felis感染鼠胃组织活化,分析差异表达的细胞因子或趋化因子在胃MALT淋巴瘤小鼠发病中的作用。5.收集胃MALT淋巴瘤初诊患者和健康对照者的外周血标本,并制备胃MALT淋巴瘤组织和正常胃组织的石蜡组织切片。流式细胞术检测外周血中MDSCs（CD45+Lin-CD33+HLA-DR-CD11b+）、Tregs（CD4+CD25+Foxp3+）、γδT17（TCRγδ+IL-17+）、Th17（CD4+IL-17+）和Tc17（CD8+IL-17+）的比例,比较胃MALT淋巴瘤患者和健康志愿者之间的差异。免疫荧光检测MD S C s（CD33+CD11b+）和γδT17（TCRγδ+IL-17+）在胃MALT淋巴瘤肿瘤组织中的浸润,免疫组化检测Arg-1、iNOS、IL-1β和IL-23的表达。6.统计分析:本研究数据以平均数±标准差或中位数±四分位数间距表示,用Student t检验或Mann-Whitney检验评估,使用 SPSS 21 和GraphPad Prism 7对数据进行分析。P值小于0.05差异具有统计学意义。结果1.胃MALT淋巴瘤小鼠模型鉴定:H&E染色结果显示,从灌胃后8个月开始,H.felis感染鼠胃黏膜出现以淋巴细胞聚集为主的淋巴滤泡,且随感染时间延长,H.felis感染鼠胃黏膜的病理损害逐渐加剧;感染后14个月,淋巴细胞明显破坏粘膜肌层,甚至粘膜全层,形成淋巴上皮损害（LEL）,这是胃MALT淋巴瘤的典型特征。免疫组化证实,H.felis感染鼠胃黏膜聚集的淋巴组织主要由CD20+的B淋巴细胞组成。以上结果证实,长期的H.felis感染会导致BALB/c小鼠胃黏膜病理损害,先后出现炎症、淋巴组织增生、淋巴滤泡形成和LEL,此病程演变与人的胃MALT淋巴瘤的形成过程高度一致。2.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中MDSCs浸润增多。流式结果显示,H.felis感染早期胃部病变较轻时,感染鼠外周血中MDSCs的比例较对照鼠无明显变化;H.felis感染中后期,胃MALT淋巴瘤小鼠模型的外周血中MDSCs的比例较对照鼠明显升高。免疫荧光和免疫组化证实,与对照鼠相比,Gr-1+CD11b+的MDSCs在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织浸润显着增多,而且胃组织局部的Arg-1分泌明显增多。3.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜区域免疫微环境中γδT17大量聚集。RT-qRCR和ELISA结果显示,H.felis感染鼠胃组织IL-17在mRNA和蛋白水平均显着高于对照鼠。同时,免疫组化也证实了 IL-17在胃MALT淋巴瘤小鼠模型淋巴滤泡形成部位的高表达。流式数据显示:与对照鼠相比,H.felis感染后8个月小鼠脾脏γδT细胞的比例明显升高,而CD4+T和CD8+T细胞比例无明显差异;而且,胃MALT淋巴瘤小鼠的脾脏中γδT17在产生IL-17的T淋巴细胞中的比例显着升高,而Th17和Tc17比例在两组小鼠之间无明显变化,提示γδT17是胃MALT淋巴瘤发展过程中调节免疫稳态的主要细胞群体。进一步研究发现,γδT17的比例随着H.felis感染时间的延长逐渐升高,提示的T17与疾病进展的相关性。4.胃MALT淋巴瘤小鼠胃粘膜病变部位参与γδT17极化和募集的细胞因子和趋化因子表达增加。RT-qPCR结果显示,与对照鼠相比,Tlr2、Tlr7和Tlr9基因在H.felis感染后的小鼠胃组织中表达明显升高。Western Blot结果显示,NLRP3炎症小体的活化产物cleaved caspase-1的蛋白水平在H.felis感染后的小鼠胃组织明显增加。ELISA评估小鼠胃组织匀浆中细胞因子的水平,发现与对照鼠相比,IL-1β和IL-23在胃MALT淋巴瘤小鼠模型的胃组织中显着升高。同时RT-qPCR检测发现,Ccr6和Ccl20在胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃组织的表达显着高于对照鼠。5.胃MALT淋巴瘤临床标本检测结果:流式检测发现,与健康志愿者相比,胃MALT淋巴瘤患者外周血中MDSCs和Tregs的比例显着升高。免疫荧光和免疫组化证明,胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中MDSCs和γδT17细胞水平较正常胃组织显着升高,且Arg-1和iNOS在肿瘤微环境中的表达显着上调,同时细胞因子IL-1β和IL-23的表达明显上调。结论1.持续性的H.felis感染可导致小鼠胃组织从胃炎进展到胃MALT淋巴瘤,病理发病过程与人胃MALT淋巴瘤的发生发展高度相似。2.MDSCs在H.felis感染小鼠胃部病变组织和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中大量浸润,参与炎症向淋巴瘤的转化。3.胃MALT淋巴瘤小鼠模型胃部病变和胃MALT淋巴瘤患者肿瘤组织中,IL-17分泌增多,γδT17大量聚集,IL-1β、IL-23的激活和CCL20-CCR6的趋化作用可能参与γδT17在病变部位的浸润。γδT17随感染时间延长逐渐增多,可能通过募集MDSCs参与胃MALT淋巴瘤的进展。总之,胃局部免疫稳态失衡是胃MALT淋巴瘤发生发展的重要因素。
涂丽裙[4]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中进行了进一步梳理转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
买为丽旦·衣明江[5]（2021）在《纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:肝细胞肝癌（HCC）是目前严重危害人类生命健康的重大疾病,是全球最常见的恶性肿瘤之一。新型纳秒脉冲消融（ns PEF）在激活抗肿瘤免疫方面的特色优势逐渐成为肿瘤免疫治疗的研究热点,但其作用机制不明确。目前PD-1抗体治疗是公认的抗肿瘤免疫治疗方法。由此,本研究探讨ns PEF消融在肝细胞肝癌免疫激活效应中的作用机制,并与PD-1抗体治疗作对比,为ns PEF免疫疗法的临床应用提供理论基础。方法:（1）培养及传代用荧光素酶标记的Hepa1-6肝癌细胞株;通过C57BL/6J小鼠肝脏注射Hepa1-6肝癌细胞株建立肝癌移植瘤模型;将24只原位移植瘤模型小鼠分为三组:ns PEF组、PD-1抗体治疗组和对照组,对ns PEF组小鼠进行一次ns PEF消融处理,消融仪物理参数为:脉冲宽度300ns、电压20kv/cm、频率4Hz、脉冲1000次;对PD-1抗体治疗组小鼠腹腔注射PD-1抗体,间隔3天,共3次给药;治疗结束后处死小鼠,取血分离血清、制备肿瘤组织单细胞悬液,通过流式细胞术检测肿瘤组织中CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD19+B、NK细胞比例;采用CBA技术检测外周血Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-α）和Th2（IL-4、IL-5、IL-6、IL-10）类细胞因子浓度;通过统计学方法分析肿瘤局部免疫细胞比例和外周血细胞因子浓度的差异。（2）通过DIA定量蛋白质组学技术筛选ns PEF组和PD-1抗体治疗组差异表达的蛋白质;采用生物信息学方法鉴定出与免疫相关的重要差异蛋白。（3）通过基于多重免疫组化的PE Vectra全光谱采集技术,同时标记肿瘤局部T、B、NK细胞和差异蛋白,通过Inform定量分析软件计算各指标表达密度及差异蛋白与T、B、NK细胞特异性指标的共定位关系;通过统计学方法分析免疫细胞和差异蛋白表达密度在各组间的差异及相关性。结果:（1）ns PEF组和PD-1抗体治疗组CD3+T、CD4+T、B、NK细胞比例均明显高于对照组;ns PEF组CD4+/CD8+比值明显高于对照组,PD-1抗体治疗组CD8+T细胞比例明显高于对照组;ns PEF组Th1类细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α浓度均明显高于对照组,PD-1抗体治疗组IL-2浓度明显高于对照组;ns PEF组Th2类细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10浓度均明显高于对照组,PD-1抗体治疗组IL-4、IL-5、IL-10浓度明显高于对照组。（2）DIA质谱分析筛选出ns PEF组和PD-1抗体治疗组差异表达蛋白分别共有181和763个,其中与免疫病理改变相关者分别为21和35个;结合文献报道和本研究研究方向,ns PEF组差异蛋白LXN、GRN、TGF-β1、ELNE选为进一步研究对象,其中TGF-β1、ELNE是ns PEF组和PD-1抗体治疗组共同差异蛋白。（3）LXN、GRN、TGF-β1、ELNE与T、B、NK细胞特异性指标均有不同程度的共定位,其中LXN在B细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性;GRN在NK细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性;TGF-β1在T细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性,ELNE在T细胞上的表达有显着性差异,并二者有显着相关性。结论:ns PEF消融可引起肿瘤微环境中免疫细胞的大量浸润,及外周血多种细胞因子的改变,表明ns PEF消融治疗具有调节抗肿瘤免疫、增强体液免疫以及免疫杀伤功能的作用;ns PEF消融可以引起肿瘤局部多种蛋白质的差异表达,其中与免疫微环境介导的肿瘤侵袭、转移相关蛋白主要有LXN、GRN、TGF-β1、ELNE,这些差异蛋白作为调节ns PEF消融免疫效应的重要因子,可能通过调控T、B、NK细胞激活抗肿瘤免疫;TGF-β1、ELNE是ns PEF组和PD-1抗体治疗组共同的差异表达蛋白,提示二者可能是肝癌免疫治疗过程中的重要调控因子。
陈安仙[6]（2020）在《表达CD155胞外区的重组溶瘤痘苗病毒治疗恶性肿瘤的临床前研究》文中指出研究背景免疫治疗是当今颇具希望的肿瘤治疗方法,与其他传统治疗方法不同的是,免疫疗法是通过“唤醒”机体的免疫系统来清除肿瘤。免疫检查点是调节共刺激和共抑制信号来调控T细胞反应的一类分子。TIGIT是除PD-1和CTLA-4两个典型共抑制信号分子外的另外一个重要的免疫检查点分子。因此,针对TIGIT靶点的免疫疗法是当前研究的热点。CD155（Poliovirus receptor,PVR）是TIGIT的配体,其在肿瘤细胞上过表达。PVR可以与共刺激受体CD226和共抑制受体TIGIT（T-cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif）结合,分别产生活化或抑制信号,其与TIGIT的亲和力远高于CD226。研究表明,阻断TIGIT信号可以逆转细胞毒性T淋巴细胞和NK细胞介导的抗肿瘤免疫耗竭,同时阻断CD226信号会抵消阻断TIGIT信号产生的活化效果,表明TIGIT的免疫抑制作用可能是通过竞争性抑制了CD226活化通路。溶瘤免疫疗法是一种新型肿瘤免疫疗法。溶瘤病毒具有多重杀瘤机制:1)病毒直接溶解肿瘤细胞;2)诱导肿瘤细胞免疫原性死亡（immunogenic cell death）,导致肿瘤溶解释放大量的肿瘤抗原,后者被DC等抗原呈递细胞呈递给T细胞并且活化T细胞,诱导机体产生系统性免疫应答和持久的免疫记忆;3)溶瘤病毒可以作为基因治疗的载体,携带治疗基因发挥抗肿瘤作用。实验室前期研究工作显示,表达可溶性PVR胞外区的重组溶瘤腺病毒初步显示对H22肝癌腹水瘤有显着的治疗效果,但是对实体瘤疗效欠佳。本研究利用痘苗病毒（WR株）作为载体,构建了表达鼠源CD155胞外区的重组溶瘤痘苗病毒,研究其对实体肿瘤的治疗效果。研究方法首先将携带目的基因（PVR,CD155）的质粒与野生型痘苗病毒同源重组得到重组病毒,通过多轮筛选和鉴定得到单克隆病毒,随后大量扩增病毒和测定病毒滴度。Western blot检测重组病毒PVR蛋白的表达和分泌。CCK-8和病毒滴度测定法分别检测目的基因插入对病毒溶瘤和病毒复制能力的影响。建立H22肝癌腹水瘤和4T1乳腺癌、CT26和MC38结肠癌实体瘤模型,瘤内注射溶瘤病毒进行治疗,研究溶瘤病毒的体内抗肿瘤作用。实验结果1.重组溶瘤痘苗病毒VV-s CD155能够表达s CD155,并能够分泌到细胞上清;2.目的基因的插入不影响病毒的复制和溶瘤能力;3.VV-s CD155能够有效招募淋巴细胞到肿瘤微环境;4.在多种实体瘤中,VV-s CD155具有显着的抗肿瘤作用,显着延长小鼠生存时间;意义我们构建的重组溶瘤痘苗病毒表达CD155的胞外区,该截短型蛋白能分泌到细胞外,与其特异性受体TIGIT结合,阻断了肿瘤微环境中内源性TIGIT/CD155共抑制通路,同时激活了CD226/CD155共刺激通路,将肿瘤微环境中抑制性信号转变成活化性信号,在小鼠实体瘤和腹水瘤中展现出良好的抗肿瘤作用,本研究将溶瘤免疫治疗与免疫检查点阻断治疗相结合,提供了一个有效的手段和借鉴。
张琪[7]（2020）在《肿瘤特异激活的CD47纳米抗体的制备及性质分析》文中进行了进一步梳理CD47也称整合素相关蛋白（integrin-associated protein,IAP）,是一个由5次跨膜结构域和一个免疫球蛋白样的胞外域及一个可变剪接的胞内段组成的膜蛋白,其与表达于巨噬细胞等固有免疫细胞表面的配体SIRPα结合抑制巨噬细胞的吞噬作用。很多肿瘤细胞通过过表达CD47抑制固有免疫的抗肿瘤效应。CD47-SIRPα通路也被称为固有免疫检验点,通过抗体阻断该通路是当前一个很有前景的免疫治疗策略。然而由于CD47在正常细胞普遍表达,尤其是在红细胞和血小板表面高表达,使得抗CD47抗体Fc结构与其受体相互作用,可能使红细胞和血小板发生凝聚、并引发贫血和血小板减少等副作用,并且降低抗体的疗效。本研究利用纳米抗体不含Fc的特点,通过在CD47纳米抗体上连接一段可被肿瘤特异蛋白酶水解的遮蔽肽,形成钝化形式的CD47纳米抗体前抗体,以期能在肿瘤部位特异激活CD47纳米抗体,从而克服其对正常细胞的毒性。研究内容主要包括以下三个方面:1.CD47纳米抗体前抗体的制备采用一段与CD47抗原具有竞争结合作用的12肽作为CD47纳米抗体的遮蔽肽（简称CERX）,由此构建钝化形式的CD47纳米抗体。同时,为了使CD47纳米抗体能在肿瘤部位特异激活,我们在遮蔽肽和纳米抗体之间设计了一段对MMP蛋白酶敏感的连接肽,形成抗CD47纳米抗体前抗体。采用DNA合成方法,分别合成CERX-连接肽与纳米抗体3D3-2和3C1融合的CD47纳米抗体前抗体（分别简称为3D3-2前抗体和3C1前抗体）基因,连接到表达载体上,构建p ET22b-CERX-3C1和p MECS-CERX-3D3-2重组质粒,转化BL21（DE3）大肠杆菌,进行IPTG诱导表达。Western blot检测目的蛋白的表达,非竞争ELISA方法检测目的蛋白与CD47结合特异性和亲和力,细胞ELISA和流式细胞术检测目的蛋白与表达CD47的Ec9706细胞的结合。结果表明,3C1前抗体和3D3-2前抗体重组基因均能在BL21（DE3）中表达,并在IMAC纯化中得到纯度约90%的重组蛋白。3C1和3C1前抗体均能与CD47蛋白和表达CD47的食管癌细胞Ec9706结合,且3C1前抗体与两者的结合活性均明显下降。虽然3D3-2和3D3-2前抗体与CD47蛋白可以结合,但均不与Ec9706细胞结合,在后续研究中不再采用。2.肿瘤组织对CD47纳米抗体前抗体的特异激活为了验证CD47纳米抗体前抗体是否被肿瘤组织特异激活,首先建立H22小鼠移植瘤模型,明胶酶谱法确定肿瘤组织匀浆液中的MMP-2,MMP-9的总酶活力,通过改变不同的孵育时间测定明胶酶和移植瘤组织匀浆液对前抗体的水解。Western Blot结果显示Ec9706细胞和H22细胞均表达MMP-2,MMP-9蛋白。酶活性测定表明肿瘤组织匀浆液酶活力为0.0149 U/μL。SDS-PAGE结果表明明胶酶和肿瘤组织匀浆液在37℃孵育7 h均可完全水解前抗体中连接肽。3.肿瘤特异激活的抗CD47纳米抗体对巨噬细胞促吞噬作用和毒性分析采用间接ELISA研究前抗体水解前后与CD47抗原的结合能力,流式细胞术和细胞ELISA确定前抗体水解前后与肿瘤细胞的结合能力,竞争ELISA方法检测前抗体水解前后对CD47蛋白结合SIRPα的阻断作用,血凝实验和溶血实验研究前抗体水解前后的毒副作用。采用分离得到的小鼠原代巨噬细胞检测前抗体水解前后对巨噬细胞吞噬能力的影响。结果表明水解后的3C1前抗体与CD47蛋白和表达CD47的肿瘤细胞结合活性与3C1接近,对CD47与SIRPα的结合也显示出与3C1相似的阻断活性。在凝集实验中,水解后的3C1前抗体对红细胞的凝集与3C1相似,并在补体存在下不会导致红细胞溶解,但对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞无影响。结论:综上所述,本研究成功构建了含有抑制性肽段的可被肿瘤组织匀浆液水解的抗CD47纳米抗体,并通过诱导表达,免疫印迹表明载体构建成功并能表达目的蛋白。在明胶酶和肿瘤组织匀浆液中水解7 h可完全水解前抗体中连接肽,水解后3C1前抗体显示出与3C1相似的抗原结合活性,与未水解的3C1前抗体相比抗原结合活性提高,能有效阻断CD47与SIRPα的结合,对红细胞的凝集作用强于未水解3C1前抗体。在补体存在下,不会引起红细胞溶解。
陈晓晨[8]（2020）在《PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究》文中研究说明研究背景及目的淋巴瘤是目前发病率最高的血液恶性肿瘤,严重威胁人类健康。淋巴瘤异质性强,病理分型复杂。弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是其中最常见的亚型,发病率约占所有淋巴瘤30%。R-CHOP方案作为标准一线方案应用临床,明显改善了DLBCL患者的疗效和生存,但复发难治（R/R）DLBCL仍然是临床面临的棘手问题。免疫治疗的临床应用,尤其是免疫检查点治疗和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy,CAR-T）的突破性进展,给R/R DLBCL患者带来新的希望。程序性细胞死亡1受体（PD-1）是关键的免疫检查点分子之一。PD-1单抗治疗R/R霍奇金淋巴瘤的总反应率高达90%。然而,目前PD-1单抗治疗DLBCL的临床数据尚不多见,有待进一步探索和研究。此外,当前CAR-T治疗R/R DLBCL的临床试验也正在国内外广泛开展中。T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（TIM-3）是另一个重要的免疫检查点分子。文献报道,PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞诱导性表达TIM-3上调,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。本课题关注于免疫治疗R/R DLBCL,拟探究T细胞表达PD-1水平对于DLBCL的临床意义;分析PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）临床治疗R/R DLBCL患者的疗效、安全性、预测生物标记物及耐药机制;并进一步探索PD-1单抗和TIM-3单抗联合治疗B系淋巴瘤的疗效和免疫学机制,为未来相关临床应用提供实验基础。研究方法（1）应用流式细胞仪检测DLBCL患者外周血（40例）和淋巴结（30例）T细胞亚群分布及其细胞表面PD-1表达情况;应用ELISA方法检测患者血浆（40例）可溶性PD-1及PD-L1水平及动态演变。将患者的上述指标与对照组（正常人群及淋巴结反应性增生患者）对比,分析PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1在DLBCL发病机制中的作用;对DLBCL患者进行临床特征（病理亚型,IPI评分）亚组分析和生存分析,以进一步探究PD-1/PD-L1对DLBCL患者临床特征和生存的影响。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL患者,观察疗效和毒副反应情况;并应用外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片和免疫组化技术对患者淋巴结组织进行检测,以探寻PD-1靶向治疗相关的预测生物标记物;应用流式细胞仪监测患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3的动态变化,以进一步探究PD-1靶向治疗耐药与耗竭T细胞可能的相关机制。（3）建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型,观察肿瘤成瘤率及生长速度;分别应用阻断性PD-1单抗单药和PD-1单抗+TIM-3单抗联合方案治疗成瘤小鼠,观察各组治疗效果和生存情况;并应用CD8+磁珠分选、流式细胞仪、ELISA、CCK8等方法进一步探究PD-1+TIM-3单抗联合方案治疗的免疫学机制。研究结果（1）与正常对照组相比,初诊DLBCL患者外周血CD4+T细胞占CD3+T细胞的比例明显下降（45.47±10.07%VS.61.91±10.52%,P=0.036）,而CD8+T细胞比例则相应升高（43.99±9.32%VS.31.94±6.50%,P=0.045）,且CD4+T细胞及CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:16.30±4.58%VS.8.96±2.95%,P=0.017;CD8+PD-1+:18.12±5.43%VS.10.13±3.30,P=0.023）。与淋巴结反应性增生患者相比,DLBCL患者淋巴结CD3+T细胞比例明显下降（23.55±15.62%VS.56.65±10.36%,P=0.002）;CD4+和CD8+T细胞占CD3+T细胞的比例差异无显着性（P>0.05）,但CD4+和CD8+T细胞表达PD-1水平均明显上调（CD4+PD-1+:45.95±11.61%VS.18.26±3.61%,P=0.001;CD8+PD-1+:55.11±13.45%VS.19.32±3.78%,P=0.001）。与正常对照组相比,DLBCL患者初诊时血浆可溶性PD-1明显上升（4.49±3.53ng/ml VS.0.47±0.36ng/ml,P=0.002）,PD-L1水平也明显上升（1.21±1.03ng/ml VS.0.26±0.24ng/ml,P=0.039）。对DLBCL患者进行临床特征亚组分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1水平和患者临床特征（病理亚型,IPI评分）相关;生存分析显示PD-1（膜表达和可溶性表达）以及可溶性PD-L1高表达组的OS和PFS均明显低于低表达组（P<0.05）;动态分析患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平显示,其与患者病情状态密切相关。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL,部分患者获得了明显疗效（PD-1单抗治疗ORR达33%;PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞治疗ORR达72%）,总体耐受性好,毒副反应较轻;外显子基因捕获二代测序和寡核苷酸阵列芯片分析提示患者肿瘤染色体及基因突变程度高者对PD-1单抗治疗更加敏感（P<0.05）;免疫组化提示肿瘤浸润T细胞数量或/和PD-L1表达高者,对PD-1单抗治疗反应更好（P<0.05）。患者治疗前后外周血T细胞表达PD-1和TIM-3呈动态变化,随着PD-1单抗治疗的进行,T细胞PD-1表达下调,但TIM-3表达上调,且疗效不佳组患者T细胞表达TIM-3上调更加明显（CD4+TIM-3+:29.12±3.52%VS.20.10±2.71%,P=0.001;CD8+TIM-3+:30.12±3.65%VS.19.93±3.52%,P=0.001）。（3）成功建立BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型;PD-1单抗+TIM-3单抗联合组疗效和生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组;免疫学机制研究提示:PD-1单与PD-1单抗单药组和对照组相比,PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞浸润增加（30.12±2.15%VS.14.94±1.42%VS.4.99±0.95%,P=0.001）,且其TIM-3表达明显下调（20.55±1.46%VS.60.14±2.98%VS.40.01±2.52%,P=0.001）;体外T细胞功能学实验提示PD-1+TIM-3单抗联合组瘤体中CD8+T细胞增殖及杀伤能力明显强于PD-1单抗单药组和对照组（P<0.05）;凋亡明显低于另外两组（P<0.05）;PD-1+TIM-3单抗联合组血浆IL-2、IFN-γ及TNF-α动态水平也明显高于另外两组（P<0.05）。结论（1）DLBCL患者T细胞表达PD-1上调和血浆可溶性PD-1/PD-L1水平升高在DLBCL发病机制中发挥重要作用;上述指标与患者临床特征（病理亚型,IPI评分）及生存（OS/PFS）密切相关;患者血浆可溶性PD-1及PD-L1水平动态变化与其病情状态密切相关,可将其作为DLBCL病情监测的潜在生物标记物。（2）应用PD-1靶向阻断策略（PD-1单抗及PD-1基因敲减CD19 CAR-T细胞）治疗R/R DLBCL总体耐受性好,毒副反应较轻,但仅对部分患者有效;外显子基因捕获二代测序、寡核苷酸阵列芯片分析及免疫组化分析提示:患者肿瘤突变程度、肿瘤浸润T细胞数量和肿瘤微环境PD-L1表达等因素,与PD-1单抗疗效密切相关,提示上述指标有可能成为预测PD-1单抗疗效的潜在生物标记物;PD-1单抗治疗后,患者效应T细胞将诱导性上调TIM-3分子表达,这可能是PD-1单抗继发性耐药的机制之一。（3）BALB/c小鼠A20细胞淋巴瘤皮下模型中,PD-1单抗+TIM-3单抗联合组的疗效及生存明显优于PD-1单抗单药组和对照组,从而提示:PD-1单抗和TIM-3单抗联合应用能够发挥更强的抗肿瘤作用。免疫学机制研究进一步揭示:PD-1+TIM-3单抗联合可以抑制效应T细胞的TIM-3诱导性表达,并通过增强CD8+T细胞增殖及杀伤能力、抑制CD8+T细胞凋亡、上调多种因子表达（IL-2、IFN-γ及TNF-α）等机制,避免T细胞耗竭从而增强T细胞抗肿瘤效应。
李玲[9]（2020）在《良性应激抑制小鼠肝癌发展的机制研究及酪氨酸激酶家族功能演化的生物信息学分析》文中研究指明心理社会应激一直被认为能够影响肿瘤的发展,但良性心理应激是否以及如何影响肿瘤的进展及相关治疗仍是未知。在本研究中我们利用丰富环境模型模拟良性心理应激,探究抑制小鼠肝癌发展的作用机制。首先构建小鼠肝癌细胞系Hepa1-6和H22皮下移植瘤模型来评估环境良性应激对小鼠肝癌发展的作用。接着通过体内实验运用相关中和抗体耗竭小鼠体内CD8+T、CD4+T淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage,TAM）和骨髓来源的抑制性细胞（Myeloid-derived suppressor cells,MDSCs）,用CCL2中和抗体、β型肾上腺素受体（Beta adrenergic receptors,β-ARs）阻滞剂、6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine,6OHDA）和β-ARs激动剂来确认CCL2和β-ARs在良性应激抗肿瘤中的作用,并在体外实验用β-ARs激动剂处理人肝细胞/星状细胞类器官及小鼠肝癌细胞,最后联合PD-L1免疫疗法进行干预治疗。在我们的研究中发现环境良性应激可以抑制肝癌的发展,并能够重塑肿瘤组织中的免疫微环境（tumor microenvironment,TME）,具体为:肿瘤内部浸润的CD8+T数目升高,MDSCs和TAM等免疫抑制性细胞明显减少;同时降低血清、肿瘤组织和免疫抑制性细胞的CCL2水平。进一步研究发现,敲除肿瘤来源和宿主来源的CCL2可以解除良性应激介导的抗肿瘤作用,良性应激发挥抑瘤作用需要通过CCL2/CCR2通路信号传导。此外,良性应激适度升高了外周血中的去甲肾上腺素和肾上腺素水平,激活外周SNS/β-ARs,进而抑制CCL2的表达及重塑肿瘤组织的免疫微环境从而到达更好的免疫治疗。最后,我们发现良性应激可以增敏PD-L1的免疫治疗,并增加了肿瘤特异性T细胞的浸润和免疫应答。总体而言,我们确定环境良性应激可通过一种外周神经-内分泌-免疫途径:SNS/β-ARs-CCL2轴来发挥抗肿瘤作用。酪氨酸激酶（tyrosine kinases,TKs）家族参与的酪氨酸磷酸化信号转导是整个后生动物中为数不多的保守信号转导途径之一,主要涉及多细胞生物的调控过程,包括组织分化、生长发育、免疫应答、细胞粘附、运动和凋亡等。更为重要的是,TKs家族中的约半数成员的突变或过表达与肿瘤的发生进展相关。我们结合进化分析和数据挖掘对TKs家族的基序及结构域组成、多个后生物种进行系统发育分析并对ABL亚家族进行功能分化研究和运用公共数据库在泛癌中寻找突变位点及预后关系。分析发现TKs的系统发育位置与核心结构域序列是一致的,但亚家族间的结构复杂;结构域基序组成以及结构域组成的差异反映了TKs家族之间蛋白功能的多样性。在对31个后生动物的TKs进行系统发育分析后发现TKs家族的功能保守性及种系特异性扩张:在亚家族种类上倾向于进化保守,并发生种系特异性扩增;一些物种（如电鳗）在进化过程中可能通过创建具有不同结构的TK成员来实现TKs独特的多样化并与其特定的组织功能有关。通过对ABL亚家族进行功能分化和肿瘤数据挖掘分析发现两基因发生显着的I型功能分化,并分别对两基因预测了3个与功能分化相关的氨基酸位点。此外,我们分析ABL成员在泛癌中的突变情况,发现ABL1发生与血液系统肿瘤相关的融合突变,而ABL2突变则主要发生在实体瘤中;还发现ABL2的高表达与肾乳头状细胞癌患者的不良预后有关。本研究利用生物信息学的系统发育分析探究TKs的保守性与功能多样性,功能分化分析预测与功能分化有关的氨基酸位点,为寻找肿瘤药物设计、肿瘤相关的突变及预后靶标提供一定的理论依据。
向俊宇[10]（2020）在《肌细胞增强因子MEF2D在肝癌免疫逃逸中的作用和分子机制研究》文中指出肝癌是世界上最常见也是致死率最高的癌症类型之一,而现有的靶向治疗手段对其疗效甚微。肌细胞增强因子（myocyte enhancer factor 2,MEF2）作为一个被广泛研究的转录因子家族,其参与并调控肌肉和神经发育过程。值得一提的是,该家族成员中,MEF2D的蛋白结构特异性以及在肿瘤中的作用逐渐被人们关注。MEF2D作为转录因子,其蛋白结构的N端包含一个MADS/MEF2结构域,介导MEF2D自身的二聚化、MEF2D与DNA的结合以及与其他蛋白的相互作用,该结构域在MEF2家族各成员中具有保守性。而MEF2D蛋白的C端则包含多个转录激活结构域,且与MEF2家族其他成员有明显差异。MEF2D在以肝癌为主的多种肿瘤中高表达,并提示疾病的进展和不良预后。具体作用上,MEF2D可以促进肿瘤的生长、侵袭转移和血管化等过程,不仅调控肿瘤细胞自身生物学行为,也影响整个肿瘤微环境。由于炎症相关的发病机制,很多肝癌都具有免疫原性,反映为其微环境中有各种类型的免疫细胞浸润。其中一些免疫细胞,如效应性T细胞介导的抗肿瘤免疫反应可以抑制肝癌的进程。相反,肝癌也利用各种机制进行免疫逃逸。尽管有前期研究关注肝癌细胞MEF2D与肿瘤微环境的相互作用,但是研究中所采用的实验方法,例如体外细胞培养体系或免疫缺陷鼠移植瘤模型,并没有将免疫细胞纳入观察和考虑。此外,MEF2D蛋白的乙酰化修饰可以显着增强其DNA结合能力进而促进其下游多种靶基因的转录激活。包括乙酰基转移酶p300和去乙酰化酶HDAC3在内的多种酶可以调控MEF2D乙酰化。上述研究现状表明,MEF2D及其乙酰化调控机制在肝癌免疫微环境中的作用及定位有待明确。目前,阻断免疫检查点细胞程序性死亡受体1（programmed cell death 1,PD-1）及其配体PD-L1相互作用的免疫疗法在多种肿瘤治疗中被应用,并且展现出令人满意的疗效。但是大多数肝癌患者对该疗法不敏感。前期研究发现PD-1/PD-L1阻断疗法的疗效可能与肿瘤细胞表达PD-L1的水平有关。随后越来越多的证据表明,原本在肝癌细胞中沉默的PD-L1在多种因素的刺激下被激活表达,并促进肝癌免疫逃逸,这些因素包括干扰素γ（interferon gamma,IFNG）,细胞周期相关激酶抑制剂,乙型肝炎病毒以及癌基因MYC等。因此,明确肝癌细胞PD-L1表达的调控机制或上游信号通路,可能为提高靶向PD-L1/PD-1疗法的疗效提供理论和实验基础。PD-L1的表达调控涉及多种机制:细胞内PD-L1蛋白水平会受到蛋白转运机制和蛋白翻译后修饰机制的调控,也会受到基因转录和RNA稳定性调控机制的影响。肿瘤浸润的免疫细胞分泌的IFNG也可以诱导PD-L1表达:肿瘤细胞中IFNG信号通路被激活会显着上调IFN调节因子的表达,进而激活PD-L1基因CD274的转录。但无论是PD-L1的哪种调控机制,在肝癌中都尚未完全阐明。基于上述研究现状,我们试图通过这项研究明确MEF2D能否调控PD-L1等关键效应分子并影响肝癌的免疫逃逸过程,以期为肝癌的临床治疗提供新的策略。本研究的实验设计和结果如下:实验设计:利用流式细胞术分析20例新鲜肝癌组织中MEF2D的表达和免疫细胞浸润及活化情况。利用免疫组化技术观察和分析225例肝癌标本中MEF2D的表达,免疫细胞的浸润情况以及和预后相关性。构建MEF2D肝脏条件性敲除小鼠(MEF2DLPC-KO mice)并在SMMC-7721,Huh7,H22和Hepa1-6等多种人源和鼠源肝癌细胞系中敲除或敲低MEF2D,p300和/或sirtuin 7（SIRT7）等基因的表达,利用RNA测序,Western blot,双荧光素酶报告基因系统以及染色质免疫共沉淀技术在上述组织和细胞中分析基因的表达及调控机制。利用蛋白质免疫共沉淀技术和pull-down实验检测MEF2D乙酰化水平和蛋白之间的相互作用。构建同源野生型小鼠肝脏原位移植瘤模型,系统给予抗体阻断体内T细胞功能或系统给予PD-1单抗治疗,评估移植瘤生长情况和小鼠生存情况,免疫组化和流式细胞术检测瘤内浸润免疫细胞的数量和活化程度。本研究主要的实验结果如下:1.在临床肝癌表本中,我们发现MEF2D的表达与CD4+和CD8+T细胞浸润数量呈负相关,与PD-1阳性或TIM3阳性的CD8+T细胞数量呈现正相关。在H22细胞中敲除MEF2D显着抑制对应移植瘤在同源野生型小鼠,而非免疫缺陷小鼠或抗体抑制CD8+T细胞功能的小鼠体内的生长。同源野生型小鼠体内MEF2D缺失的移植瘤相比对照组,其瘤内浸润的T细胞数量和活化程度增加。2.敲除MEF2D导致肝癌细胞中PD-L1的表达降低。MEF2D可以直接与编码PD-L1蛋白的CD274基因启动子结合并激活基因转录。肝癌细胞中过表达乙酰基转移酶p300或敲除去乙酰化酶SIRT7,可以促进MEF2D的乙酰化进而增强其DNA结合能力和结合位点的组蛋白乙酰化,最终促进CD274基因转录。IFNG可以诱导肝癌细胞表达p300并促进其结合MEF2D,并抑制SIRT7和MEF2D的直接结合。IFNG通过MEF2D影响PD-L1的机制与已知的IRF1/9-PD-L1通路在肝癌细胞中相互独立发挥作用。当没有IFNG刺激肝癌细胞时,SIRT7和MEF2D持续结合并削弱MEF2D乙酰化和PD-L1的表达。3.敲除SIRT7显着抑制肝癌细胞自身增殖和免疫缺陷鼠中移植瘤的生长。但相比对照组,同源野生型小鼠中SIRT7缺失的移植瘤PD-L1表达增加,T细胞的浸润和活化程度降低。在此基础上使用PD-1单抗治疗可以明显抑制移植瘤的生长,延长荷瘤小鼠的生存时间。本研究主要的结论如下:1.敲除MEF2D可以通过促进CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫过程抑制肝癌的进展。2.在IFNG的作用下,MEF2D通过直接转录激活CD274基因,增强免疫检查点分子PD-L1的表达进而削弱T细胞介导的抗肿瘤免疫过程。3.乙酰基转移酶p300介导的MEF2D乙酰化过程在IFNG诱导肝癌细胞PD-L1表达的过程中发挥重要作用。4.在缺乏IFNG的情况下,去乙酰化酶SIRT7能直接结合并抑制MEF2D乙酰化,进而抑制肝癌细胞PD-L1的表达。5.SIRT7缺失导致的肝癌细胞免疫逃逸依赖MEF2D-PD-L1通路。6.抑制SIRT7联合PD-1单抗显着抑制肝癌的进展。综上所述,本研究发现肝癌细胞中MEF2D可以促进PD-L1的表达,并进一步抑制CD8+T介导的抗肿瘤免疫反应。当IFNG刺激肝癌细胞时,p300促进MEF2D乙酰化过程,进而促进MEF2D与CD274基因启动子区域结合并上调PD-L1表达。当没有IFNG刺激肝癌细胞时,SIRT7抑制MEF2D乙酰化和PD-L1的表达。由于SIRT7显着促进肝癌细胞自身增殖。因此,相比单一免疫检查点抑制剂,我们提出干预SIRT7联合PD-1/PD-L1单抗可能是更为有效的肝癌治疗策略。
二、重组可溶性PD-1免疫抑制性受体增强抗小鼠H22肝癌的免疫效应（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、重组可溶性PD-1免疫抑制性受体增强抗小鼠H22肝癌的免疫效应（论文提纲范文）
（1）IL-28B通过下调调节性T细胞抗肝癌的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 肝癌概况及其免疫治疗进展 |
| 1.1.1 肝癌概况 |
| 1.1.2 肝脏的免疫系统和HCC诱导的免疫耐受导致了疾病的进展 |
| 1.1.3 肝癌的免疫治疗 |
| 1.2 IL-28B的研究进展 |
| 1.2.1 IL-28B结构 |
| 1.2.2 IL-28B单核酸多态性 |
| 1.2.3 IL-28B信号转导 |
| 1.2.4 IL-28B及IL-28Rα表达 |
| 1.2.5 IL-28B抗感染作用 |
| 1.2.6 IL-28B免疫调节作用 |
| 1.2.7 IL-28B对Treg细胞的调节作用 |
| 1.2.8 IL-28B对肿瘤生长的影响及机制 |
| 1.3 Treg细胞的研究进展 |
| 1.3.1 Treg细胞的发育 |
| 1.3.2 Treg细胞的抑制机制 |
| 1.3.3 Treg细胞成为肿瘤免疫治疗的潜在靶点 |
| 1.3.4 Treg细胞对TME的影响 |
| 1.3.5 TME中Treg细胞富集的机制 |
| 1.3.6 Treg细胞抑制肿瘤免疫的机制 |
| 1.4 本课题立项依据 |
| 1.5 技术路线图 |
| 第二章 重组腺病毒rAd-mIL-28B的制备及体外抑制肿瘤细胞生长的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 验证重组腺病毒rAd-mIL-28B |
| 2.3.2 TCID50法检测腺病毒滴度 |
| 2.3.3 IL-28B体外对TC-1细胞生长的作用 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 rAd-mIL-28B抗肝癌效应及免疫机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料和仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤体积的影响 |
| 3.3.2 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠瘤重的影响 |
| 3.3.3 肝癌组织HE染色后细胞形态改变 |
| 3.3.4 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏、肺脏、肝脏及胸腺重量的影响 |
| 3.3.5 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏、肺脏、肝脏及胸腺脏器指数的影响 |
| 3.3.6 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏T细胞亚群的影响 |
| 3.3.7 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 3.3.8 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠脾脏PD-1~+T细胞的影响 |
| 3.3.9 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织T细胞亚群的影响 |
| 3.3.10 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 3.3.11 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织PD-1~+T细胞的影响 |
| 3.3.12 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 3.3.13 rAd-mIL-28B对H22荷瘤小鼠肿瘤组织细胞因子的影响 |
| 3.3.14 rAd-mIL-28B在H22荷瘤小鼠血清和肿瘤组织中细胞因子的差异表达 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 IL-28B对调节性T细胞分化的体外研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料和仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 体外脾脏Treg细胞不同时间CD4、CD25和Foxp3分子表达情况 |
| 4.3.2 IL-28B体外抑制i Treg细胞生成的研究 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 rAd-mIL-28B联合生物碱对肝癌抑制作用实验研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 实验材料和仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤体积变化的影响 |
| 5.3.2 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤重量变化的影响 |
| 5.3.3 HE染色观察肝癌组织细胞形态 |
| 5.3.4 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏T细胞亚群的影响 |
| 5.3.5 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 5.3.6 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠脾脏PD1~+T细胞的影响 |
| 5.3.7 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织T细胞亚群的影响 |
| 5.3.8 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织CD4~+Foxp3~+Treg细胞的影响 |
| 5.3.9 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠肿瘤组织PD-1~+T细胞的影响 |
| 5.3.10 rAd-mIL-28B联合E2-a对H22荷瘤小鼠血清细胞因子的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 主要结论 |
| 6.2 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）CA4纳米粒子联合DC101协同抗PD-1抗体增强肝癌治疗疗效及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝癌的流行病学和致病因素 |
| 1.1.1 肝癌的流行病学 |
| 1.1.2 肝癌的致病因素 |
| 1.2 肝癌的治疗 |
| 1.2.1 肝切除 |
| 1.2.2 肝移植 |
| 1.2.3 化疗治疗 |
| 1.2.4 放射治疗 |
| 1.2.5 消融治疗 |
| 1.2.6 靶向药物治疗 |
| 1.2.7 经肝动脉介入治疗 |
| 1.2.8 免疫治疗 |
| 1.3 抗肿瘤纳米药 |
| 1.3.1 纳米药的特点 |
| 1.3.2 纳米药的作用机制 |
| 1.3.3 纳米药的分类 |
| 1.3.4 血管阻断剂纳米药在肿瘤治疗方面的应用 |
| 1.4 肿瘤血管的正常化 |
| 1.4.1 血管的生成 |
| 1.4.2 VEGF/VEGFR2信号途径介导肿瘤血管生成 |
| 1.4.3 肿瘤血管正常化理论 |
| 1.5 本论文的设计思路 |
| 第2章 CA4-NPs对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷的影响 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 CA4-NPs药物 |
| 2.2.4 主要实验试剂 |
| 2.2.5 主要实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞的复苏、传代及冻存 |
| 2.3.2 动物模型的建立 |
| 2.3.3 肿瘤体积的测量与计算 |
| 2.3.4 肿瘤负荷的评估 |
| 2.3.5 免疫组织化学染色 |
| 2.3.6 苏木精-伊红染色 |
| 2.3.7 酶联免疫吸附试验 |
| 2.3.8 统计学分析方法 |
| 2.4 实验结果与讨论 |
| 2.4.1 CA4-NPs对肝癌血管的作用 |
| 2.4.2 CA4-NPs对肝癌细胞增殖的影响 |
| 2.4.3 CA4-NPs对H22荷瘤小鼠肿瘤组织形态的影响 |
| 2.4.4 CA4-NPs对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷的影响 |
| 2.4.5 CA4-NPs治疗后肝癌组织内VEGF的表达 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 DC101对肝癌组织内CD8~+T细胞数量的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 细胞系与实验动物 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 主要实验仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 细胞的复苏、传代 |
| 3.3.2 动物模型的建立 |
| 3.3.3 肿瘤体积的测量与计算 |
| 3.3.4 肿瘤负荷的评估 |
| 3.3.5 肿瘤血管周细胞包被的评估 |
| 3.3.6 FITC标记的番茄凝集素肿瘤血管灌注实验 |
| 3.3.7 Hoechst33342肿瘤血管灌注实验 |
| 3.3.8 缺氧评估实验 |
| 3.3.9 流式细胞术检测 |
| 3.3.10 IHC染色 |
| 3.3.11 统计学分析 |
| 3.4 实验结果与讨论 |
| 3.4.1 DC101对肝癌血管周细胞包被、肿瘤血管灌注及肿瘤缺氧的影响 |
| 3.4.2 DC101对H22 荷瘤小鼠肿瘤内CD8~+T细胞数量的影响 |
| 3.4.3 DC101对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷的影响 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 CA4-NPs+DC101对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷和肿瘤内CD8~+T细胞数量的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 细胞系与实验动物 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞的复苏、传代 |
| 4.3.2 动物模型的建立 |
| 4.3.3 肿瘤体积的测量与计算 |
| 4.3.4 肿瘤负荷的评估 |
| 4.3.5 IHC染色 |
| 4.3.6 H&E染色 |
| 4.3.7 肝癌血管周细胞包被的评估 |
| 4.3.8 FITC标记的番茄凝集素肝癌血管灌注实验 |
| 4.3.9 Hoechst33342 血管灌注实验 |
| 4.3.10 缺氧评估实验 |
| 4.3.11 流式细胞术检测 |
| 4.3.12 统计学分析 |
| 4.4 实验结果与讨论 |
| 4.4.1 CA4-NPs+DC101对H22荷瘤小鼠肿瘤负荷的影响 |
| 4.4.2 CA4-NPs+DC101对肝癌组织内CD8~+T细胞数量的影响 |
| 4.4.3 CA4-NPs+DC101治疗后肝癌PD-L1的表达 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 CA4-NPs联合DC101协同抗PD-1抗体治疗肝癌疗效评估 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 细胞系与实验动物 |
| 5.2.2 主要实验试剂 |
| 5.2.3 主要实验仪器 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 细胞的复苏、传代 |
| 5.3.2 动物模型的建立 |
| 5.3.3 肿瘤体积的测量与计算 |
| 5.3.4 抑瘤实验 |
| 5.3.5 IHC染色 |
| 5.3.6 H&E染色 |
| 5.3.7 ALT、BUN及CREA水平检测 |
| 5.3.8 流式细胞术 |
| 5.3.9 ELISA |
| 5.3.10 统计学分析 |
| 5.4 实验结果与讨论 |
| 5.4.1 CA4-NPs+DC101+anti-PD-1对肝癌皮下移植瘤的肿瘤抑制结果 |
| 5.4.2 CA4-NPs+DC101 anti-PD-1对肝癌细胞增殖和肿瘤组织形态的影响 |
| 5.4.3 CA4-NPs+DC101+anti-PD-1对肝癌组织内CD8~+T细胞数量的影响 |
| 5.4.4 CA4-NPs+ DC101+ anti-PD-1三药联合系统毒性 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论 |
| 创新性 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（3）NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 NLRP3炎症小体介导的免疫抑制在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的作用和机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第二部分 γδT17和MDSCs在胃MALT淋巴瘤微环境免疫稳态失衡中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 附表 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 炎症、肿瘤和免疫: 微环境中的密切交流 |
| 一、肿瘤中炎症的类型 |
| 二、炎症与肿瘤的发生发展 |
| 三、炎症反应的关键信号通路与肿瘤 |
| 四、炎症和肿瘤免疫 |
| 五、靶向炎症反应和肿瘤治疗 |
| 六、总结和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论着 |
（4）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 纳秒脉冲消融小鼠肝癌免疫学效应研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 纳秒脉冲消融小鼠肝癌免疫相关差异表达蛋白的筛选 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 差异蛋白LXN、GRN、TGF-β1、ELNE与免疫细胞的相关性分析 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 纳秒脉冲消融在肿瘤治疗中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 新疆医科大学博士研究生学位论文 导师评阅表 |
（6）表达CD155胞外区的重组溶瘤痘苗病毒治疗恶性肿瘤的临床前研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表ABBREVIATIONS |
| 第一章 绪论 |
| 1.全球癌症发病情况 |
| 2.肿瘤免疫治疗 |
| 3.溶瘤免疫治疗 |
| 4.CD155/TIGIT/CD226 |
| 5.溶瘤免疫疗法联合免疫检查点阻断疗法 |
| 参考文献 |
| 第二章 重组溶瘤痘苗病毒的包装 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料与仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 质粒的设计、构建和酶切鉴定 |
| 3.2 质粒与野生型痘苗病毒的同源重组 |
| 3.3 重组病毒的筛选 |
| 3.4 重组病毒的鉴定 |
| 3.5 重组病毒的扩增与纯化 |
| 4.本章讨论 |
| 5.参考文献 |
| 第三章 重组溶瘤痘苗病毒VV-SCD155抗肿瘤作用的研究 |
| 1.引言 |
| 2.实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料和仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 重组溶瘤痘苗病毒VV-sCD155蛋白的表达、复制和溶瘤 |
| 3.2 重组溶瘤痘苗病毒VV-s CD155在H22 肝癌腹水瘤中招募及活化免疫细胞的作用 |
| 3.3 重组溶瘤痘苗病毒VV-s CD155在4T1 乳腺癌中的抗肿瘤作用 |
| 3.4 重组溶瘤痘苗病毒VV-s CD155在CT26 结肠癌中的抗肿瘤作用 |
| 3.5 重组溶瘤痘苗病毒VV-s CD155在MC38 结肠癌中的抗肿瘤作用 |
| 小结与讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 攻读硕士期间已发表和待发表文章 |
| 致谢 |
（7）肿瘤特异激活的CD47纳米抗体的制备及性质分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1 免疫阻断疗法的兴起 |
| 2 SIRPα-CD47 免疫检查点 |
| 3 临床实验中的SIRPα-CD47 阻断抗体 |
| 3.1 天境生物-TJC4 |
| 3.2 信达生物-IBI188 |
| 3.3 恒瑞医药-SHR-1603 |
| 3.4 Forty Seven-Hu5F9 |
| 3.5 Arch Oncology-AO-176 |
| 3.6 Surface Oncology-SRF231 |
| 3.7 宜明昂科-IMM0306 |
| 4 SIRPα-CD47 阻断抗体的研发策略 |
| 5 CD47-SIRPα阻断药物应用前景及限制 |
| 6 本研究的目的及意义 |
| 第2章 CD47纳米抗体前抗体的制备 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验菌种及质粒 |
| 2.2 酶、主要试剂 |
| 2.3 培养基及溶液配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 pET22b-CERX-3C1 序列设计及合成 |
| 3.2 pET22b-CERX-3C1、p ET22b-3C1 质粒转化BL21 感受态细胞及鉴定 |
| 3.3 pMECS-CERX-3D3-2 载体的构建 |
| 3.4 CD47纳米抗体前抗体的诱导表达 |
| 3.5 Western检测CD47 纳米抗体前抗体 |
| 3.6 CD47纳米抗体前抗体的大量诱导表达 |
| 3.7 CD47纳米抗体前抗体的纯化 |
| 3.8 ELISA检测CD47 纳米抗体前抗体与CD47 蛋白的结合能力 |
| 3.9 细胞ELISA检测CD47 纳米抗体前抗体与Ec9706 细胞的结合 |
| 3.10 流式细胞术检测CD47纳米抗体前抗体与Ec9706细胞的结合 |
| 统计学方法 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 CD47纳米抗体前抗体的分子设计 |
| 4.2 pET22b-CERX-3C1、p ET22b-3C1 质粒转化后转化子的鉴定 |
| 4.3 pMECS-CERX-3D3-2 载体的构建及转化子鉴定 |
| 4.4 CD47纳米抗体前抗体的表达及检测 |
| 4.5 CD47纳米抗体前抗体的大量表达与纯化 |
| 4.6 ELISA检测CD47 纳米抗体前抗体与CD47 蛋白的结合能力 |
| 4.7 细胞ELISA检测CD47 纳米抗体前抗体与Ec9706 细胞的结合 |
| 4.8 流式细胞术检测CD47纳米抗体前抗体与Ec9706细胞的结合 |
| 5 讨论 |
| 第3章 肿瘤组织对CD47纳米抗体前抗体的特异激活 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物及主要试剂 |
| 2.2 溶液配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 Western Blot检测肿瘤细胞中MMP-2,MMP-9 的表达 |
| 3.2 肿瘤组织匀浆液中MMP-2,MMP-9 总的酶活力测定 |
| 3.3 胶原酶对CD47纳米抗体前抗体连接肽的水解 |
| 3.4 肿瘤组织匀浆液对CD47纳米抗体前抗体连接肽的水解 |
| 4 结果 |
| 4.1 Western Blot检测肿瘤细胞中MMP-2,MMP-9 的表达 |
| 4.2 肿瘤组织匀浆液中MMP-2,MMP-9 总的酶活力测定 |
| 4.3 胶原酶对CD47纳米抗体前抗体连接肽的水解 |
| 4.4 肿瘤组织匀浆液对CD47纳米抗体前抗体连接肽的水解 |
| 5 讨论 |
| 第4章 肿瘤特异激活的抗CD47纳米抗体对巨噬细胞促吞噬作用和毒性分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 培养基及溶液配制 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 水解前后3C1前抗体与抗原CD47的结合 |
| 3.2 水解前后3C1前抗体与细胞的结合 |
| 3.3 水解前后3C1 前抗体对SIRPα的阻断作用 |
| 3.4 B6H12对水解前后3C1前抗体结合Ec9706的阻断作用 |
| 3.5 水解前后3C1前抗体对红细胞的凝集作用 |
| 3.6 水解前后3C1前抗体在补体存在条件下对红细胞的溶血作用 |
| 3.7 原代培养巨噬细胞的获得和鉴定 |
| 3.8 台盼蓝染色鉴定细胞活力 |
| 3.9 CFSE标记肿瘤细胞 |
| 3.10 巨噬细胞吞噬能力检测 |
| 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 水解前后3C1前抗体与CD47蛋白的结合能力 |
| 4.2 细胞ELISA检测水解前后3C1 前抗体与Ec9706 细胞的结合 |
| 4.3 流式细胞术检测水解前后3C1前抗体与肿瘤细胞的结合活性 |
| 4.4 水解前后3C1 前抗体对SIRPα的阻断作用 |
| 4.5 B6H12对水解前后3C1前抗体结合Ec9706的阻断作用 |
| 4.6 水解前后3C1前抗体体外对人红细胞的凝集作用 |
| 4.7 水解前后3C1前抗体体外对人红细胞的溶血作用 |
| 4.8 巨噬细胞的获得和鉴定 |
| 4.9 巨噬细胞吞噬活力检测 |
| 5 讨论 |
| 结论和展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 参与课题 |
| 发表文章 |
（8）PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达以及血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| 一、外周血和淋巴结中T细胞PD-1表达对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、血浆中可溶性PD-1和PD-L1水平动态变化对弥漫大B细胞淋巴瘤患者预后影响的分析研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第二部分 PD-1阻断策略临床应用于难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| 一、PD-1单抗临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及其预后生物标记物和耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、PD-1基因敲减的CAR-CD19T细胞临床应用难治/复发弥漫大B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析及耐药机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 第三部分 小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察及机制研究 |
| 一、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的疗效观察 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 二、小鼠模型中PD-1及TIM-3单抗联合干预的机制研究 |
| (一)材料和仪器 |
| (二)实验方法 |
| (三)实验结果 |
| (四)讨论 |
| (五)小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 淋巴瘤免疫治疗的现状及展望 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（9）良性应激抑制小鼠肝癌发展的机制研究及酪氨酸激酶家族功能演化的生物信息学分析（论文提纲范文）
| 摘要 Ⅰ |
| ABSTRACTⅠ |
| 摘要 Ⅱ |
| ABSTRACTⅡ |
| 英文缩写说明 |
| 第一部分 良性应激重塑免疫微环境抑制小鼠肝癌的发展 |
| 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 研究内容 |
| 第一章 实验材料及方法 |
| 2.1 主要仪器和化学试剂 |
| 2.2 细胞系及培养 |
| 2.3 实验动物及相关模型构建 |
| 2.4 实验方法及指标检测 |
| 2.5 统计分析 |
| 第二章 实验结果 |
| 3.1 良性应激能够抑制小鼠肝癌的发展 |
| 3.2 良性应激改善小鼠肝癌肿瘤组织的免疫微环境 |
| 3.3 良性应激的抑瘤作用需要通过CCL2/CCR2 通路信号传导 |
| 3.4 良性应激通过增强β-ARs抑制肿瘤发展 |
| 3.5 良性应激激活β-AR信号抑制CCL2 在肿瘤和免疫细胞的表达 |
| 3.6 良性应激增敏PD-L1 免疫治疗 |
| 第三章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.2 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 酪氨酸激酶家族功能演化的生物信息学分析 |
| 第一章 绪论 |
| 第二章 相关理论及技术方法 |
| 2.1 分析网站软件及说明 |
| 2.2 TKs序列收集及构建系统发育树 |
| 2.3 TKs保守序列基序及结构域组成分析 |
| 2.4 TKs系统发育分析 |
| 2.5 ABL家族功能分化和肿瘤相关分析 |
| 第三章 分析结果 |
| 3.1 人类TK基因家族系统发育分析 |
| 3.2 TK基因家族功能保守及特异性扩张 |
| 3.3 案例研究:ABL基因家族的功能分化及其肿瘤数据库的信息挖掘 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 研究生期间科研成果 |
（10）肌细胞增强因子MEF2D在肝癌免疫逃逸中的作用和分子机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 肝癌细胞MEF2D通过抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫促进肿瘤生长 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.2.3.1 细胞培养与基因敲除单克隆细胞系制备 |
| 2.2.3.2 免疫组化技术分析临床肝癌标本 |
| 2.2.3.3 肝癌组织制备单细胞和流式分析 |
| 2.2.3.4 构建T细胞耗竭的同源野生型小鼠肝脏原位移植瘤模型 |
| 2.2.3.5 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 干扰MEF2D表达可显着抑制肝癌细胞原位移植瘤在同源野生型小鼠体内的生长 |
| 2.3.2 临床肝癌样本中的肿瘤细胞MEF2D表达与T细胞瘤内浸润负相关,与CD8~+T细胞耗竭正相关 |
| 2.3.3 敲除MEF2D抑制肝癌细胞移植瘤生长的过程依赖CD8~+T细胞 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 MEF2D激活PD-L1 基因转录促进肝癌免疫逃逸 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验方法 |
| 3.2.3.1 q RT-PCR实验 |
| 3.2.3.2 染色质免疫共沉淀(ChIP/re-ChIP)实验 |
| 3.2.3.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3.2.3.4 Western blot实验 |
| 3.2.3.5 PD-1蛋白与细胞结合实验 |
| 3.2.3.6 基于肝癌细胞和T细胞共培养体系下的杀伤实验 |
| 3.2.3.7 流式细胞术检测细胞凋亡实验(Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒) |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 敲除MEF2D抑制免疫检查点分子PD-L1在肝癌细胞中的表达 |
| 3.3.2 MEF2D直接结合CD274基因启动子并激活其转录 |
| 3.3.3 MEF2D参与IFNG诱导肝癌细胞PD-L1表达的过程 |
| 3.3.4 肝癌细胞MEF2D通过PD-L1抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 IFNG刺激条件下p300通过促进MEF2D乙酰化上调PD-L1表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 实验方法 |
| 4.2.3.1 蛋白质免疫共沉淀实验 |
| 4.2.3.2 His或GST标签pull-down实验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 肝癌细胞p300缺失抑制IFNG诱导的MEF2D乙酰化和PD-L1表达 |
| 4.3.2 p300结合MEF2D并促进其及CD274基因启动子组蛋白乙酰化 |
| 4.3.3 p300通过MEF2D的多赖氨酸位点促进其乙酰化及PD-L1表达 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 SIRT7通过抑制MEF2D乙酰化和PD-L1表达影响肝癌免疫逃逸 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 实验方法 |
| 5.2.3.1 共培养体系中T细胞胞内细胞因子流式检测 |
| 5.2.3.2 共培养体系中T细胞胞外分泌细胞因子ELISA检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 SIRT7 直接结合MEF2D并抑制其乙酰化 |
| 5.3.2 IFNG缺乏条件下,SIRT7 通过MEF2D抑制肝癌细胞PD-L1表达 |
| 5.3.3 SIRT7 缺失的肝癌细胞通过MEF2D-PD-L1通路抑制T细胞介导的抗肿瘤免疫 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 敲除SIRT7联合PD-1单抗可以抑制肝癌细胞移植瘤的生长 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要仪器 |
| 6.2.3 实验方法 |
| 6.2.3.1 构建用PD-1单抗治疗的同源野生型小鼠肝脏原位移植瘤模型 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 免疫检查点抑制剂在原发性肝癌治疗中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
四、重组可溶性PD-1免疫抑制性受体增强抗小鼠H22肝癌的免疫效应（论文参考文献）
- [1]IL-28B通过下调调节性T细胞抗肝癌的机制研究[D]. 李志. 兰州大学, 2021
- [2]CA4纳米粒子联合DC101协同抗PD-1抗体增强肝癌治疗疗效及机制研究[D]. 鲍欣. 吉林大学, 2021(01)
- [3]NLRP3炎症小体及γδT17/MDSCs在淋巴瘤免疫稳态失衡中的作用及机制研究[D]. 赵亚楠. 山东大学, 2021(11)
- [4]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [5]纳秒脉冲消融治疗肝细胞肝癌的免疫学效应及其作用机制研究[D]. 买为丽旦·衣明江. 新疆医科大学, 2021(08)
- [6]表达CD155胞外区的重组溶瘤痘苗病毒治疗恶性肿瘤的临床前研究[D]. 陈安仙. 南京大学, 2020(04)
- [7]肿瘤特异激活的CD47纳米抗体的制备及性质分析[D]. 张琪. 新疆大学, 2020(07)
- [8]PD-1和TIM-3在耗竭T细胞介导B系淋巴瘤免疫逃逸中的作用机制及临床应用研究[D]. 陈晓晨. 苏州大学, 2020(06)
- [9]良性应激抑制小鼠肝癌发展的机制研究及酪氨酸激酶家族功能演化的生物信息学分析[D]. 李玲. 上海交通大学, 2020
- [10]肌细胞增强因子MEF2D在肝癌免疫逃逸中的作用和分子机制研究[D]. 向俊宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020
标签：肿瘤论文; 淋巴瘤论文; pd-1论文; 免疫抑制论文; 弥漫大b细胞淋巴瘤论文;