一、工业化生产L-门冬酰胺酶发酵条件的研究（论文文献综述）
辛世华,韩小珍,贺晓光[1]（2021）在《食品中γ-谷氨酰肽的研究进展》文中提出谷氨酰肽是指含有γ-谷氨酰残基,能够激活人体钙敏感受体的一类小分子肽。γ-谷氨酰肽在自然界中广泛分布,其本身没有味道或者味道较淡,但添加少量即可增强味道的浓厚感,其凭借这一显着的呈味特性而受到广泛关注。该文对γ-谷氨酰肽的结构特征、呈味机制、制备方法及检测方法进行了综述,以期为γ-谷氨酰肽的深入研究和新型增味产品的研发提供理论参考。
朱曼迟[2]（2021）在《Rhizomucor miehei来源L-天冬酰胺酶的克隆表达及分子改造研究》文中研究指明L-天冬酰胺酶（L-asparaginate amidohydrolase,EC 3.5.1.1）能够水解L-天冬酰胺生成L-天冬氨酸和氨,广泛存在于微生物、植物和部分啮齿类动物的血清中。在医药行业中,可用于治疗急性淋巴细胞白血病、霍奇金淋巴瘤和淋巴系统恶性肿瘤等多种疾病,在食品行业中,可用于高温油炸食品中,减少致癌物质丙烯酰胺的生成。本研究通过构建酶活及热稳定性显着提高的L-天冬酰胺酶突变体,并通过5′非翻译区（UTR）改造以及培养基优化,实现L-天冬酰胺酶的高产发酵。主要研究结果如下:（1）将米黑根毛霉Rhizomucor miehei来源的L-天冬酰胺酶（Rm Asnase）编码基因连接到载体p ET28a上,导入大肠杆菌进行表达,经破碎纯化后测得其比酶活为509.1 U·mg-1。对其进行酶学性质研究,其最适温度为45°C,最适p H为7.0,在30°C条件下较为稳定,在45°C条件下稳定性较差,在p H 6.0-7.0范围内表现出良好的稳定性。所考察的金属离子中没有对该酶有明显激活作用的离子。（2）针对Rm Asnase酶活力不高,在45°C条件下热稳定性较差的缺点进行分子改造。基于序列比对及Fold X算法,选取了15个位点进行定点突变,共获得1株酶活显着提高以及2株热稳定性显着提高的突变株。突变体A344E、S302I、S302M比酶活分别比突变前提高了54.5%、32.0%、27.7%。研究野生酶与突变酶的酶学性质差异,突变酶A344E的最适温度为40℃,S302I、S302M的最适温度为50°C。将突变酶及野生酶在45℃放置35 h后,野生酶的残余酶活仅为10%左右,而S302I和S302M的残余酶活仍保留了50%以上。（3）根据单点突变结果,选取正向突变株A344E、S302I、S302M进行组合突变,得到2个组合突变体A344E/S302I、A344E/S302M,突变株A344E/S302I、A344E/S302M的比酶活较野生酶分别提高了43.8%和39.2%。对组合突变体进行酶学性质研究,结果显示,A344E/S302I、A344E/S302M的最适温度为50°C,在45°C下的热稳定性均好于野生酶,在45°C放置35 h后,组合突变株仍保留了60%以上的酶活,野生酶仅剩10%左右的酶活,最适p H及p H稳定性较野生酶无显着的变化。（4）以食品安全菌株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.168为宿主,构建B.subtilis168/p MA5-A344E/S302I。利用5′非翻译区（UTR）改造策略提高米黑根毛酶来源的L-天冬酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的表达量。经UTR改造后,L-天冬酰胺酶粗酶活由野生的2.1U·m L-1提高到13.3 U·m L-1。通过发酵培养基优化以及5 L罐放大实验,重组菌B.subtilis168/p MA5 UTR-A344E/S302I的酶活产量达到521.9 U·m L-1,为L-天冬酰胺酶的安全工业化生产提供了一种新策略。
康雪梅[3]（2020）在《立体选择性酰胺酶的筛选、改造及其在L-草铵膦合成中的应用》文中指出酰胺酶即酰胺水解酶,是一种能断裂非肽键型酰胺键的一种水解酶。酰胺酶具有较高的催化活性、严格的立体选择性和广泛的底物谱等特性,使得越来越多的研究集中于酰胺酶在手性农药、手性药物和手性氨基酸的合成中。L-草铵膦（L-PPT）是在吸水链霉菌中发现的一种天然产生的L型的含磷氨基酸,同时也是一种对环境无害的广谱型、触杀型、灭生性除草剂,具有重要的应用前景。与传统的化学法合成草铵膦相比,通过酰胺酶催化合成L-草铵膦的方法具有立体选择性好、反应条件温和、转化率高、后续分离纯化操作简便、环境友好等优势。本文通过产酶微生物菌株的筛选和酰胺酶基因挖掘等手段获得了具有较高活力的立体选择性的酰胺酶,并将其在枯草芽孢杆菌中实现了分泌表达,研究了其酶学性质,并通过定向进化的方法对其酰胺酶活力进行了改造,应用于L-草铵膦的合成中。主要研究内容如下:（1）立体选择性酰胺酶酶库的构建。建立了一个快速、高效、灵敏的高通量筛选方法用于催化生产草铵膦的相关产酶微生物及生物酶的筛选,运用此方法从土壤中筛选到了十株产酰胺酶的新菌株,其中有两株菌株具有产高活力、高立体选择性酰胺酶的能力:Kluyvera cryocrescens ZJB-17005和Leclercia adecarboxylata ZJB-17008。利用基因组狩猎及数据库挖掘技术获得了35个酰胺酶,构建了酰胺酶酶库。并从中筛选获得3株酰胺酶Kc-Ami、La-Ami和Bm-Ami均具有较高的催化活性和立体选择性。（2）建立了一个高效的枯草芽孢杆菌分泌表达体系用于酰胺酶的分泌表达。以Bm-Ami为报告基因,运用启动子工程技术成功从33个内源性的组成型启动子中筛选到6个启动酰胺酶表达的强度大于Pcdd的启动子,分别为PlytR、PspoVG、PaprE、PyvyD、PftsH、PamyE,其中PamyE作为启动子的酰胺酶具有最高的表达活力,是Pcdd的1.46倍。通过双启动子表达载体的构建与筛选,成功得到的双启动子PamyE-cdd具有最高的启动酰胺酶表达的强度,使分泌的活性重组酰胺酶的酶活升高为原始的2.63倍。同时,通过高分泌性能信号肽筛选,获得高分泌性能的信号肽Pac,成功构建高活力的枯草芽孢杆菌分泌表达体系,使Bm-Ami、Kc-Ami、La-Ami外分泌活性酰胺酶的活力分别提高到原始的3.58、3.02和3.12倍。（3）对Bm-Ami、Kc-Ami、La-Ami进行了分离纯化和酶学性质研究,得知Bm-Ami、Kc-Ami、La-Ami皆为异质二聚体,α和β亚基大小分别为:26和61 kDa、24和64 kDa、26和62 kDa,都属于N-端丝氨酸亲核水解酶家族的酰胺酶,三酶总体同源性较低,但都具有N端Serβ1与相关的氨基酸Alaβ69,Asnβ241（Bm-Ami为β244）,Glnβ23,Argβ263（Bm-Ami为β266）。酰胺酶Kc-Ami、La-Ami、Bm-Ami的最适pH均为8.5,最佳的缓冲液为Tris-HCl;最佳的温度分别55?C、50?C、55?C;50?C时,La-Ami、Kc-Ami、Bm-Ami的半衰期分别为19.8 h、59.1 h、47.6 h。动力学参数分析显示,Bm-Ami的催化效率最高,分别为La-Ami和Kc-Ami的2.24和1.72倍。同时通过底物谱分析与催化机制分析表明La-Ami、Kc-Ami、Bm-Ami均可应用于手性氨基酸合成。（5）利用同源建模及活性口袋预测分析的方法,通过突变文库的构建筛选及组合突变等方式,获得了活力提高的菌株,其中最优突变株mut-Rβ381F/Yβ382F的活力提高到原始野生型Bm-Ami的204%。将原始野生型（Bm-Ami）及相应的突变型酰胺酶分别进行表达和纯化,分别测定这些酰胺酶在催化rac-S合成L-草铵膦过程中的动力学参数。结果显示活力提高的菌株,催化效率相较于野生型都有所提高,其中最优突变株mut-Rβ381F/Yβ382F的催化效率是原始野生型Bm-Ami的2.84倍。利用同源建模和分子对接的方法分析了双突变株mut-Rβ381F/Yβ382F与原始野生型Bm-Ami结构上的差异,结果表明突变后的mut-Rβ381F/Yβ382F使底物羰基更靠近催化残基,缩短了作用距离,同时突变后氨基酸使活性口袋与底物侧链识别处变大,更利于底物的进入和产物的释放,因而更易于反应发生。（6）选用立体选择性酰胺酶Bm-Ami的最优突变体mut-Rβ381F/Yβ382F为生物催化剂,对催化rac-4-[羟基（甲基）膦酰基]-2-（2-苯乙酰基）-丁酸（rac-S）合成L-草铵膦的催化条件进行了研究。催化反应的最适pH为9.0（氨水调节）,最适温度为55?C,酰胺酶的添加量为15μg mL-1(753.3 U L-1)。最适反应条件下底物浓度为500 mM时,反应2 h,转化率到达49.2%,e.e.值达到99.9%,时空产率584.52 g L-1 d-1。底物浓度为600 mM时反应受到抑制,转化率降低。对酶催化反应合成草铵膦的反应液经过预处理、离子交换树脂分离、重结晶分离后得到了L-PPT的纯度为99%,e.e.值为99.9%,收率为90%。同时对D-4-[羟基（甲基）膦酰基]-2-（2-苯乙酰基）-丁酸（D-S）进行了消旋化处理,消旋化后得到的rac-S可进一步用于酶催化反应。
卢晓红[4]（2019）在《巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的定向进化》文中认为L-天冬酰胺酶能够特异性催化L-天冬酰胺水解脱氨基生成L-天冬氨酸和氨,广泛存在于动物、植物和微生物中。L-天冬酸胺酶在医学方面可用于临床诊治急性淋巴细胞白血病,对霍奇金淋巴瘤、黑素肉瘤、乳腺癌和胰腺癌等有很好治疗效果。另外,L-天冬酰胺酶在食品工业方面可作为食品添加剂减少高温加工食品如烘焙和煎炸等食品中致癌物质丙稀酰胺的生成,且不易对生产工序、成品外貌、口味和营养等方面产生较大影响。但天然L-天冬酰胺酶存在酶催化活性低、稳定性差等缺陷,局限了其在食品安全和医疗中的广泛应用。因此,基于酶分子改造技术来获得拥有优良性质的L-天冬酰胺酶则具有深远意义。本文主要针对以上问题,首先对来源于巨大芽孢杆菌H-1的L-天冬酰胺酶ansA基因进行了克隆和在大肠杆菌中的异源表达,对重组酶开展酶学性质初步研究。其次,通过定向进化技术和高通量筛选得到酶活和稳定性同时改善的L-天冬酰胺酶突变体。最后,将巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的野生酶和突变酶应用于热加工食品炸薯片中,降低了薯片中丙烯酰胺的生成量,为L-天冬酰胺酶的食品应用提供理论依据。本研究结果分述如下。1.巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型基因的克隆表达及其酶学性质研究。根据Genbank中B.megate riumWSH-002的全基因组序列成功扩增得到L-天冬酰胺酶ansA基因（993 bp）,其编码330个氨基酸。构建重组表达载体pET-30a-BBMansA,在Escherichia coli BL21（DE3）中异源表达,重组酶酶活为1.02±0.16 IU/mL。Ni柱纯化后,重组酶的酶学性质表明,其比活力为55.66 IU/mg;最适催化反应条件为pH 8.0,30 ℃;在pH 6.0-11.0环境下处理12 h后有高于80%的残余酶活;40℃孵育1 h后仍保留60%以上残余酶活;动力学研究中米氏常数Km值为28.63 mM,最大反应速度Vmax为0.61 IU/mL。2.巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的易错PCR和DNA shuffling研究。易错PCR反应体系中dCTP/dTTP、Mg2+和Mn2+的终浓度分别为1.0、7.0、0.3 mM。经2轮易错PCR和2轮DNA shuffling结合,通过高通量筛选从约14200个克隆子的突变文库中筛选得到酶活力提高的两个突变体D-9B和DD-12G。突变体D-9B和DD-12G的酶活分别为21.64±0.45 IU/mL、22.78±0.21 IU/mL,分别为野生型酶酶活的21.22倍和22.33倍。酶学性质研究表明,最佳突变体DD-12G的热稳定性得到了改善,同时Km值低于野生型酶,Kcat/Km值高于野生型酶,说明突变体DD-12G对底物的亲和力增强,催化效率有所提高。3.巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的Family shuffling及其在油炸食品中的应用研究。以分别来源于巨大芽孢杆菌突变株D-9B、单不动杆菌Y-3和地衣芽孢杆菌Z-1的L-天冬酰胺酶ansA基因作为亲本基因模板,构建巨大芽孢杆菌H-1 L-天冬酰胺酶ansA基因家族改组文库。利用高通量筛选的方法从5280个克隆子的突变文库中筛选得到3个酶活力显着提高的突变体F2-3G、F4-6G、F12-4C,且突变酶酶活与亲本D-9B比较分别提高了48%、69%、154%。其中最佳突变体F12-4C的热稳定性得到提高,动力学研究表明突变体F12-4C的Km值为15.49mM,低于亲本D-9B（26.07 mM）,kcat/Km为 187.84 min-1mM-1,是亲本D-9B的 1.42倍,说明突变体F12-4C对底物的亲和力增强,催化效率也有所提高。在热加工食品应用方面,薯片油炸之前先用L-天冬酰胺酶做浸泡处理,通过LC-MS/MS检测炸薯片中丙烯酰胺含量,结果显示未经酶处理的炸薯片中丙烯酰胺含量为1.105±0.089 mg/kg;用L-天冬酰胺酶野生型酶溶液（6IU/mL）处理后炸薯片中丙烯酰胺生成量降低了78.6%;用突变体F12-4C酶溶液（6IU/mL）处理后炸薯片中丙烯酰胺生成量降低了89.5%。表明巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型能有效降低薯片热处理过程中丙烯酰胺的含量,且突变体较于野生型酶对丙烯酰胺的控制更明显。
蓝碧锋[5]（2018）在《门冬酰胺酶生产菌种复壮及5000L规模发酵工艺优化研究》文中指出本论文针对门冬酰胺酶生产菌小规模生产过程中不稳定的问题,对欧文氏菌进行复壮筛选,并对放大至5000 L罐规模的系列问题进行研究和探索,实现门冬酰胺酶发酵工艺的优化。研究结果如下:1、通过紫外线+LiCl复合诱变法复壮筛选出3株产酶能力强、性状稳定的欧文氏菌突变株,其中产酶能力最强的FZ-1-15号菌株摇瓶发酵门冬酰胺酶的效价为34.9IU/mL,比出发菌株提高了 56.5%。2、通过碳源、氮源、复合氮源和无机盐等单因素试验、Plackett-Burman和响应面分析法优化研究,得出最佳发酵培养基配方:胰蛋白胨2.2%+谷氨酸钠2.1%+玉米浆2%+酵母粉0.5%+NaC10.5%,pH7.0;培养基灭菌方式采用121℃、30min湿消。通过三角瓶改良和摇瓶发酵培养试验,确定了一级生产种子培养的关键工艺控制参数:培养温度为37 ℃,1000mL摇瓶的培养基装量为250 mL,接种量为1.5%,摇床转速为220 r/min,培养周期为18 h。试验证明剪切力对发酵有显着的负面影响,在工艺控制中应通过调控通风量和罐压力等手段减少剪切力的影响因素。3、在50 L智能发酵罐上进行了复壮菌株FZ-1-15的发酵工艺研究。试验结果得出:欧文氏菌50L发酵罐的接种量为10%,培养基装量为30L,搅拌速度为170～210r/min,发酵过程中溶氧控制为菌体对数增长期DO值不能低于20%,发酵培养时间为12 h。4、在摇瓶发酵和50 L罐发酵的工艺基础上,进行了二级生产种子（500 L罐）培育和5000 L罐放大发酵工艺研究。研究结果得出:1)二级生产种子（500 L罐）的培养工艺。①培养基配方:葡萄糖2%（W/V）+胰蛋白胨2%（W/V）+酵母粉1%（W/V）,pH7.0;②培养条件:发酵罐培养基装量为300 L,接种量为1%,培养温度为37 ℃,罐压为0.06～0.09 MPa,通风量为14～22 M3/h,搅拌转速为170～200 r/min,培养过程中溶氧控制为菌体对数增长期DO值不能低于200%,培养周期为9h;③过种条件:种子培养液OD500≥25。2)5000 L罐放大发酵培养工艺。①培养基配方:胰蛋白胨2.2%+谷氨酸钠2.1%+玉米浆2%+酵母粉0.5%+NaC10.5%,pH7.0;②培养条件:发酵罐培养基装量为3000 L,接种量为10%,培养温度为37 ℃,罐压为0.06～0.09 MPa,通风量为140～220 M3/h,搅拌转速为170～200 r/min,发酵过程中溶氧控制为菌体对数增长期DO值不能低于20%,发酵培养周期为12 h。最终实现5000 L罐放大发酵的工艺优化,产门冬酰胺酶效价达80 IU/mL以上。
曾杰[6]（2017）在《优质L-天冬酰胺酶的开发与应用及重组表达研究进展》文中研究表明L-天冬酰胺酶用于治疗急性淋巴细胞白血病与淋巴瘤,但高昂的价格限制了临床上的广泛应用,重组表达解决了成本的难题。L-天冬酰胺酶所具有的低谷氨酰胺酶活性是其副作用的根源,同时细菌来源的L-天冬酰胺酶能导致危及生命的过敏反应,寻找副作用更低的优质L-天冬酰胺酶及其修饰方法,成为研究的重点。对L-天冬酰胺酶的重组表达,及具有更优性质的L-天冬酰胺酶开发进展进行了综述,并阐明其在临床治疗及食品工业领域的巨大应用潜力。
陈浩然[7]（2015）在《L-天冬酰胺酶基因工程菌的构建》文中指出L-天冬酰胺酶（L-asparaginase）又名L-门冬酰胺酶,左旋门冬酰胺酶,目前适用于治疗黑色素瘤、急性淋巴细胞性白血病（ALL）等,也可以用于治疗单核细胞类别的急性白血病、淋巴细胞类别的慢性白血病、非何杰金病淋巴瘤等。L-天冬酰胺酶使血液中的天冬酰胺分解成氨和天冬氨酸,天冬酰胺在血液中的浓度降低,使肿瘤细胞因为必要的天冬酰胺不能满足正常生长的需要,达到抑制肿瘤的目的。同时,大量的天冬酰胺合成酶存在于正常细胞内,正常细胞生长不受影响。因此,L-天冬酰胺酶得到医药界的普遍认可,许多年来临床化疗一直使用其作为药物辅助治疗ALL和非霍奇金淋巴瘤。来源于微生物的L-天冬酰胺酶比较常见,包括细菌、真菌、古生菌等,目前假单胞杆菌、枝孢霉菌、大肠杆菌、假丝酵母菌、欧文氏菌、地衣芽孢杆菌等来源的L-天冬酰胺酶已经被证实具有抗肿瘤活性。其中大肠杆菌来源的L-天冬酰胺酶能提供更加稳定的抗癌效果,其具有更低的生产本钱,产品的优势也更强大。近些年来,随着基因工程技术的高速稳定发展,利用其构建L-天冬酰胺酶基因工程菌的报道日益增多,基因工程菌L-天冬酰胺酶已经逐渐地成为了一个重要来源。迅速实现构建重组L-天冬酰胺酶工程菌,并使其大量表达L-天冬酰胺酶,优化其提取纯化工艺,逐步应用于标准工业化生产,可以国内企业用更少的本钱生产L-天冬酰胺酶,也在国内非霍奇金淋巴瘤和ALL的临床化疗方面有非常积极的意义。在这项研究中,我们把大肠杆菌AS1.357总DNA作为模板,设计特异性引物,完成L-门冬酰胺酶基因ansB的PCR扩增,将获得的基因工程菌经IPTG诱导表达AnsB蛋白,并利用重组标签His-tag,通过Ni-NTA亲和层析对重组AnsB蛋白进行纯化,再利用Pall超滤管进行除盐浓缩,利用SDS-PAGE凝胶电泳对重组AnsB蛋白进行定性分析,使用考马斯亮蓝法测定重组AnsB蛋白含量,最后得到由ansB基因表达的纯度很高、浓度达到62.7 mg/L的重组蛋白,纯化的重组蛋白产量达到42.28%,酶活性为137 IU/mL。比原始菌株大肠杆菌AS1.357提高了接近20倍,并且排除了大肠杆菌本底表达L-天冬酰胺酶的背景。这为后续完成L-天冬酰胺酶的药理和毒理实验,以及优化其发酵工艺和提取工艺,并逐步应用到工业化生产奠定了基础,为开发具有最优异成效的L-天冬酰胺酶的抗肿瘤药物提供了很大可能。
杨美成[8]（2015）在《现代色谱及联用技术在抗生素药品杂质分析中的应用研究》文中指出药品安全直接关系人类健康。抗生素的发现和使用挽救了无数人的生命,在全球药品市场中,抗生素类药物的份额占到了20%以上,中国内地的市场份额超过35%。但同时,抗生素类药物的临床不良反应发生率也长期占据高位,在我国甚至高达约40%,每年有数以万计的患者死于与之相关的药源性疾病。这些不良反应的发生除与药物本身的药理活性相关外,与药品中所存在的杂质尤其是毒性杂质也有很大关系。因抗生素药品多通过发酵工艺生产,其纯度较全合成的化学药品低,且其杂质来源各异、种类众多、成份复杂,传统的单一色谱分析手段难以提供准确、完整的分析信息。因此,建立一套系统、全面、准确的抗生素类药品杂质分析方法是一项关系国计民生的重要课题。本论文利用多种现代色谱方法及联用技术,通过与其它化学、生物技术的交叉结合,开展从工艺分析、杂质筛查到杂质定向合成、结构确认、分离测定,再到毒性评价、抑菌活性分析的系列研究,力图全面深入地分析抗生素中的杂质组成以及相关的毒性、药效关系,为提高抗生素药品质量及临床用药安全提供依据。本文研究和发展了以液相分离技术为基础的多种分离、分析模式,包括建立和优化高效液相色谱方法（HPLC）,有效结合二维液相串联四级杆飞行时间质谱（2D LC-QTOF MS）、胶束电动色谱（MEKC）、电泳中介微分析（EMMA）等技术,将之应用于抗生素类药品的杂质分离和分析中,并对新发现杂质的生物特性开展了进一步的研究,为该类抗生素杂质的国家标准的制订提供了依据。第一章绪论介绍了抗生素药品杂质的分析与研究概括,综述了液相色谱及联用技术以及毛细管电泳技术在抗生素杂质分析中的应用,阐述了本论文的选题背景、意义和思路。第二章基于高效液相色谱及2D LC-QTOF MS技术的头孢噻吩钠中去乙酰氧基头孢噻吩杂质的分析与研究通过工艺分析推导头孢噻吩钠中应含有一定量的去乙酰氧基头孢噻吩杂质,经实验予以证实。定向合成了该杂质并采用ESI-MS、IR、1H-NMR、13C-NMR进行结构确证,优化了HPLC方法以分离测定,同时建立了2D LC-QTOF MS方法对分离所得的去乙酰氧基头孢噻吩峰进行了确证,而世界各主要国家药典中对于该杂质的认定均为错误,斑马鱼胚胎急性毒性研究结果表明该杂质为毒性杂质。研究结果为相应国家标准的修订提供了依据。第三章基于胶束电动色谱技术的头孢噻吩钠中3-位置异构体杂质的分析研究与发现本研究在头孢噻吩钠中发现了一个全新的未知杂质。通过工艺分析推导头孢.噻吩钠中应存在较高含量的3-位置异构体杂质；我们定向合成了该杂质并采用IR、1H-NMR等进行结构鉴定,采用所建立的MEKC新方法对临床使用的头孢噻吩钠和各国药典对照品进行分离、测定,发现此异构体杂质普遍存在且含量较高；研究比较了该杂质与头孢噻吩钠的毒性、抗菌谱及效价活性,确认其为毒性杂质；研究结果为相应国家标准的制订提供了依据。本文建立的MEKC分析方法灵敏度高、重现性好,整体研究思路能发现并全面评价抗生素杂质的含量、药效、毒性等各个方面,有望成功应用于其它重要抗生素药品的杂质分析。第四章基于液相色谱及质谱联用技术的氯唑西林钠杂质谱的分析与研究本研究采用液质联用技术对氯唑西林钠杂质谱进行了较为深入的研究,对分离、筛查所得各主要杂质逐一进行了结构定性,新发现一个工艺副产物；发现了氯唑西林钠现行国家标准中聚合物检验方法的缺陷,并对选取指针性杂质控制聚合物含量的方法进行了研究；采用正相HPLC法考察了氯唑西林钠的杂质谱,发现了1个新杂质,并通过制备色谱分离得到该杂质,经纯化后采用MS、1H-NMR和13C-NMR等分析方法对其结构进行了确证,药效实验的结果表明该杂质无抑菌活性。此工作为抗生素药品杂质谱的分析研究提供了可借鉴的经验。第五章基于高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术的羧苄西林钠杂质分析与研究建立了以HPLC-QTOF MS技术筛查、测定羧苄西林钠杂质的新方法,对测得的10个杂质均进行了结构推导,其中3个为新发现的聚合物杂质,分别为6-APA与羧苄西林开环物的聚合物、二聚体杂质以及三聚体杂质,为羧苄西林钠中聚合物杂质的聚合方式与机理研究提供了研究基础。第六章基于电泳中介微分析技术的抗生素制剂中氨基酸异构体杂质的手性分离建立了柱上衍生化的电泳中介微分析技术,分别对抗生素制剂中的精氨酸、门冬氨酸、谷氨酸和赖氨酸等4种常用氨基酸进行全自动的在线手性分离,可准确测定其中异构体杂质的量,抗生素或其衍生物均不干扰氨基酸衍生物的检测。本方法分析快速,专属性强,成本低廉,自动化程度高,可应用于抗生素制剂中氨基酸异构体杂质的手性分离。综上所述,本论文从发现抗生素药品中潜在杂质尤其是毒性杂质的分析研究出发,通过工艺分析与实验筛查相结合的发现途径,采用现代色谱及联用技术的分析手段,确定不同动物模型的毒性评价技术和针对不同种属微生物的抑菌效力测定技术为生物特性评估方式,为抗生素药品杂质的发现、分离、鉴定和测定提供了较为系统、全面的研究思路和方法。这些新方法和新技术的建立,有利于在抗生素药品杂质研究领域取得更多新的发现,对于提高药品质量、保障用药安全具有十分重要的现实意义。
康立[9]（2014）在《蛋白质谷氨酰胺酶的发酵纯化及其应用的初步研究》文中研究指明植物蛋白质由于在大多数食品的弱酸性pH值范围中溶解性较差,影响了其乳化性、起泡性和持水持油能力等功能性质,导致其在食品工业中的应用受到限制。主要原因是大多数植物蛋白中含有高含量的谷氨酰胺,易与其他酰胺基团之间形成氢键,使一些亲水性基团被包在分子结构内,蛋白质疏水性增加,导致蛋白质溶解性变差。通过脱酰胺作用,蛋白质中的酰胺基转化为羧基,负电荷增加,降低了蛋白质的等电点,同时脱酰胺也改变了蛋白质分子的空间结构,使原本被包在内部的亲水基团暴露出来,使蛋白质的溶解性能够得到很大的改善。研究表明,酶法脱酰胺较化学法脱酰胺在专一性、温和性以及安全性等方面具有优势。最初利用谷氨酰胺转胺酶、蛋白酶以及肽谷氨酰胺酶来进行脱酰胺,在使蛋白质发生脱酰胺反应的同时也会产生一些副作用,如使蛋白质交联或是水解。蛋白质谷氨酰胺酶（protein-glutaminase, PG）是一种新型脱酰胺酶,由于其专一性强,仅对蛋白质和多肽的谷氨酰胺残基的酰胺基起作用,不改变蛋白质的其他性质,具有很广泛的应用前景。本文对蛋白质谷氨酰胺酶的发酵、分离纯化以及其性质和应用进行了研究。本文主要研究结果如下：本研究首先以一株本实验室筛选出的产蛋白质谷氨酰胺酶的菌株——产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes）,编号为ZYF120113-1,为研究对象,研究其发酵情况。结果表明,菌株在种子培养基中的生长在11h之后达到稳定期,摇瓶发酵12h和发酵罐发酵10h后,单位酶活力最高,分别为0.586U/mL和0.405U/mL。本研究在试管法测定酶活力的基础上建立了96孔板测定酶活的方法,准确性与试管测定无明显差异,都能有良好的重复性,为高通量菌株筛选提供了方法。应用该方法从150株疑似菌株中筛选出10株产蛋白质谷氨酰胺酶较高的菌株,并进行保藏。本文在考察了菌株的发酵产酶规律后,研究了发酵条件对产酶的影响。其中包括温度、摇床转速、摇瓶装液量、培养基碳源和氮源五个方面。以发酵12h后的酶活为监测指标,发酵条件为发酵温度30℃,摇床转速200r/min,装液量25mL/250mL三角瓶,蔗糖为碳源,多聚蛋白胨为氮源时,菌株的产酶能力最高,为0.612U/mL。对发酵后得到的粗酶液,进行了对蛋白质谷氨酰胺酶的纯化,最终得到了纯度较高的蛋白质谷氨酰胺酶。发酵液上清,经过了超滤浓缩、乙醇沉淀、离子交换、凝胶过滤、脱盐和冷冻干燥一系列的纯化步骤。经过了超滤浓缩后,大部分杂蛋白被除去,比酶活力得到提高,为0.435U/mg,单步的总酶活力收率为85.73%；经过了乙醇沉淀之后,比酶活力为2.269U/mg,单步总酶活力回收率为76.07%,超滤浓缩和乙醇沉淀的步骤中总酶活回收率都处在较高的水平。利用SP Sepharose阳离子交换柱对粗酶进行了初步纯化,蛋白质谷氨酰胺酶的纯度进一步提高,得到的比酶活力为8.403U/mg,单步总酶活力回收率为75.00%。在凝胶过滤这一步,利用Sephacryl S-100HR层析柱,蛋白质谷氨酰胺酶被精细纯化,最终得到比酶活为27.371U/mg的蛋白质谷氨酰胺酶,纯化倍数为161.96,整个纯化过程的总酶活力回收率为32.91%。最后,本研究利用纯化后得到的蛋白质谷氨酰胺酶,研究了其酶学性质和在大豆分离蛋白上的初步应用效果。结果表明,酶的最佳作用pH值为6-7,最佳作用温度为60℃,在pH值6-8的环境中能保持酶活力较长期稳定,在20-40℃环境下储存1h,酶活力保持稳定。Cu2+对于蛋白质谷氨酰胺酶酶活力有较明显抑制作用,Na+对于酶活有少量的促进作用,而其他离子及抑制剂对酶活力无明显影响。通过双倒数作图,得到酶的Km值为1.68,最大反应速率为1.742μg（NH3）×min-1×mL-1。对底物的特异性方面,Nα-Cbz-Gln-Gly最好,为1.983μmol（NH3）×min-1×mg-1,大豆分离蛋白其次,为0.417μmol（NH3）×min-1×mg-1,明胶较差,为0.118μmol（NH3）×min-1×mg-1,牛血清白蛋白最差,为0.025μmol（NH3）×min-1×mg-1。通过对大豆分离蛋白的酶处理,证实其能够使大豆分离蛋白有很好的脱酰胺效果,在2h的酶反应时间时,脱酰胺度达到40%以上,在18h的反应时间时,脱酰胺度达到52.34%。本文通过对产蛋白质谷氨酰胺酶的产吲哚金黄杆菌（Chryseobacterium indologenes ZYF120113-1）的发酵培养,对酶的纯化、酶的性质和酶的应用进行了较为系统的研究,为今后蛋白质谷氨酰胺酶的研究及生产提供了思路。
薛宇醒,范咏,徐小晓,华隽伟,潘伟忠,韦利军[10]（2012）在《应用ELISA法检测门冬酰胺酶中残余大肠杆菌菌体蛋白含量的研究》文中研究指明采用Cygnus公司"大肠杆菌菌体残留蛋白检测试剂盒"检测门冬酰胺酶中残余宿主菌菌体蛋白含量,建立门冬酰胺酶中宿主菌菌体蛋白残留检测方法并进行了相关方法验证。验证结果表明:宿主菌菌体蛋白浓度在0～100 ng/mL范围内呈良好的线性关系,线性相关系数大于0.99,不同实验人员测得的精密度RSD均小于5%,平均回收率为94.34%。通过对8批门冬酰胺酶样品的检测,测得门冬酰胺酶中的残余宿主菌体蛋白含量均小于550×10-6。该方法具有快速,操作安全简便等优点,灵敏度高,重现性好,可用于门冬酰胺酶的宿主菌体蛋白的残留检测。
二、工业化生产L-门冬酰胺酶发酵条件的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、工业化生产L-门冬酰胺酶发酵条件的研究（论文提纲范文）
（1）食品中γ-谷氨酰肽的研究进展（论文提纲范文）
| 1 γ-谷氨酰肽的结构特征 |
| 2 γ-谷氨酰肽的呈味机制 |
| 2.1 γ-谷氨酰肽的呈味机理 |
| 2.2 γ-谷氨酰肽对钙离子敏感受体的变构调节作用 |
| 3 γ-谷氨酰肽的制备 |
| 3.1 自然提取法 |
| 3.2 化学合成法 |
| 3.3 微生物发酵法 |
| 3.4 酶合成法 |
| 3.4.1 谷氨酰胺酶 |
| 3.4.2 γ-氨酰转肽酶 |
| 4 γ-谷氨酰肽的检测 |
| 4.1 感官评价法 |
| 4.2 生物检测法 |
| 4.3 化学法 |
| 4.3.1 超滤 |
| 4.3.2 色谱法 |
| (1）凝胶渗透色谱 |
| (2）高效液相色谱法 |
| (3）反相高效液相色谱 |
| 4.3.3 质谱分析法 |
| (1）液相色谱串联质谱 |
| (2）毛细管电泳-串联质谱技术 |
| (3）电喷雾飞行时间质谱 |
| 4.3.4 核磁共振波谱法 |
| 5 结语 |
（2）Rhizomucor miehei来源L-天冬酰胺酶的克隆表达及分子改造研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-天冬酰胺酶概述 |
| 1.1.1 L-天冬酰胺酶的来源及结构 |
| 1.1.2 L-天冬酰胺酶的催化机制 |
| 1.2 L-天冬酰胺酶的应用领域 |
| 1.2.1 L-天冬酰胺酶在医药方面的应用 |
| 1.2.2 L-天冬酰胺酶在食品方面的应用 |
| 1.2.3 其他应用 |
| 1.3 L-天冬酰胺酶的分子改造研究进展 |
| 1.3.1 L-天冬酰胺酶的热稳定性改造 |
| 1.3.2 L-天冬酰胺酶的底物特异性改造 |
| 1.4 L-天冬酰胺酶的发酵生产 |
| 1.4.1 L-天冬酰胺酶的野生菌发酵 |
| 1.4.2 L-天冬酰胺酶的重组菌发酵 |
| 1.5 立题依据及研究意义 |
| 1.6 本论文的主要研究内容 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料与仪器 |
| 2.1.1 质粒及菌株 |
| 2.1.2 引物设计 |
| 2.1.3 主要实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂及培养基 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2.2 E. coli BL21 以及E. coli JM109 感受态的制备及转化 |
| 2.2.3 B.subtilis168 感受态的制备及转化 |
| 2.2.4 全质粒PCR构建L-天冬酰胺酶突变株 |
| 2.2.5 重组L-天冬酰胺酶的表达及SDS-PAGE分析 |
| 2.2.6 重组L-天冬酰胺酶的纯化与浓度测定 |
| 2.2.7 L-天冬酰胺酶酶活的测定 |
| 2.2.8 重组L-天冬酰胺酶酶学性质的测定 |
| 2.2.9 L-天冬酰胺酶的三维结构模拟与分析 |
| 2.2.10 重组L-天冬酰胺酶菌株的5 L罐培养 |
| 第三章 结果与讨论 |
| 3.1 不同来源L-天冬酰胺酶基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.1.1 不同来源L-天冬酰胺酶基因的克隆及分析 |
| 3.1.2 不同来源L-天冬酰胺酶重组大肠杆菌的构建 |
| 3.1.3 不同来源L-天冬酰胺酶在大肠杆菌中的表达 |
| 3.2 米黑根毛霉重组L-天冬酰胺酶的酶学性质分析 |
| 3.2.1 重组L-天冬酰胺酶的纯化 |
| 3.2.2 重组L-天冬酰胺酶的最适温度和温度稳定性 |
| 3.2.3 重组L-天冬酰胺酶的最适p H和p H稳定性 |
| 3.2.4 金属离子对重组L-天冬酰胺酶的影响 |
| 3.3 定点突变提高米黑根毛霉L-天冬酰胺酶的比酶活及热稳定性 |
| 3.3.1 突变位点的选择 |
| 3.3.2 不同突变菌株酶活比较 |
| 3.3.3 优势突变酶的最适温度与温度稳定性 |
| 3.3.4 优势突变酶的最适p H与p H稳定性 |
| 3.3.5 L-天冬酰胺酶突变体的结构模拟与分析 |
| 3.4 组合突变进一步提高米黑根毛霉L-天冬酰胺酶的比酶活及热稳定性 |
| 3.4.1 组合突变菌株酶活比较 |
| 3.4.2 组合突变酶的最适温度与温度稳定性 |
| 3.4.3 组合突变酶的最适p H与p H稳定性 |
| 3.5 高产L-天冬酰胺酶枯草芽孢杆菌体系构建及发酵优化 |
| 3.5.1 重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/p MA5-A344E/S302I的构建、表达及酶活测定 |
| 3.5.2 重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/p MA5 UTR-A344E/S302I的构建、表达及酶活测定 |
| 3.5.3 重组枯草芽孢杆菌B.subtilis168/p MA5 UTR-A344E/S302I发酵培养基的初步优化 |
| 3.5.4 重组菌B.subtilis168/p MA5 UTR-A344E/S302I5 L罐发酵产酶研究 |
| 主要结论与展望 |
| 主要结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文 |
（3）立体选择性酰胺酶的筛选、改造及其在L-草铵膦合成中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 手性氨基酸概述 |
| 1.1.1 手性氨基酸 |
| 1.1.2 手性氨基酸的制备方法 |
| 1.2 草铵膦概述 |
| 1.2.1 草铵膦的生化功能 |
| 1.2.2 DL-草铵膦的化学合成法 |
| 1.2.3 L-草铵膦的化学合成 |
| 1.2.4 L-草铵膦的生物合成 |
| 1.3 酰胺酶 |
| 1.3.1 酰胺酶简介与分类 |
| 1.3.2 酰胺酶的底物特异性与立体选择性 |
| 1.3.3 酰胺酶的筛选 |
| 1.3.4 酰胺酶的克隆表达 |
| 1.3.5 酰胺酶的分子改造 |
| 1.4 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 1.4.1 枯草芽孢杆菌 |
| 1.4.2 影响枯草芽孢杆菌表达因素简介 |
| 1.4.3 启动子 |
| 1.4.4 信号肽 |
| 1.5 课题研究意义和主要研究内容 |
| 1.5.1 课题立项依据和研究意义 |
| 1.5.2 研究内容 |
| 第二章 立体选择性酰胺酶的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验试剂 |
| 2.2.2 菌种质粒及培养基 |
| 2.2.3 实验仪器与设备 |
| 2.2.4 高通量筛选方法的建立 |
| 2.2.5 立体选择性酰胺酶产生菌的筛选 |
| 2.2.6 产酶微生物菌株的鉴定 |
| 2.2.7 枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备与质粒的转化 |
| 2.2.8 立体选择性酰胺酶基因的挖掘 |
| 2.2.9 重组质粒构建 |
| 2.2.10 酰胺酶全基因合成 |
| 2.2.11 重组酰胺酶的表达与酰胺酶粗酶制备 |
| 2.2.12 核酸与蛋白电泳 |
| 2.2.13 酰胺酶催化底物转化成L-PPT的转化率与e.e.值测定 |
| 2.2.14 L-草铵膦的含量与e.e.值分析 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 高通量筛选方法的建立与验证 |
| 2.3.2 酰胺酶产生菌的筛选与鉴定 |
| 2.3.3 酰胺酶基因的挖掘 |
| 2.3.4 产酰胺酶菌株中酰胺酶基因的克隆 |
| 2.3.5 重组酰胺酶基因的分泌表达 |
| 2.4 本章小结 |
| 第三章 酰胺酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验试剂 |
| 3.2.2 菌株试剂及培养基 |
| 3.2.3 实验仪器及设备 |
| 3.2.4 枯草芽孢杆菌基因组提取 |
| 3.2.5 枯草芽孢杆菌内源启动子与信号肽引物设计 |
| 3.2.6 含有不同启动子质粒的构建 |
| 3.2.7 单启动子的筛选与表征 |
| 3.2.8 双启动子构建 |
| 3.2.9 具备高效分泌效率的信号肽的筛选 |
| 3.2.10 枯草芽孢杆菌的扩大培养 |
| 3.2.11 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 枯草芽孢杆菌内源启动子的筛选与表征 |
| 3.3.2 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌内源性启动子作用下的活力测定与表征 |
| 3.3.3 Bm-Ami在枯草芽孢杆菌串联双启动子作用下的活力测定与表征 |
| 3.3.4 信号肽的筛选 |
| 3.3.5 Bm-Ami在5 L发酵罐中的扩大生产 |
| 3.3.6 酰胺酶文库中酰胺酶的分泌表达 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 立体选择性酰胺酶的酶学性质分析 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验试剂 |
| 4.2.2 菌种质粒及培养基 |
| 4.2.3 实验仪器与设备 |
| 4.2.4 立体选择性酰胺酶表达及纯化 |
| 4.2.5 重组酰胺酶酶活测定与蛋白含量测定 |
| 4.2.6 重组酰胺酶酶学性质的测定 |
| 4.2.7 酰胺酶动力学参数的测定 |
| 4.2.8 底物特异性 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 重组立体选择性酰胺酶的序列结构分析 |
| 4.3.2 重组立体选择性酰胺酶的系统发育分析 |
| 4.3.3 重组立体选择性酰胺酶的纯化 |
| 4.3.4 pH对酰胺酶酶活的影响及pH稳定性 |
| 4.3.5 温度对酰胺酶酶活的影响及温度稳定性 |
| 4.3.6 金属离子、特殊化学物质和有机溶剂对酶活的影响 |
| 4.3.7 动力学参数的测定 |
| 4.3.8 底物特异性 |
| 4.4 本章小结 |
| 第五章 重组酰胺酶的分子改造 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 主要实验试剂 |
| 5.2.2 菌株、质粒及培养基 |
| 5.2.3 实验仪器与设备 |
| 5.2.4 酰胺酶Bm-Ami的同源建模 |
| 5.2.5 酰胺酶模型YBm-Ami的活性口袋预测及分析 |
| 5.2.6 酰胺酶突变文库的构建与筛选 |
| 5.2.7 酰胺酶突变体动力学参数的测定 |
| 5.2.8 酰胺酶突变体的分子对接分析 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 酰胺酶同源建模及活性口袋预测及分析 |
| 5.3.2 酰胺酶突变文库的建立及筛选 |
| 5.3.3 组合突变和最优突变株的确立 |
| 5.3.4 动力学参数测定 |
| 5.3.5 酰胺酶突变体的分子对接分析 |
| 5.4 本章小结 |
| 第六章 立体选择性酰胺酶在L-草铵膦合成中的应用 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 主要实验试剂 |
| 6.2.2 菌株、质粒及培养基 |
| 6.2.3 实验仪器及设备 |
| 6.2.4 生物催化剂的制备 |
| 6.2.5 底物rac-4-[羟基(甲基)膦酰基]-2-(2-苯乙酰基)-丁酸(rac-S)的合成 |
| 6.2.6 立体选择性酰胺酶催化底物合成L-草铵膦的条件研究 |
| 6.2.7 不同底物浓度的反应进程研究 |
| 6.2.8 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦 |
| 6.2.9 L-草铵膦的分离纯化 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 Rac-S的合成 |
| 6.3.2 酰胺酶的制备 |
| 6.3.3 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的条件优化 |
| 6.3.4 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦的反应进程研究 |
| 6.3.5 酰胺酶催化rac-S合成L-草铵膦 |
| 6.3.6 L-草铵膦的分离纯化及D型底物的消旋化 |
| 6.3.7 L-草铵膦的表征 |
| 6.4 本章小结 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 主要贡献与创新 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 1 作者简历 |
| 2 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 3 参与的科研项目情况 |
| 4 发明专利 |
| 学位论文数据集 |
（4）巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的定向进化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 丙烯酰胺概述 |
| 1.1 丙烯酰胺的形成机理 |
| 1.2 丙烯酰胺的检测方法 |
| 1.3 丙烯酰胺的控制方法 |
| 2 L-天冬酰胺酶研究概况 |
| 2.1 L-天冬酰胺酶的来源和结构 |
| 2.2 L-天冬酰胺酶的克隆表达 |
| 2.3 L-天冬酰胺酶的应用 |
| 3 酶的分子改造 |
| 3.1 定向进化 |
| 3.2 理性设计 |
| 3.3 半理性设计 |
| 3.4 L-天冬酰胺酶的分子改造研究 |
| 4. 研究目的意义及内容 |
| 参考文献 |
| 第二章 巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型基因的克隆表达及其酶学性质研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因的克隆 |
| 2.2 巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶基因在E.coli中表达 |
| 2.3 重组酶的纯化 |
| 2.4 重组酶酶学性质研究 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的易错PCR和DNA shuffling研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 易错PCR反应体系的优化 |
| 2.2 易错PCR突变文库的构建和高通量筛选 |
| 2.3 DNA Shuffling突变文库的构建及筛选 |
| 2.4 突变酶的纯化 |
| 2.5 突变酶酶学性质研究 |
| 2.6 三维结构模拟及分析 |
| 2.7 突变酶圆二色谱分析 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的Family shuffling及其在油炸食品中的应用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 数据分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Family Shuffling突变文库的构建及筛选 |
| 2.2 突变酶的纯化 |
| 2.3 突变酶酶学性质研究 |
| 2.4 三维结构模拟及分析 |
| 2.5 突变酶圆二色谱分析 |
| 2.6 L-天冬酰胺酶在油炸食品中的应用 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 硕士期间发表文章 |
| 致谢 |
（5）门冬酰胺酶生产菌种复壮及5000L规模发酵工艺优化研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 门冬酰胺酶的研究历史和临床疗效 |
| 1.2.1 大肠杆菌产门冬酰胺酶 |
| 1.2.2 聚乙二醇化修饰的培门冬酶 |
| 1.2.3 欧文菌产门冬酰胺酶 |
| 1.3 国产欧文氏菌门冬酰胺酶的产业化研究概况 |
| 1.3.1 欧文氏菌菌株 |
| 1.3.2 欧文氏菌生产门冬酰胺酶的发酵工艺 |
| 1.3.3 门冬酰胺酶的分离纯化工艺 |
| 1.3.4 门冬酰胺酶冷冻干燥工艺 |
| 1.3.5 门冬酰胺酶确证化学结构或组分 |
| 1.3.6 门冬酰胺酶的质量标准 |
| 1.3.7 门冬酰胺酶的稳定性 |
| 1.4 国产欧文氏菌门冬酰胺酶产业化存在的问题 |
| 1.5 本论文研究的目的和意义 |
| 第二章 门冬酰胺酶生产菌种复壮及发酵工艺的优化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要仪器及设备 |
| 2.2.3 实验方法 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 菌种复壮 |
| 2.3.2 三角瓶改良试验 |
| 2.3.3 发酵培养基优化 |
| 2.3.4 培养条件优化 |
| 2.3.5 Plackett-Burman和响应面分析法优化发酵培养基 |
| 2.3.6 50L发酵罐培养工艺的验证研究结果 |
| 2.3.7 5000L罐发酵优化 |
| 2.3.8 发酵产物验证 |
| 2.3.9 发酵控制工艺小结 |
| 第三章 结论与展望 |
| 3.1 结论 |
| 3.2 创新点 |
| 3.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（6）优质L-天冬酰胺酶的开发与应用及重组表达研究进展（论文提纲范文）
| 1 L-天冬酰胺酶概述 |
| 1.1 L-天冬酰胺酶的历史 |
| 1.2 L-天冬酰胺酶的性质 |
| 1.3 L-天冬酰胺酶的抗肿瘤机制 |
| 1.4 L-天冬酰胺酶药物 |
| 1.5 L-天冬酰胺酶的来源 |
| 2 L-天冬酰胺酶的微生物发酵 |
| 2.1 大肠杆菌发酵 |
| 2.2 真菌发酵 |
| 3 L-天冬酰胺酶的重组表达 |
| 3.1 大肠杆菌表达系统 |
| 3.1.1 宿主菌的选择 |
| 3.1.2 信号肽的选择 |
| 3.1.3 培养基组分的优化 |
| 3.2 枯草芽孢杆菌表达系统 |
| 3.3 毕赤酵母表达系统 |
| 4 无谷氨酰胺酶活性的L-天冬酰胺酶重组表达 |
| 4.1 细菌来源 |
| 4.2 真菌来源 |
| 5 耐高温L-天冬酰胺酶的重组表达 |
| 6 L-天冬酰胺酶治疗的其他改进 |
| 6.1 L-天冬酰胺酶免疫抑制及胰腺炎副作用的克服 |
| 6.2 L-天冬酰胺酶纳米粒子 |
| 6.3 L-天冬酰胺酶的微生物治疗 |
| 7 结语和展望 |
（7）L-天冬酰胺酶基因工程菌的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 L-天冬酰胺酶概论 |
| 1.1.1 L-天冬酰胺酶发现历史 |
| 1.1.2 L-天冬酰胺酶来源 |
| 1.1.3 L-天冬酰胺酶的结构 |
| 1.1.4 L-天冬酰胺酶的生理作用 |
| 1.2 L-天冬酰胺酶的研究进展 |
| 1.2.1 L-天冬酰胺酶的修饰和固定化的研究进展 |
| 1.2.2 L-天冬酰胺酶基因工程菌的的研究进展 |
| 1.2.3 L-天冬酰胺酶提取纯化工艺的研究进展 |
| 1.2.4 L-天冬酰胺酶的发酵工艺的研究进展 |
| 1.3 展望 |
| 第二章 实验材料、仪器与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因ansB的获得 |
| 2.3.1.1 大肠杆菌ansB基因的选择 |
| 2.3.1.2 PCR引物设计 |
| 2.3.1.3 大肠杆菌全基因组DNA的提取 |
| 2.3.1.4 PCR扩增ansB基因 |
| 2.3.1.5 PCR产物纯化 |
| 2.3.2 重组克隆质粒的构建 |
| 2.3.2.1 T-A克隆 |
| 2.3.2.2 大肠杆菌Top10感受态细胞的制备 |
| 2.3.2.3 重组克隆质粒的转化 |
| 2.3.2.4 阳性克隆载体的筛选与鉴定 |
| 2.3.3 重组表达质粒的构建 |
| 2.3.3.1 重组克隆载体质粒和表达载体质粒的提取 |
| 2.3.3.2 重组克隆载体和表达载体的分别双酶切反应 |
| 2.3.3.3 酶切片段的胶回收 |
| 2.3.3.4 构建表达载体pET-22b-ansB |
| 2.3.3.5 大肠杆菌BL21感受态细胞的制备 |
| 2.3.3.6 表达载体pET-22b-ansB的转化 |
| 2.3.3.7 阳性表达载体pET-22b-ansB的筛选与鉴定 |
| 2.3.4 AnsB蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.3.4.1 IPTG诱导重组蛋白AnsB的表达 |
| 2.3.4.2 超声波破碎大肠杆菌细胞 |
| 2.3.4.3 AnsB蛋白的亲和层析 |
| 2.3.4.4 AnsB蛋白浓缩除盐 |
| 2.3.4.5 SDS-PAGE定性分析AnsB蛋白 |
| 2.3.4.6 AnsB蛋白的浓度测定 |
| 2.3.5 L-天冬酰胺酶活力的测定 |
| 2.3.5.1 酶活测定方法 |
| 2.3.5.2 重组L-天冬酰胺酶粗酶液的酶活测定 |
| 2.3.5.3 亲和纯化后的L-天冬酰胺酶活性测定 |
| 2.3.5.4 大肠杆菌的本底表达的L-天冬酰胺酶活性测定 |
| 第三章 实验结果与分析 |
| 3.1 大肠杆菌L-天冬酰胺酶Ⅱ基因ansB的获得 |
| 3.1.1 大肠杆菌AS1.357总DNA的提取 |
| 3.1.2 PCR扩增L-天冬酰胺酶Ⅱ基因ansB |
| 3.1.3 目的基因ansBPCR产物纯化 |
| 3.2 重组克隆载体pMD18-T-ansB的构建和鉴定 |
| 3.3 重组表达载体pET-22b-ansB的构建和鉴定 |
| 3.3.1 表达载体pET-22b的双酶切鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒pET-22b-ansB的表达与鉴定 |
| 3.3.3 重组表达质粒pET-22b-ansB测序鉴定 |
| 3.4 SDS-PAGE定性分析AnsB蛋白 |
| 3.5 AnsB蛋白的浓度测定 |
| 3.6 重组L-天冬酰胺酶酶活测定 |
| 3.6.1 氨氮标准曲线的绘制 |
| 3.6.2 L-天冬酰胺酶活性测定 |
| 第四章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）现代色谱及联用技术在抗生素药品杂质分析中的应用研究（论文提纲范文）
| 杨美成博士学位论文答辩委员会成员名单 内容摘要 ABSTRACT 表索引 图索引 第一章 绪论 |
| 第一节 抗生素药品杂质的分析与研究概况 |
| 1.1 抗生素药品的发展和使用现状 |
| 1.2 抗生素药品中杂质研究概述 |
| 第二节 液相色谱和联用技术及其在抗生素药品杂质分析中的应用 |
| 2.1 液相色谱技术概述 |
| 2.2 液相色谱及联用技术的原理和分类 |
| 2.3 高效液相色谱及联用技术在抗生素药品杂质分析中的应用 |
| 2.4 高效液相色谱及联用技术的前景和展望 |
| 第三节 毛细管电泳及其在抗生素药品杂质分析中的应用 |
| 3.1 毛细管电泳概述 |
| 3.2 毛细管电泳技术的原理和分类 |
| 3.3 毛细管电泳技术在抗生素药品杂质分析中的应用 |
| 3.4 毛细管电泳技术的前景和展望 |
| 第四节 本论文的研究思路 第二章 基于高效液相色谱及2D LC-QTOF MS技术的头孢噻吩钠中去乙酰氧基头孢噻吩杂质的分析与研究 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 HPLC条件 |
| 2.3 2D LC-QTOF MS条件 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 发现国际药典及中国药典对去乙酰氧基头孢噻吩的认定错误 |
| 3.2 去乙酰氧基头孢噻吩的合成与结构鉴定 |
| 3.3 HPLC方法的建立与优化 |
| 3.4 HPLC方法的验证 |
| 3.5 建立2D LC-QTOF MS方法确认头孢噻吩中去乙酰氧基头孢噻吩杂质 |
| 3.6 HPLC方法的应用 |
| 3.7 杂质毒性研究 |
| 3.8 制订国家药品标准 |
| 4 结论 第三章 基于胶束电动色谱技术的头孢噻吩钠中3-位置异构体杂质的分析研究与发现 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 ~1H-NMR条件 |
| 2.3 MEKC条件 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 ~1H-NMR鉴定头孢噻吩钠中的3-位置异构体杂质 |
| 3.2 头孢噻吩3-位置异构体的合成与结构鉴定 |
| 3.3 MEKC方法的建立与优化 |
| 3.4 MEKC方法的验证 |
| 3.5 MEKC方法的分离机理 |
| 3.6 MEKC方法的应用 |
| 3.7 3-位置异构体杂质与头孢噻吩钠的毒性研究 |
| 3.8 头孢噻吩及其3-位置异构体的抑菌效力测定 |
| 3.9 制订国家药品标准 |
| 4 结论 第四章 基于液相色谱及质谱联用技术的氯唑西林钠杂质谱的分析与研究 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 实验条件 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 杂质分析方法的改进 |
| 3.2 聚合物测定方法的有效性分析 |
| 3.3 正相HPLC系统的建立与分析 |
| 3.4 杂质h的抑菌效力测定 |
| 4 结论 第五章 基于高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用技术的羧苄西林钠杂质分析与研究 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 实验条件 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 主成分MS结果与分析 |
| 3.2 杂质MS结果与分析 |
| 3.3 聚合物的MS结构解析 |
| 4 结论 第六章 基于电泳中介微分析技术的抗生素制剂中氨基酸异构体杂质的手性分离 |
| 摘要 |
| 1 引言 |
| 2 实验部分 |
| 2.1 试剂与仪器 |
| 2.2 衍生化反应条件 |
| 2.3 分离谷氨酸和门冬氨酸衍生物的电泳条件 |
| 2.4 分离精氨酸衍生物的电泳条件 |
| 2.5 分离赖氨酸衍生物的电泳条件 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 衍生化反应条件的建立与优化 |
| 3.2 非手性巯基试剂+手性CZE的分离结果 |
| 3.3 手性巯基试剂+非手性MEKC的分离结果 |
| 3.4 手性巯基试剂+手性MEKC的分离结果 |
| 3.5 手性巯基试剂+手性CZE的分离结果 |
| 4 结论 第七章 结论 参考文献 致谢 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（9）蛋白质谷氨酰胺酶的发酵纯化及其应用的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 脱酰胺作用的研究概况 |
| 1.1.1 物理法脱酰胺 |
| 1.1.2 化学法脱酰胺 |
| 1.1.3 酶法脱酰胺 |
| 1.2 蛋白质谷氨酰胺酶的研究情况 |
| 1.2.1 蛋白质谷氨酰胺酶的发现 |
| 1.2.2 蛋白质谷氨酰胺酶的结构和作用机理 |
| 1.2.3 蛋白质谷氨酰胺酶的安全性 |
| 1.3 蛋白质谷氨酰胺酶的应用 |
| 1.3.1 米谷蛋白 |
| 1.3.2 大豆蛋白 |
| 1.3.3 小麦蛋白 |
| 1.4 本文主要研究背景、意义及研究内容 |
| 1.4.1 研究背景与意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 第二章 蛋白质谷氨酰胺酶生产菌株的筛选及发酵 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 方法 |
| 2.2.2.1 种子培养及生长曲线的测定 |
| 2.2.2.2 NH_4Cl标准曲线 |
| 2.2.2.3 酶活力的测定 |
| 2.2.2.4 发酵培养 |
| 2.2.2.5 高产蛋白质谷氨酰胺酶菌株的摇瓶筛选 |
| 2.2.2.6 数据统计分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 种子生长曲线 |
| 2.3.2 氨标准曲线 |
| 2.3.2.1 试管 |
| 2.3.2.2 96孔板 |
| 2.3.2.3 两种方法的比较 |
| 2.3.3 酶活-A630曲线 |
| 2.3.3.1 试管 |
| 2.3.3.2 96孔板 |
| 2.3.3.3 两种方法的比较 |
| 2.3.4 发酵生长曲线 |
| 2.3.4.1 摇瓶发酵 |
| 2.3.4.2 发酵罐发酵 |
| 2.3.5 高产菌株的筛选 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 产蛋白质谷氨酰胺酶菌株发酵条件的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 材料 |
| 3.2.2 方法 |
| 3.2.2.1 摇瓶发酵条件对于菌株产酶的影响 |
| 3.3.2.2 培养基成分对于菌株产酶的影响 |
| 3.3.2.3 数据统计分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 发酵条件对于菌株产酶的影响 |
| 3.3.1.1 温度 |
| 3.3.1.2 摇床转速 |
| 3.3.1.3 摇瓶装液量 |
| 3.3.2 碳源和氮源对菌株产酶的影响 |
| 3.3.2.1 碳源 |
| 3.3.2.2 氮源 |
| 3.3.3 最优条件下的发酵生长曲线 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 蛋白质谷氨酰胺酶的纯化 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 超滤浓缩 |
| 4.2.2.2 乙醇沉淀 |
| 4.2.2.3 离子交换层析 |
| 4.2.2.4 凝胶过滤层析 |
| 4.2.2.5 脱盐 |
| 4.2.2.6 SDS-PAGE |
| 4.2.2.7 酶活力及蛋白含量的测定 |
| 4.2.2.8 数据统计分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 超滤浓缩 |
| 4.3.1.1 不同截留分子量的比较 |
| 4.3.1.2 不同浓缩倍数的比较 |
| 4.3.2 乙醇沉淀 |
| 4.3.2.1 不同乙醇倍数的比较 |
| 4.3.2.2 不同沉淀时间的比较 |
| 4.3.3 酶的分离总结 |
| 4.3.4 离子交换层析 |
| 4.3.4.1 层析图谱 |
| 4.3.4.2 SDS-PAGE |
| 4.3.4.3 酶活力和蛋白含量测定 |
| 4.3.5 凝胶过滤层析 |
| 4.3.5.1 层析图谱 |
| 4.3.5.2 SDS-PAGE |
| 4.3.5.3 酶活力和蛋白含量测定 |
| 4.3.6 纯化总结 |
| 4.3.6.1 纯化步骤总结 |
| 4.3.6.2 SDS-PAGE |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 蛋白质谷氨酰胺的性质及应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.2.2.1 蛋白质谷氨酰胺酶的性质 |
| 5.2.2.2 蛋白质谷氨酰胺酶的应用 |
| 5.2.2.3 数据统计分析 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 pH对蛋白质谷氨酰胺酶的影响 |
| 5.3.1.1 不同pH下酶的活性 |
| 5.3.1.2 不同pH下酶的稳定性 |
| 5.3.2 温度对蛋白质谷氨酰胺酶的影响 |
| 5.3.2.1 不同温度下酶的活性 |
| 5.3.2.2 不同温度下酶的稳定性 |
| 5.3.3 金属离子和抑制剂对蛋白质谷氨酰胺酶的影响 |
| 5.3.4 酶的动力学参数 |
| 5.3.5 酶的底物特异性 |
| 5.3.6 大豆分离蛋白应用实验 |
| 5.3.6.1 脱酰胺度和水解度 |
| 5.3.6.2 脱酰胺现象 |
| 5.3.6.3 SDS-PAGE |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 全文总结与展望 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
四、工业化生产L-门冬酰胺酶发酵条件的研究（论文参考文献）
- [1]食品中γ-谷氨酰肽的研究进展[J]. 辛世华,韩小珍,贺晓光. 中国酿造, 2021(12)
- [2]Rhizomucor miehei来源L-天冬酰胺酶的克隆表达及分子改造研究[D]. 朱曼迟. 江南大学, 2021(01)
- [3]立体选择性酰胺酶的筛选、改造及其在L-草铵膦合成中的应用[D]. 康雪梅. 浙江工业大学, 2020(08)
- [4]巨大芽孢杆菌L-天冬酰胺酶Ⅰ型的定向进化[D]. 卢晓红. 南京农业大学, 2019(08)
- [5]门冬酰胺酶生产菌种复壮及5000L规模发酵工艺优化研究[D]. 蓝碧锋. 华南理工大学, 2018(01)
- [6]优质L-天冬酰胺酶的开发与应用及重组表达研究进展[J]. 曾杰. 中国生物工程杂志, 2017(11)
- [7]L-天冬酰胺酶基因工程菌的构建[D]. 陈浩然. 济南大学, 2015(05)
- [8]现代色谱及联用技术在抗生素药品杂质分析中的应用研究[D]. 杨美成. 华东师范大学, 2015(06)
- [9]蛋白质谷氨酰胺酶的发酵纯化及其应用的初步研究[D]. 康立. 华东师范大学, 2014(10)
- [10]应用ELISA法检测门冬酰胺酶中残余大肠杆菌菌体蛋白含量的研究[J]. 薛宇醒,范咏,徐小晓,华隽伟,潘伟忠,韦利军. 药物生物技术, 2012(03)