一、食用菌DNA提取方法研究（论文文献综述）
赵世明[1]（2021）在《牡丹江周边野生大型真菌采集鉴定及抑稻瘟菌生防菌株筛查》文中认为野生大型真菌是自然界菌物中有大型子实体形成的一类真菌,其中不乏食用、药用价值的种类。目前,国内外关于野生大型真菌鉴定与分离等相关研究较多,但在植物病害生物防治中的应用研究却不理想。因此,本试验依仗牡丹江地区广泛的野生大型真菌资源,对牡丹江四个周边地区进行野生真菌的采集、分子鉴定及组织分离;基于水稻生产育苗期以浓硫酸对土壤调酸抑制病害的操作,以p H值为依据将采集的野生大型真菌中的产酸菌株筛选出来,测定野生产酸菌株对稻瘟菌的抑制效果,期望从中筛选出高效生防菌株,试验结果如下:1、共采集到128种大型真菌子实体,提取得到97个子实体DNA样本,真菌通识引物PCR后测序,经BLAST比对和系统进化树的构建,69个样本得到种属鉴定,分别隶属于14个科27个属48种,优势科为蘑菇科和口蘑科,所占比例为16.33%,次优势科为红菇科和多孔菌科,所占比例为14.29%;优势属为蘑菇属,占比为14.58%,次优势属为丝盖伞属和红菇属,占比为8.33%。2、样本采集后第一时间进行子实体组织分离纯化,最终获得15株分离培养物,提取菌丝DNA经真菌通识引物PCR后测序,与对应原始子实体PCR产物序列比对,最终鉴定获得14株野生大型真菌纯培养物。3、液体培养14株野生真菌纯培养测其代谢液p H值,其中3株菌株代谢液p H值<4.5,尤其A24菌株p H值低至2.5,选定这3株菌株为抑稻瘟菌试验的备用菌株。对峙共培养结果表明:3株产酸野生菌对稻瘟菌均有显着的拮抗和抑制作用,A24菌株拮抗作用极显着,且对稻瘟菌黑色素分泌有完全抑制作用,后续试验继续对A24菌株进行设计。4、固体培养抑菌试验结果表明:A24菌株代谢液能改变稻瘟菌较少产生气生菌丝的生长习性,即菌丝均以表面气生为主,很少扎入基质内;A24菌株代谢液对稻瘟菌黑色素分泌表现极显着抑制效果,大于60%添加量时稻瘟菌黑色素表现被阻断效果。液体培养抑菌试验结果表明:A24号菌株代谢液对稻瘟菌生长抑制效果极显着;代谢液添加浓度达50%时可抑制菌丝萌发及生长,添加浓度达到75%以上,培养液中的稻瘟菌几乎不生长;代谢液添加浓度超过50%时稻瘟菌没有可溶性黑色素分泌,证实一定浓度的A24代谢液能有效抑制稻瘟菌生长且可阻断其黑色素分泌。综上所述,产酸野生真菌对稻瘟菌的生长起到很好的抑制作用,对稻瘟菌的预防及治理具有极大的应用价值,可作为一类理想的植保产品用于生产中,为植物病虫害防治中高效生物药剂提供资源储备。
马盼盼[2]（2020）在《单增李斯特菌质粒DNA定性标准物质的研制及在银耳检测中的应用》文中研究说明单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）,是一种常见食源性病原菌,是李斯特菌属中致病力最强的革兰氏阳性无芽孢杆菌,可引发多种疾病,致死率高（20%～30%）,在熟食、水产产品、冷冻食品及食用菌中均有检出,因此快速检测和诊断单增李斯特菌对食品安全意义重大。但食源性致病菌的传统检测方法耗时长、检测限低,不利于致病菌的快速检测。近年来针对转基因作物和病毒开发出基于核酸标准物质检测技术,能够使核酸扩增检测方法标准化,提高实验室间检测结果一致性和准确性。而我国在核酸标准物质的研制方面刚刚起步,数量和种类远远不能满足当前市场及监督检验的需求,对于单增李斯特菌毒力基因检测相关质粒定性标准物质的研制更是少之又少。本文通过提取单增李斯特菌标准菌株全基因组DNA,以此作为模板对毒力基因引物hly A、prfA1、prfA2进行PCR扩增,回收这3种毒力基因扩增的目的片段;分别克隆至载体p LB-simple Vector中,构建分别含有对应毒力基因的重组质粒;通过菌落PCR和测序对重组质粒进行检验,将转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存,大量提取质粒进行冻干,制成冻干粉,即初步得到用于检测单增李斯特菌的质粒标准品。根据菌落PCR和测序验证结果显示,本研究成功构建出含有hly A、prfA1、prfA2毒力基因的质粒标准物质,浓度、纯度和稳定性均达到要求。且在长期稳定性实验检测中,质粒标准物质的稳定性良好。同时发现PCR的敏感性受靶基因的影响,不同毒力基因的检测限也不同。将构建含有hly A、prf A1、prfA2毒力基因的质粒标准品作为阳性对照用于对30批次银耳样品的检测,有1批样品检测出prfA1和prfA2,检出率为3.3%。并对检测结果呈阳性的银耳样品通过传统微生物检测方法验证,但传统检测方法没有获得目标菌株,可能是在环境胁迫或优势菌株的存在下,目标菌株进入休眠或是VBNC状态。此种状态下的菌株在传统检测方法下不易被检出,大大降低了检出率,同时说明了PCR方法的灵敏度高于传统检测方法。
李银娇[3]（2020）在《云南食用菌内生细菌多样性分析及抗生素抗性的研究》文中研究表明目前对食用菌内生细菌的研究主要偏向于抗菌活性及代谢产物,因此对食用菌中内生细菌菌群结构多样性的研究具有一定意义。另外依赖传统培养法及生物形态学鉴别方法存在一定局限性,使用现代分子生物技术来鉴定分析内生菌菌落更加方便准确。本研究以三种云南野生食用菌为研究对象,通过传统培养结合分子生物技术来分离和鉴定其内生细菌。通过对12株食源性致病菌进行基因组装,分析其含有的耐药基因、耐药机制及其毒力因子。同时研究分离株对于18种抗生素的耐药性,结合耐药基因注释结果分析其耐药表现型和基因型。主要研究结果为:1.以云南常见食用菌为研究对象,其中黄谷熟（Lactarius）5份、青头菌（Russulavirescens）2份、鸡油菌（Cantharelluscibarius Fr.）1份各采摘自不同地点,通过试剂盒法来提取细菌基因组DNA,最终从3种食用菌8个样品中分离得到56株细菌菌株,分属于14个种属,假单胞菌属（Pseudomonas）、西地西菌属（Cedecea）、沙雷氏菌属（Serratia）、Lelliottia菌属为优势菌群,数据分析表明不同种食用菌和同种不同地的食用菌中均存在菌落结构的差异性和相似性。2.通过对12株食源性致病菌进行细菌基因组组装,分析基因注释,12株食源性致病菌中基因组蛋白功能较显着的为氨基酸转运与代谢功能;每个样品中包含的耐药基因均超过15种,每个样品含有的毒力因子超过30种。3.通过药敏实验表现型和PCR基因型来研究56株分离株的抗生素耐药性。结果显示:56株菌株对抗生素耐药率最高的是阿莫西林98.21%,万古霉素达91.07%,青霉素达94.64%;耐药率最低的是氧氟沙星为0,环丙沙星为1.69%、米诺环素和多西环素为3.57%。对耐药基因检测的结果为:检出率最高的是磺胺类中sul1基因,高达53.57%;除去未检出的菌株,检出率最低的是磺胺类的sul2和sul3基因,均为1.79%;四环素类的6种耐药基因仅tet K和tet M被检出,分别是8.92%和23.21%;β内酰胺类bla TEM、blavim、bla SHV均有检出,检出率分别是25%、21.42%、23.21%;氨基糖苷类四种耐药基因中aad B未检出,其余aac（3’）-IIa检出率为3.57%,acr B为1.79%%,aad A1为37.5%;氯霉素类Cat检出率为14.29%,flo R未检出;多肽类基因Van C检出率为3.57%,EmgrB未检出;喹诺酮类三个基因均有检出,分别为Gyr A 8.92%,Gyr B 39.29%,Par C 37.5%。表现型和基因型符合率最高的是氨基糖苷类90.48%,最低的是喹诺酮类2.94%。综上所述,食用菌内生细菌存在多样性和差异性,分离菌株对多种抗生素不同程度的耐药,耐药基因在分离株间广泛存在。
史灵燕[4]（2019）在《不同黑木耳品种种质鉴定及优良菌株筛选研究》文中研究指明食用菌市场菌种混乱问题日益严重,同物异名现象在黑木耳菌种市场屡见不鲜。本研究以24株北方地区主栽黑木耳菌株为试验材料,通过拮抗试验,酯酶同工酶测定、ISSR分子标记技术和SRAP分子标记技术,对黑木耳菌株进行多相分类鉴定,确定其亲缘关系远近,进一步结合栽培试验,对不同黑木耳品种进行品比试验,筛选出适宜于北部山区栽培的黑木耳优良菌株。本研究试验结果如下:1.通过对供试栽培黑木耳菌株的拮抗试验结果表明,24个菌株的拮抗反应表现为隆起型、沟壑型和无拮抗反应3种情况。其中Aaj4,Aaj6,Aaj7,Aaj12,Aaj20,Aaj24,这六个菌株与其他菌株间的拮抗反应均表现为隆起型,从培养皿背部观察有褐色色素的分泌;这六个菌株之间菌丝平铺到一起,无拮抗反应;其他菌株之间部分存在沟壑型反应,部分无拮抗反应,从培养皿背部观察无色素分泌。2.使用酯酶同工酶技术鉴定24株黑木耳菌株遗传多样性的试验结果表明,24种黑木耳菌株共扩增出11种迁移率不同的酶带,且聚类分析结果表明,当遗传系数为0.73时,可将24个黑木耳菌株分为两大类群,与拮抗试验结果吻合度较高。3.利用SRAP分子标记技术,对24个供试栽培黑木耳菌株进行遗传多样性分析试验中,以24株菌株基因组DNA为模板的扩增片段分子量在100-2 000 bp间总共扩增出133条多态性条带,平均每个引物扩增出6条多态性条带,聚类分析结果表明:遗传相似系数变化范围为0.56-1.0,在遗传相似系数为0.56时,可将24株黑木耳菌株划分为两大类群,聚类分析结果与拮抗试验结果、酯酶同工酶测定结果基本一致。4.通过ISSR分子标记对24个供试栽培黑木耳菌株基因组DNA进行PCR扩增,共扩增出67条清晰的DNA多态片段,大小介于0.2-2 kb,对扩增条带进行统计,聚类分析结果表明:遗传相似系数变化范围为0.74-1.0,当遗传系数为0.85时,可将24个菌株分为两大类,其聚类分析结果与前三种鉴定方法的结果基本一致,为今后黑木耳的分类鉴定及遗传育种亲本的选配提供了理论依据。最终,筛选出19株黑木耳生产菌株为代表菌株,进行品比试验。用十字交叉法测定了不同菌株的母种菌丝生长速度和长势,同时在北部山区阜平地区采用吊袋栽培法测定了不同菌株的农艺性状、抗杂能力和产量,结果表明,菌株野森一代、黑丹一代、黑山、黑耳厚4等个菌株,在产量、出芽时期、出芽整齐度、耳片形状等方面均表现优异,适宜作为北部山区主栽品种。本研究为黑木耳遗传育种及生产上黑木耳菌株的选择提供了科学依据。
李超[5]（2019）在《承德及周边地区野生菌采集鉴定及生物学活性分析》文中研究说明本论文是以野生食用菌为研究对象,对河北省承德市、围场满族蒙古族自治县、迁西县、三个区域采集的野生菌进行鉴定和生物学活性物质测定。主要研究结果如下:（1）野外采集并拍照记录12株野生菌,对12株野生菌进行传统的形态学鉴定,结果如下:chengde1为墨汁鬼伞（Coprinopsis atramentaria）;chengde2为血红密孔菌（Trametes coccinea）;chengde3和weichang2为云芝（Trametes versicolor）;weichang1为强壮齿耳菌（Steccherinum robustius）;weichang3为网纹马勃（Lycoperdon perlatum Pers）;weichang4为珊瑚菌（Ramaria botrytoides）;weichang5为木蹄层孔菌（Pyropolyporus fomentarius）;weichang6为蒙古口蘑（Tricholoma mongolicum Imai）;weichang7与qianxi1均为牛肝菌（Boletus）;qianxi2为粉托鬼笔（Phallus hadriani）。（2）对采集的12株野生菌进行组织分离,分离得到了10株野生菌的菌丝体,菌丝生长速度测定结果表明,chengde1、chengde2、chengde3、weichang2、weichang1、qianxi2菌丝生长强壮且速度较快。（3）对菌丝长势好的6株野生菌的ITS序列进行PCR扩增,序列结果与NCBI数据库进行比对,通过贝叶斯建树方法利用MAFFT、Mrmodeltest2.3、Mrbayes v2.3等软件进行分子鉴定,得到结果如下:chengde1与Coprinopsis atramentaria序列一致性为99.82%,且与Coprinopsis atramentaria聚为一支,节点支持率为100%,从而判定chengde1为墨汁鬼伞（Coprinopsis atramentaria）。Chengde2与Pycnoporus coccineus序列一致性为100%,且与Pycnoporus coccineus聚为一支,节点支持率为100%,从而判定chengde2为血红密孔菌（Pycnoporus coccineus）。Chengde3与Trametes versicolor序列一致性为99.66%,且与Trametes versicolor聚为一支,节点支持率为100%,从而判定chengde3为云芝（Trametes versicolor）。Weichang2与Trametes versicolor序列一致性为94.86%,且与chengde3和Trametes versicolor聚为一支,节点支持率为100%,从而判定weichang2为云芝（Trametes versicolor）。weichang1与Steccherinum robustius序列一致性为95.17%,且与Steccherinum robustius聚为一支,节点支持率为100%,从而判定weichang1为齿耳菌（Steccherinum robustius）。qiaanxi2与Phallus hadriani序列一致性为99.37%,且与Phallus hadriani聚为一支,节点支持率为100%,从而判定qianxi2为粉托鬼笔（Phallus hadriani）。（4）对6株已经确定种属的野生菌进行生物学活性分析,用ABTS为底物方法测定漆酶含量,凯氏定氮法测定粗蛋白含量,考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白含量,苯酚硫酸法测定粗多糖含量,琼脂扩散纸片法测定抗菌活性。结果如下:野生菌chengde1、chengde2、chengde3、weichang2、weichang1、qianxi2的漆酶含量分别是54.92 U/mL、45.61 U/mL、345 U/mL、187.03 U/mL、414.87 U/mL、36.91U/mL。粗蛋白含量分别为17.2%、18.52%、21.29%、24.79%、19.1%、7%。可溶性蛋白含量分别是0.49 mg/100g、5.58 mg/100g、4.73 mg/100g、3.53 mg/100g、4.1 mg/100g、11.25 mg/100g、粗多糖含量分别为1.9%、3.67%、2.4%、2.47%、2.78%、3.46%。抗菌活性结果显示,6株野生菌对大肠杆菌、金葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌四种指示菌均没有检测到抗菌作用。
田风华[6]（2019）在《中国东北元蘑种质资源评价及其三萜合成途径相关基因研究》文中研究说明元蘑（Sarcomyxa edulis）隶属于担子菌门Basidiomycota,小菇科Mycenaceae,美味扇菇属Sarcomyxa,是我国东北特色的低温型食药用菌。目前已有人工栽培,该菌味道鲜美,营养丰富,具有多种药用价值和广阔的研究、开发和利用前景,是我国重要的食药用菌资源。然而随着生态环境恶化,其野生资源不断减少,因而对其种质资源的保存、利用和遗传多样性研究工作亟需加强。目前国内对元蘑的研究主要集中于栽培和化学成分提取等方面的基础研究,在元蘑组学及相关性状,如苦味特征等方面的研究尚未见报道。本研究对元蘑野生和栽培种质资源进行收集、鉴定及评价。基于元蘑全基因组de novo测序结果,从表型与基因型两方面,利用SSR多态性分子标记和全基因组重测序SNP分子标记对26株在表型、品质、风味、抗病性等方面具有明显差异的种质资源进行遗传多样性和群体结构分析,结合各类型种质的地理分布和栽培特性进行多样性综合评价,旨在对元蘑现有种质资源进行客观评价,并对优良品种选育和种质创新提供资源和参考。通过种质资源收集和评价,本研究发现元蘑各种质具有不同程度的苦味差异,这直接影响蘑菇品质和商品价值。为了解元蘑苦味形成的原因,基于遗传多样性分析,选择两个遗传距离较远且存在明显苦味差异的菌株,从转录表达和全基因组水平分别进行比较分析,研究了元蘑与苦味物质的三萜合成途径相关基因的变异和表达状况。为今后对元蘑苦味变异基因的系统发育关系及蛋白互作的研究提供基础支持,对食药用菌苦味基因的克隆和无苦味品种的育种具有一定指导意义。主要研究内容结果如下:1、元蘑种质资源收集及鉴定:本研究从标本馆及中国东北地区25个采集地共获得野生和栽培标本252份,分离菌株229份。经鉴定,除未分离获得菌丝体菌株和一个分类地位不明确的菌株外,其它228个菌株均为元蘑（Sarcomyxa edulis）,初步建立了元蘑种质资源库。在资源收集过程中对元蘑病原也进行了收集,并首次发现Trichoderma pleuroticola是引起元蘑绿霉病的病原菌。2、元蘑种质资源评价:通过记录和评价原基数量、产量、风味、抗病性等11个栽培性状,对元蘑种质资源进行性状多样性分析。结果显示各种质性状差异较大,具有较高的表型性状多样性指数。各种质原基形成数目与其产量并非正相关。获得一株高产、周期短、抗病性强的优质种质T24一份及4份分别以T95、T21、T17、T109为代表的不同性状类型的元蘑种质资源,同时筛选到以T115为代表的苦味菌株4株。3、元蘑基因组分析及分子进化研究:元蘑SE1（HMJAU2016092521）基因组大小为35.65 Mb,共获得41个contigs,N50为1772559 bp,G+C含量为48.31%,注释到9364个蛋白编码基因。元蘑机体内次生代谢物生物合成的基因模型较复杂,比对共获得39个次生代谢物基因簇,其中4个属于萜类Terpene基因簇。通过与真菌中33个典型的基因组注释的单拷贝同源蛋白基因构建系统发育树,结果支持Sarcomyxa属的独立存在,进化上晚于Pleurotus属。4、元蘑种质资源遗传多样性分析:基于SSR分子标记和全基因组重测序技术对各种质资源进行遗传多样性研究,筛选出10对多态性较高的SSR引物,各种质间具有较丰富的SSR多态性。两种方式的遗传多样性研究结果相似,均支持野生型分化程度高于栽培型,且栽培型遗传距离较近,T24野生型种质资源较特殊。经驯化栽培后的元蘑种质与其祖先野生种质间分歧明显。5、元蘑苦味物质三萜合成途径相关基因研究:确定MVA途径是元蘑中三萜合成前体物质IPP的主要合成途径。获得了三萜前体合成和骨架化合物合成途径中各环节的重要酶基因,均呈现表达上调,且基因序列存在结构差异,造成大量非同义突变;合成后P450修饰途径中共获得82个呈显着差异表达的P450基因,其中21个参与以β-amyrin为支架结构的三萜合成后的氧化修饰,且发现在具苦味特征的T115菌株中修饰一级产物的基因较多,而修饰二级产物的基因在不具苦味特征的T184菌株中较多;元蘑基因组中存在两个黄瓜苦味素形成第一步基因Bi的同源蛋白编码基因,两基因在具苦味菌株T115中均呈现显着上调表达,且在DNA序列上存在较大的结构变异。上述结果表明元蘑三萜合成途径中相关基因可能与其苦味物质形成相关,也验证了三萜是元蘑苦味成分之一。该研究初步建立了中国东北元蘑种质资源库,建立了典型菌株的基因组和转录组数据库,从表型与基因型两方面对元蘑种质资源进行遗传多样性评价,并首次从组学水平对蘑菇的苦味特性进行研究。其结果为食药用菌的育种、分类、优质栽培等研究奠定了基础。
伍土恒[7]（2019）在《冷诱导金针菇子实体发育相关基因分析及CRISPR-Cas9突变技术体系的建立》文中研究说明金针菇是我国主要栽培的食用菌之一。但是工厂化栽培金针菇需要长时间的低温处理以诱导子实体的形成,于是需要消耗巨大的能源。培育高温型金针菇是解决此问题的一个重要方向。本研究以白色金针菇为实验材料,研究低温诱导金针菇菌丝向原基转变的分子机制,为高温型金针菇的培育和应用提供理论基础。所得主要研究结果与结论如下:（一）获得棉籽壳培养基上黑暗培养的菌丝和低温诱导形成的原基;进行de novo转录组测序,共得到53163640 clean reads,其中菌丝文库得到26888494clean reads和原基文库得到26275146 clean reads。De novo组装获得20157个AllUnigene,其中15058个All-Unigene得到注释;菌丝和原基的差异表达基因数为7935个,其中4025个上调,3910个下调。（二）通过差异表达基因的GO和KEGG pathway功能注释,对双组份系统转导途径、MAPK通路、非饱和脂肪酸途径、钙传导通路等进行分析。双组份系统转导途径中5个差异表达基因编码组氨酸激酶,3个在原基阶段呈表达量上调,2个呈下调。16个差异表达基因配对上MAPK通路。KEGG途径内质网蛋白加工过程的细胞质中热激蛋白Hsp70和Hsp90在原基表达量呈下调,Hsp40则呈上调,而在内质网内Hsp40呈下调。35个差异表达基因聚类至KEGG通路不饱和脂肪酸生物合成,并发现5个差异表达基因编码不饱和脂肪合成调控的△9-脂肪酸脱氢酶。钙传导通路中的unigene 3897和unigene 2842在菌丝和原基中差异表达。（三）对获得的转录组数据进行分子标记的开发。共检测出643个ESTSSRs。同时设计了1560对EST-SSRs引物。菌丝文库检测出5548个SNPs,原基文库检测出5955个SNPs。（四）对收集的菌丝和原基进行microRNA测序。菌丝材料获得约9.7M clean reads,而原基材料获得约8.4M clean reads;共获得21个microRNA;12个显着性差异表达microRNA,其中7个在原基阶段表达上调而5个则下调。对差异表达microRNA进行靶基因预测,PI3K-Akt信号通路中的Hsp90、S6和PP2A蛋白编码基因、内质网蛋白质处理通路中的Hsp70、UGGT、BiP和GRP94编码基因以及钙离子信号通路的ANT蛋白编码基因为重要的差异表达microRNA靶基因。（五）鉴定金针菇microRNA生物合成过程的关键酶DCL和AGO编码基因并对其进行克隆。金针菇DCL编码基因,CDS大小分别为4077bp、3183bp和4458bp,均有RNase III和Dicer结构域。金针菇AGO编码基因,CDS大小分别为2445bp、3039bp、2802bp和2772bp,均具有Piwi结构域和PAZ结构域。鉴定了温度感应蛋白DRK1和细胞膜非饱和脂质调节酶Mga2编码基因并进行克隆。DRK1具有保守的HAMP结构域。Mga2p有保守的ANK结构域。（六）鉴定了金针菇U6 snRNA,其序列与人类等的snRNA相比有较高的同源性。鉴定并克隆了3个金针菇U6启动子,其序列和米曲霉U6启动子等同源性低。构建了以H1启动子为g RNA转录启动子的H1-gRNA表达框、以金针菇FvU6启动子为gRNA转录启动子的Fv U6-g RNA表达框和以金针菇gpd启动子为gRNA转录启动子的gpd-gRNA表达框。最后对Cas9进行金针菇密码子优化并构建了FvCas9表达框。（七）drk1为目标突变基因,构建了pgfvs-hCas9-hph-gpd-D1/-D2/-D3和pgfvshCas9-hph-gpd-D1载体。PEG法转化金针菇YX74原生质体。6个拟转化子检测出hCas9部分片段但目标基因未发生突变。（八）drk1为目标突变基因,构建了p0390-hph-FvCas9-gpd-D1/-D5、p0390-hph-Fv Cas9-Fv U6-1-D4/-D5、p0390-hph-Fv Cas9-FvU6-2-D5和p0390-hph-Fv Cas9-FvU6-3-D5载体。通过ATMT法转化金针菇YX74菌丝球碎片。共获得27个拟转化子但在目标基因区域未能发现相关序列的改变。（九）PyrG为目标突变基因,建立FvCas9 in vivo和gRNA in vitro的CRISPRCas9突变技术。RT-qPCR、western blot及CDS全长测序,鉴定出含FvCas9的金针菇菌株FvCas9-1。体外制备gRNA。PEG法和电激法导入gRNA至菌株FvCas9-1的原生质体。共获得了153个拟突变子,鉴定结果显示PyrG未发生突变。（十）PyrG为目标突变基因,建立SpCas9-gRNA核酸蛋白复合物的CRISPRCas9突变技术。体外制备SpCas9蛋白和gRNA。电激法转化金针菇YX74原生质体,共获得53个拟突变子,鉴定结果显示PyrG未发生突变。
李佳梅[8]（2019）在《我国不同地区印度块菌伴生微生物多样性及化学成分含量分析》文中研究表明印度块菌Tuberindicum是隶属于子囊菌门的一类珍贵的地下生外生菌根真菌,具有重要的食药用价值及生态价值,广泛分布于我国多个地区,是我国最主要的出口贸易食用菌之一。印度块菌整个生活史漫长,地下菌丝、菌根及子实体的形成和发育各个阶段几乎都发生在地下,与土壤中的微生物发生紧密关系。研究表明,微生物在印度块菌菌根形成及子实体发育、独特芳香气味形成等过程中发挥重要作用,但其具体作用机制还尚不明确。目前对我国不同地区的印度块菌伴生微生物多样性及其生态功能的相关研究还尚未开展。本文运用高通量测序技术结合传统分离培养方法研究了不同地理分布区的印度块菌子实体伴生微生物的组成和差异以及块菌生长发育过程中不同部位的微生物多样性,同时采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高效液相色谱（HPLC）等方法比较分析了不同地区的印度块菌子实体化学成分含量及其抗氧化活性,以期明确地理分布对印度块菌伴生微生物、化学成分含量的影响,为将来对不同地区的印度块菌质量评价标准的制定奠定理论基础。主要研究结果如下:1,对我国西南、东北及华北地区的6个不同地区的印度块菌子实体伴生细菌多样性研究表明,印度块菌子实体均被变形菌门Proteobacteria（36.90-80.79%）、厚壁菌门 Firmicutes（0.04%-37.20%）、拟杆菌门 Bacteroidetes（4.44-14.85%）等定殖,以慢生根瘤菌属Bradyrhizobium为优势菌属（2.66-47.66%）,但细菌结构组成表现出地区差异性;此外,印度块菌菌根中优势菌属为链霉菌属Streptomyces（4.65%）等,土壤中主要为鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas（3.12-6.26%）等。2,对不同地区的印度块菌子实体中化学成分含量及抗氧化活性研究表明,云南曲靖的印度块菌子实体中游离糖（23.67mg/gdw）、总酚类（4.46 mg/gdw）、黄酮类化合物（2.31mg/gdw）含量最高,清除DPPH自由基（EC50值为0.93±0.11 mg/mL）和ABTS自由基活性（EC50值为0.68±0.13mg/mL）最强,西藏的印度块菌中多糖含量最高（115.24mg/gdw）;印度块菌子实体中挥发性化合物成分主要为醇类（28.30-69.65%）、醛类（5.35-23.21%）、酮类（1.88-16.10%）、芳香族化合物（0-0.91%）以及含硫化合物（0-0.11%）等,其中1-辛烯-3-醇含量最高（26.74-59.72%）,化合物组成及相对含量表现出地区差异性。3,从印度块菌子实体中分离获得了 60株可培养细菌,隶属于4门24属,以假单胞菌属Pseudomonas sp.、粪产碱杆菌Alcaligenes sp.、微杆菌属 Microbacterium sp.、节杆菌属Arthobactersp.为优势类群。其中13株能在Burk’s无氮培养基上生长,8株具有固氮酶基因,暗示其可能有固氮能力,1株具溶解无机磷能力,暗示其在印度块菌发育过程中可能发挥重要作用。
孙溪,班立桐,王玉,肖萍,范志华,王旭峰,杨华,黄亮[9]（2018）在《高质量真姬菇全基因组提取方法筛选》文中研究表明食用菌细胞壁的复杂性增加了提取基因组的难度,为找到满足真姬菇全基因组序列分析的高质量基因组提取方法,分别使用氯仿-Tris法与CTAB-SDS法等12种方法提取真姬菇菌丝体基因组,并进行样品前处理的优化。经琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计测定浓度和纯度、ITS序列的PCR扩增检测,结果表明:12种方法提取真姬菇菌丝体基因组时,氯仿-Tris法（样品烘干处理）与CTAB-SDS法（样本烘干处理）能得到较为完整的DNA。另外,通过在氯仿-Tris法（样品烘干处理）与CTAB-SDS法（样本烘干处理）的基础上增加柠檬酸钠-乙醇洗涤步骤,得到优化CTAB-SDS法。PCR检测结果显示,3种方法所得基因组DNA均能有效进行相应的酶反应。综合考虑基因组的浓度、纯度、完整性和有无降解等因素,优化CTAB-SDS法提取得到的基因组DNA(浓度为408.7 ng/μL,OD260/OD280为1.81±0.02)最适于真姬菇全基因组的序列分析。
刘晓婷,郭九峰,王淑妍,李亚娇,那日[10]（2015）在《用rDNA-ITS方法鉴别内蒙古多种野生食用菌》文中研究指明采用rDNA-ITS分子标记对内蒙古地区市场11种常见野生食用菌,以2个已知长期人工栽培可食用菌种香菇和双孢蘑菇为比照进行分子鉴定;通过优化DNA提取方法及PCR反应条件,用通用引物ITS1/ITS4扩增出650800 bp的目的 DNA片段,经PCR产物直接测序,然后与DNA序列数据库中的信息资源进行比对,鉴定出11个样品分属于卷边网褶菌、香杏丽蘑、野蘑菇、马鞍菌、杨树口蘑、蒙古口蘑和白鳞蘑菇。利用DNAMAN8软件,分析13个材料rDNA中ITS区序列,做同源性矩阵,绘制NJ树,得出13种常见食用菌亲缘关系的结论。结果表明:rDNA-ITS分析方法可以有效地划分不同种属的菌种,可以区分出常见野生食用菌。
二、食用菌DNA提取方法研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、食用菌DNA提取方法研究（论文提纲范文）
（1）牡丹江周边野生大型真菌采集鉴定及抑稻瘟菌生防菌株筛查（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 野生大型真菌概况 |
| 1.1.1 食用菌 |
| 1.1.2 药用菌 |
| 1.1.3 外生菌根菌 |
| 1.2 国内外大型真菌种属鉴定研究现状 |
| 1.3 大型真菌在植物栽培及病害防治中的应用研究 |
| 1.3.1 食用菌生产废料对植物栽培土壤的改良作用 |
| 1.3.2 食用真菌代谢物质在提高植物抗逆能力促壮苗中的应用 |
| 1.3.3 菌物及其代谢物在水稻病害生物防治中的应用 |
| 1.4 牡丹江地区环境资源基本概况 |
| 1.4.1 牡丹江地区地理位置 |
| 1.4.2 牡丹江地区气候特征及森林资源优势 |
| 1.5 研究的目的意义及主要内容 |
| 1.5.1 研究的目的意义 |
| 1.5.2 研究的主要内容 |
| 1.5.3 实验技术路线 |
| 第2章 大型真菌子实体野外采集及分子鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 试验仪器 |
| 2.1.3 试验方法与内容 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 牡丹江周边野生真菌(采集到的)DNA提取及PCR扩增 |
| 2.2.2 采集的野生真菌PCR序列BLAST比对的种属鉴定 |
| 2.2.3 采集到的野生真菌主要科属分析 |
| 2.2.4 采集的野生真菌形态特征、生长环境及应用价值简述 |
| 2.2.5 系统发育树构建及同源性分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 野生真菌子实体组织分离鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验仪器 |
| 3.1.3 试验方法与内容 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 菌丝体分离纯化 |
| 3.2.2 菌丝体DNA提取及通识引物PCR测定 |
| 3.2.3 菌丝体代谢液低p H值筛选 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 本章小结 |
| 第4章 野生真菌产酸菌株抑稻瘟菌效果分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验仪器 |
| 4.1.3 试验方法与内容 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 产酸野生真菌对稻瘟菌拮抗及抑制效果 |
| 4.2.2 固体培养条件下产酸野生真菌代谢液抑稻瘟菌效果 |
| 4.2.3 液体培养条件下产酸野生真菌代谢液抑稻瘟菌效果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（2）单增李斯特菌质粒DNA定性标准物质的研制及在银耳检测中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词列表 |
| 第一章 单增李斯特菌检测方法研究进展 |
| 1.1 传统检测方法 |
| 1.2 免疫学检测方法 |
| 1.2.1 酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) |
| 1.2.2 酶联荧光分析法(Enzyme-linked fluorescent assay, ELFA) |
| 1.2.3 免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique, GICT) |
| 1.3 分子生物学检测方法 |
| 1.3.1 核酸探针杂交技术 |
| 1.3.2 PCR检测技术(Polymerase Chain Reaction) |
| 1.3.3 核酸序列等温扩增技术(Nuclear acid sequence-based amplification, NASBA) |
| 1.3.4 多重PCR(multiplex PCR, m PCR) |
| 1.3.5 实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR, q PCR) |
| 1.3.6 环介导恒温扩增法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP) |
| 1.3.7 基因芯片(DNA microarray) |
| 1.4 生物传感器检测 |
| 1.4.1 光学生物传感器 |
| 1.4.2 电化学酶联免疫传感器 |
| 1.5 单增李斯特菌主要毒力因子 |
| 1.5.1 溶血素O( Listeriolysion O, LLO) |
| 1.5.2 磷脂酶C (phospholipase C, PLC) |
| 1.5.3 PrfA蛋白 |
| 1.6 本课题研究的意义与目的 |
| 参考文献 |
| 第二章 单增李斯特菌毒力基因质粒DNA标准物质的构建 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验菌株 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 引物合成 |
| 2.3.2 菌种保存及传代培养 |
| 2.3.3 单增李斯特菌基因组DNA提取 |
| 2.3.4 基因组DNA浓度和纯度检测 |
| 2.3.5 基因组DNA完整性检测 |
| 2.3.6 基因组DNA稳定性检测 |
| 2.3.7 PCR检测及评价 |
| 2.3.8 凝胶回收 |
| 2.3.9 PCR特异性实验 |
| 2.3.10 敏感性分析 |
| 2.3.11 质粒标准物质构建 |
| 2.3.12 质粒标准物质的PCR鉴定 |
| 2.3.13 质粒标准物质提取及测序鉴定 |
| 2.3.14 质粒标准物质的传代培养及提取鉴定 |
| 2.4 实验结果与分析 |
| 2.4.1 单增李斯特菌DNA提取 |
| 2.4.2 基因组DNA保存在-20℃条件下的稳定性 |
| 2.4.3 PCR扩增结果 |
| 2.4.4 毒力基因凝胶回收结果 |
| 2.4.5 PCR特异性和敏感性 |
| 2.4.6 菌落PCR |
| 2.4.7 含毒力基因的质粒提取及传代培养 |
| 2.4.8 质粒标准物质测序结果 |
| 2.5 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 DNA标准物质在银耳表面单增李斯特菌快速检测应用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 样品采集 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 碱裂解法大量提取质粒标准物质及冻干粉制备 |
| 3.3.2 质粒标准物质冻干粉敏感性分析 |
| 3.3.3 质粒标准物质冻干粉均匀性检测 |
| 3.3.4 质粒标准物质冻干粉长期稳定性检测 |
| 3.3.5 银耳表面微生物基因组DNA提取 |
| 3.3.6 质粒标准物质对银耳表面微生物基因组PCR检测 |
| 3.3.7 传统微生物检测银耳样本中的单增李斯特菌 |
| 3.4 结果及分析 |
| 3.4.1 质粒标准物质检测限结果 |
| 3.4.2 冻干粉标准物质均匀性检测结果 |
| 3.4.3 冻干粉标准物质长期稳定性结果 |
| 3.4.4 银耳微生物表面基因组PCR扩增结果 |
| 3.4.5 传统检测结果 |
| 3.5 讨论与结论 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 结论与展望 |
| 硕士期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）云南食用菌内生细菌多样性分析及抗生素抗性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要仪器设备表 |
| 主要略缩词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 云南野生食用菌与内生菌的研究 |
| 1.1.1 云南野生食用菌简介 |
| 1.1.2 内生菌概念及普遍存在性和生物多样性 |
| 1.1.3 食用菌中微生物多样性的研究 |
| 1.2 食源性致病菌研究现状 |
| 1.3 细菌菌种鉴定的方法 |
| 1.3.1 16SrRNA序列分析 |
| 1.3.2 MALDI-TOF MS鉴定技术 |
| 1.3.3 高通量测序 |
| 1.4 细菌耐药性研究 |
| 1.4.1 耐药性的产生及危害 |
| 1.4.2 耐药基因的研究 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 研究内容 |
| 1.6.1 云南食用菌内生细菌多样性研究 |
| 1.6.2 内生细菌中的食源性致病菌基因组组装及分析 |
| 1.6.3 分离内生细菌的抗生素耐药性研究 |
| 第二章 云南食用菌内生细菌菌落结构与多样性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与试剂 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 样品的采集及前处理 |
| 2.3.2 两种细菌基因组DNA提取方法比较 |
| 2.3.3 内生菌的分离与纯化 |
| 2.3.4 分子鉴定 |
| 2.3.5 数据分析构建系统发育树 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 细菌基因组DNA提取方法的选择 |
| 2.4.2 内生细菌的分离 |
| 2.4.3 内生细菌分子鉴定 |
| 2.4.4 菌种鉴定及系统发育树的构建 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 内生细菌中的食源性致病菌基因组组装及分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与试剂 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 基因组装使用试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 常见食源性致病菌亲缘关系比对 |
| 3.3.2 细菌基因组组装 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 常见食源性致病菌亲缘关系比对 |
| 3.4.2 食源性致病菌基因组组装 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 分离内生细菌的抗生素耐药性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与试剂 |
| 4.2.1 菌株 |
| 4.2.2 药敏片 |
| 4.2.3 其他试剂 |
| 4.3 药敏实验的方法和判定标准 |
| 4.3.1 培养基选择 |
| 4.3.2 菌液准备 |
| 4.3.3 药敏片贴片 |
| 4.3.4 抑菌圈测量和判定标准 |
| 4.3.5 细菌基因组DNA提取 |
| 4.3.6 耐药性基因型研究 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 药敏实验结果 |
| 4.4.2 耐药基因型分析 |
| 4.4.3 多重耐药谱分析 |
| 4.4.4 56株菌株耐药性表现型与基因型符合率分析 |
| 4.4.5 基因注释匹配结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读硕士期间发表的论文 |
（4）不同黑木耳品种种质鉴定及优良菌株筛选研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 黑木耳概述 |
| 1.1.1 黑木耳生物学特征 |
| 1.1.2 黑木耳的分布及生态习性 |
| 1.1.3 食用菌及黑木耳的营养价值 |
| 1.1.4 黑木耳的栽培历史 |
| 1.1.5 黑木耳的国内外研究进展 |
| 1.2 食用菌市场菌种质量的发展现状及对策 |
| 1.2.1 食用菌菌种质量存在的问题 |
| 1.2.2 食用菌菌种质量与菌种管理的对策 |
| 1.3 黑木耳种质资源遗传分析方法及研究进展 |
| 1.3.1 传统的生物学方法 |
| 1.3.2 .生化标记:酯酶同工酶 |
| 1.3.3 DNA分子标记 |
| 1.4 液体发酵菌种技术在食用菌上的应用 |
| 1.5 吊袋栽培技术在木耳属的应用 |
| 1.6 研究背景、目的和意义 |
| 1.7 技术路线及主要研究内容 |
| 第2章 黑木耳菌株生理特性、多样性研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 试验试剂和仪器 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 供试培养基制备 |
| 2.2.2 菌丝活化 |
| 2.2.3 对峙培养法 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 拮抗测定结果 |
| 2.3.2 小结 |
| 第3章 酯酶同工酶多样性分析 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 供试菌株 |
| 3.1.2 试剂、仪器与设备 |
| 3.1.3 试剂的配制 |
| 3.2 酯酶同工酶方法 |
| 3.2.1 菌丝体培养 |
| 3.2.2 凝胶制备 |
| 3.2.3 点样 |
| 3.2.4 电泳 |
| 3.2.5 染色 |
| 3.2.6 拍照统计 |
| 3.3 试验结果分析 |
| 3.3.1 酶谱多样性 |
| 3.3.2 聚类分析 |
| 3.3.3 小结 |
| 第4章 黑木耳菌株SRAP标记分析 |
| 4.1 供试菌株 |
| 4.2 试剂、设备及仪器 |
| 4.3 黑木耳菌株DNA的提取 |
| 4.3.1 DNA提取方法 |
| 4.3.2 DNA质量检测 |
| 4.4 黑木耳引物设计 |
| 4.5 黑木耳SRAP-PCR扩增条件 |
| 4.6 引物筛选 |
| 4.7 水平琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.8 数据分析 |
| 4.9 试验结果与分析 |
| 4.9.1 DNA提取结果 |
| 4.9.2 引物筛选结果 |
| 4.9.3 引物扩增结果 |
| 4.9.4 基于SRAP分子标记的遗传距离、聚类分析 |
| 4.9.5 小结 |
| 第5章 黑木耳菌株ISSR标记分析 |
| 5.1 供试菌株 |
| 5.2 试剂、设备及仪器 |
| 5.3 黑木耳菌株DNA的提取 |
| 5.4 黑木耳引物设计 |
| 5.5 黑木耳ISSR-PCR扩增条件 |
| 5.5.1 PCR扩增反应体系 |
| 5.5.2 扩增程序 |
| 5.6 引物筛选 |
| 5.7 水平琼脂糖凝胶电泳 |
| 5.8 数据分析 |
| 5.9 试验结果与分析 |
| 5.9.1 引物筛选结果 |
| 5.9.2 引物扩增结果 |
| 5.9.3 基于ISSR分子标记的遗传距离、聚类分析 |
| 5.9.4 小结 |
| 第6章 优良菌株筛选研究 |
| 6.1 试验菌株 |
| 6.2 培养基配方 |
| 6.3 菌丝生长速度和生长势的测定 |
| 6.4 出菇管理 |
| 6.4.1 菌种制作 |
| 6.4.2 打孔催芽,吊袋入棚 |
| 6.4.3 吊袋式栽培 |
| 6.4.4 栽培管理 |
| 6.4.5 试验地点及记录内容 |
| 6.5 试验结果与分析 |
| 6.5.1 母种生理特性 |
| 6.5.2 不同黑木耳菌株出耳性状比较 |
| 6.5.3 木耳菌株抗杂情况 |
| 6.5.4 不同黑木耳菌株产量情况分析 |
| 6.6 小结 |
| 结论与讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（5）承德及周边地区野生菌采集鉴定及生物学活性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 食用菌的种类及价值 |
| 1.1.1 食用菌的种类 |
| 1.1.2 食用菌的食药用价值 |
| 1.2 野生食用菌开发及应用现状 |
| 1.2.1 野生食用菌的资源 |
| 1.2.2 野生食用菌的开发利用情况 |
| 1.3 野生食用菌的分类鉴定方法 |
| 1.3.1 形态鉴定在野生食用菌鉴定中的应用 |
| 1.3.2 rDNAITS序列在野生食用菌鉴定上的应用 |
| 1.4 生物学活性分析 |
| 1.4.1 多糖在食用菌中的应用及其研究进展 |
| 1.4.2 蛋白质在食用菌中的应用及其研究进展 |
| 1.4.3 漆酶在食用菌中的应用及其研究进展 |
| 1.4.4 抗菌活性在食用菌中的应用及其研究进展 |
| 1.5 本课题研究的目的及意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第2章 野生食用菌的采集与形态鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 采集工具 |
| 2.1.2 采集方法 |
| 2.1.3 形态鉴定方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 野生食用菌采集 |
| 2.2.2 野生食用菌形态鉴定 |
| 2.3 结论 |
| 第3章 野生食用菌的组织分离及菌丝生长速度测定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 组织分离结果 |
| 3.2.2 菌丝生长速度测定结果 |
| 3.3 结论 |
| 第4章 野生菌种ITS鉴定及系统进化树的建立 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 DNA提取结果 |
| 4.2.2 PCR扩增结果 |
| 4.2.3 野生菌株系统发育树建立及结果分析 |
| 4.3 结论 |
| 第5章 野生食用菌生物学活性分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 野生菌株漆酶活力结果分析 |
| 5.2.2 野生菌株粗蛋白质含量结果分析 |
| 5.2.3 野生菌株可溶性蛋白含量结果分析 |
| 5.2.4 野生菌株粗多糖含量结果分析 |
| 5.2.5 野生菌株抗菌活性结果分析 |
| 5.3 结论 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）中国东北元蘑种质资源评价及其三萜合成途径相关基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 国内外元蘑种质资源研究现状 |
| 1.2 食用菌栽培病害研究 |
| 1.3 基因组学研究 |
| 1.4 遗传多样性研究 |
| 1.5 转录组学研究 |
| 1.6 苦味物质研究 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 元蘑种质资源收集及鉴定 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 元蘑种质资源评价 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 元蘑基因组分析及其分子进化研究 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 元蘑种质资源遗传多样性分析 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 元蘑苦味物质三萜合成途径相关基因研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第七章 结论与展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 创新点 |
| 7.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附表1-1 已完成基因组测序的食药用菌物种名录 |
| 附图2.1 野生元蘑生境图片 |
| 附表2-1 栽培数据整理 |
| 附表3-1 元蘑菌株抗病性评价列表 |
| 附表4-1 选择的已发表基因组 |
| 附表4-2 元蘑CYPs基因家族 |
| 附表4-3 不同真菌中CAZymes家族基因的分布 |
| 附表4-4 参与元蘑次生代谢的假定基因和基因簇 |
| 附表4-5 元蘑多糖生物合成的假定基因 |
| 附表5-1 多样性分析选择菌株 |
| 附表5-2 各菌株的SNP检测及注释结果 |
| 附表5-3 各菌株的InDel检测及注释结果 |
| 附表5-4 各菌株的SV检测及注释结果 |
| 附表5-5 各菌株的CNV检测及注释结果 |
| 附表6-1三萜合成中与P450 修饰相关基因列表 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（7）冷诱导金针菇子实体发育相关基因分析及CRISPR-Cas9突变技术体系的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略语及中文对照 |
| 第一章 前言 |
| 1 研究背景 |
| 1.1 金针菇的营养和药用价值 |
| 1.2 金针菇的工厂化栽培及育种 |
| 1.3 食用菌生长发育的研究进展 |
| 1.4 真菌micro RNA研究进展 |
| 1.4.1 micro RNA的概述 |
| 1.4.2 micro RNA的生成途径 |
| 1.5 转录组测序和micro RNA测序的研究进展 |
| 1.5.1 转录组测序 |
| 1.5.2 micro RNA测序 |
| 1.6 DNA分子标记的研究进展 |
| 1.7 金针菇遗传操作工具的研究进展 |
| 1.7.1 金针菇遗传转化技术 |
| 1.7.2 RNAi沉默技术和同源重组基因敲除技术 |
| 1.7.3 基因组编辑技术 |
| 2 研究目的及意义 |
| 3 主要研究内容 |
| 4 技术路线图 |
| 第二章 冷诱导金针菇子实体发育机理的转录组测序 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 培养基 |
| 2.1.5 数据库及软件 |
| 2.1.6 实验仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 金针菇材料的收集 |
| 2.2.2 转录组文库构建及测序 |
| 2.2.3 转录组信息分析 |
| 2.2.4 转录组的RT-qPCR验证 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 金针菇转录组测序材料的收集 |
| 3.2 转录组测序的概况 |
| 3.3 功能注释及蛋白表达框的预测 |
| 3.4 菌丝和原基差异基因的总体分析 |
| 3.5 菌丝和原基差异基因显着富集的GO功能分类分析 |
| 3.6 菌丝和原基差异表达基因的Pathway分析 |
| 3.7 差异表达基因的RT-qPCR验证 |
| 4 讨论 |
| 4.1 金针菇材料的收集 |
| 4.2 转录组测序 |
| 5 本章小结 |
| 第三章 基于转录组的冷诱导金针菇子实体发育的通路、基因挖掘及分子标记的开发 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 数据来源及软件 |
| 2.2 通路和基因的挖掘 |
| 2.3 基于转录组的分子标记的开发 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 糖类代谢相关基因差异表达 |
| 3.2 翻译相关途径基因差异表达 |
| 3.3 脂质代谢基因差异表达 |
| 3.4 信号转导通路基因差异表达 |
| 3.5 蛋白质的折叠、分拣及降解基因差异表达 |
| 3.6 冷诱导金针菇子实体形成其他途径 |
| 3.7 基于de novo转录组的SSR分子标记的开发 |
| 3.8 基于de novo转录组的SNPs分子标记的开发 |
| 4 讨论 |
| 5 本章小结 |
| 第四章 冷诱导金针菇子实体发育的microRNA测序 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料与菌株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 实验仪器与设备 |
| 2.1.5 软件及数据库 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 材料收集及总RNA提取 |
| 2.2.2 microRNA测序文库构建及高通量测序 |
| 2.2.3 测序数据的生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 microRNA测序的概况 |
| 3.2 非编码RNA的分类与注释 |
| 3.3 新的microRNA及靶基因预测 |
| 3.4 microRNA差异表达分析及显着性差异表达microRNA筛选 |
| 3.5 microRNA靶基因功能注释 |
| 4 讨论 |
| 4.1 金针菇microRNA的鉴定 |
| 4.2 金针菇microRNA及其靶基因 |
| 5 本章小结 |
| 第五章 冷诱导金针菇子实体发育的重要基因克隆及其生物信息学分析 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试剂及菌种 |
| 2.1.4 软件及数据库 |
| 2.1.5 培养基及溶液的配制 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因的鉴定及其转录组表达情况分析 |
| 2.2.2 以gDNA为模板的基因克隆 |
| 2.2.3 以cDNA为模板的基因克隆 |
| 2.2.4 菌丝和原基的RT-qPCR验证 |
| 2.2.5 生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 金针菇基因组DNA和总RNA提取 |
| 3.2 金针菇dcl基因克隆及其生物信息学分析 |
| 3.2.1 金针菇dcl基因的鉴定及克隆 |
| 3.2.2 金针菇dcl基因的生物信息学分析 |
| 3.3 金针菇ago基因克隆及其生物信息学分析 |
| 3.3.1 金针菇ago基因的鉴定及克隆 |
| 3.3.2 金针菇ago基因的生物信息学分析 |
| 3.4 金针菇drk1和mga2基因的克隆及其生物信息学分析 |
| 3.4.1 金针菇drk1和mga2基因的鉴定及克隆 |
| 3.4.2 金针菇drk1和mga2基因的生物信息学分析 |
| 3.5 金针菇基因的菌丝和原基表达情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 DCL蛋白 |
| 4.2 AGO蛋白 |
| 4.3 Mga2和DRK1蛋白 |
| 5 本章小结 |
| 第六章 金针菇CRISPR-Cas9突变技术的建立 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 引物 |
| 2.1.4 培养基及主要溶液配制 |
| 2.1.5 仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 drk1和PyrG基因的靶位点选择 |
| 2.2.2 H1-gRNA表达框的构建 |
| 2.2.3 金针菇U6启动子的克隆及FvU6-gRNA表达框的构建 |
| 2.2.4 FvCas9表达框及gpd-gRNA表达框的构建 |
| 2.2.5 PEG法介导的金针菇CRISPR-Cas9系统的建立 |
| 2.2.6 ATMT法介导的金针菇CRISPR-Cas9系统的建立 |
| 2.2.7 FvCas9 in vivo和gRNA in vitro的金针菇CRISPR-Cas9系统的建立 |
| 2.2.8 FvCas9-gRNA复合物的金针菇CRISPR-Cas9系统的建立 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 金针菇全基因组CRISPR-Cas9靶位点分布 |
| 3.2 金针菇U6启动子的克隆 |
| 3.3 H1-gRNA、gpd-gRNA和FvU6-gRNA表达框的构建 |
| 3.4 Cas9密码子优化及Cas9表达框的构建 |
| 3.5 PEG法转化的载体构建 |
| 3.6 PEG法转化金针菇YX74及目标基因突变检测结果 |
| 3.7 ATMT法转化的载体构建 |
| 3.8 ATMT法转化及目标基因突变的情况 |
| 3.9 基于FvCas9 in vivo和gRNA in vitro的CRISOR-Cas9系统建立 |
| 3.9.1 金针菇转化子Fv Cas9基因组DNA全长CDS检测 |
| 3.9.2 金针菇转化子Fv Cas9Western blot检测及RT-qPCR检测 |
| 3.9.3 PEG法和电激法转化及拟突变体检测 |
| 3.10 基于SpCas9-gRNA复合物的CRISPR-Cas9突变技术 |
| 3.10.1 SpCas9和gRNA体外制备及SpCas9-gRNA体外活性检测 |
| 3.10.2 电激法转化金针菇原生质体及基因编辑结果检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 gRNA表达的启动子 |
| 4.2 基于PEG法转化的CRISPR-Cas9突变技术 |
| 4.3 基于ATMT法转化的CRISPR-Cas9突变技术 |
| 4.4 FvCas9 in vivo-gRNA in vitro以及SpCas9-gRNA复合物的CRISPR-Cas9突变技术 |
| 5 本章小结 |
| 第七章 结论及展望 |
| 1 结论 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录A H1-gRNA完整表达框序列 |
| 附录B gpd-gRNA表达框序列 |
| 附录C 金针菇密码子优化后的Cas9序列 |
| 附录D 金针菇U6 snRNA |
| 附录E 金针菇U6-gRNA完整表达框序列 |
| 附录F 攻读博士学位期间发表的论文 |
（8）我国不同地区印度块菌伴生微生物多样性及化学成分含量分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一章 块菌属发育过程中伴生微生物多样性及其生态功能 |
| 第一节 块菌属发育过程中伴生微生物多样性 |
| 一、块菌属发育过程中伴生细菌多样性 |
| 二、影响块菌属生长发育的真菌多样性 |
| 第二节 块菌属发育过程中伴生微生物多样性的研究方法 |
| 第三节 块菌属发育过程中伴生微生物的生态功能 |
| (一) 促进块菌属生长发育 |
| (二) 促进块菌属独特芳香化合物的产生 |
| 第四节 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 印度块菌伴生微生物多样性 |
| 第一节 不同地区印度块菌子实体伴生细菌多样性 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 三、结果与分析 |
| (一) 不同地区印度块菌形态学与系统发育分析 |
| (二) 不同地区印度块菌子实体伴生细菌多样性分析 |
| (三) 不同地区印度块菌子实体伴生细菌物种组成分析 |
| (四) 不同地区印度块菌子实体伴生细菌组成差异分析 |
| 四、讨论 |
| 第二节 印度块菌不同组织部位伴生细菌多样性 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 三、结果与分析 |
| (一) 印度块菌不同组织部位伴生细菌多样性分析 |
| (二) 印度块菌不同组织部位伴生细菌物种组成分析 |
| (三) 印度块菌不同组织部位细菌群落组成差异分析 |
| 四、讨论 |
| 第三节 印度块菌菌塘内外土壤微生物多样性分析 |
| 一、引言 |
| 二、实验材料与方法 |
| 三、结果与分析 |
| (一) 印度块菌菌塘内外土壤微生物多样性分析 |
| (二) 印度块菌菌塘内外土壤微生物物种组成分析 |
| (三) 印度块菌菌塘内外土壤微生物群落组成差异分析 |
| (四) 印度块菌菌塘内外土壤理化性质分析 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 印度块菌子实体化学成分含量及其抗氧化活性 |
| 第一节 我国不同地区印度块菌子实体挥发性化合物 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果与分析 |
| (一) 不同地区印度块菌挥发性化合物的GC-MS分析 |
| (二) 不同地区印度块菌挥发性化合物种类分析 |
| 四、讨论 |
| 第二节 不同地区印度块菌营养成分含量及其抗氧化活性 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果与分析 |
| (一) 游离糖含量分析 |
| (二) 脂肪酸含量分析 |
| (三) 有机酸含量分析 |
| (四) 酚酸化合物含量分析 |
| (五) 酚类化合物与黄酮类化合物含量分析 |
| (六) 多糖含量分析 |
| (七) 抗氧化活性分析 |
| (八) 相关性分析 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 印度块菌子实体中可培养微生物种类及其生理活性 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果与分析 |
| (一) 印度块菌子实体中可培养微生物分离纯化 |
| (二) 块菌子实体可培养微生物多样性分析 |
| (三) 印度块菌中可培养微生物活性筛选 |
| 三、讨论 |
| 参考文献 |
| 主要结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）高质量真姬菇全基因组提取方法筛选（论文提纲范文）
| 1 材料及方法 |
| 1.1 菌种 |
| 1.2 主要仪器及试剂 |
| 1.3 样品制备及前处理 |
| 1.4 DNA提取 |
| 1.5 真姬菇基因组DNA质量检测 |
| 1.5.1 琼脂糖凝胶电泳检测 |
| 1.5.2 DNA浓度和纯度检测 |
| 1.5.3 PCR扩增检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 真姬菇基因组DNA的电泳检测及浓度、纯度比较 |
| 2.1.1 12种基因组DNA提取方法的比较 |
| 2.1.2 不同前处理方法对优选的6种基因组提取效果的影响 |
| 2.1.3 CTAB-SDS方法优化 |
| 2.2 真姬菇基因组DNA的PCR扩增检测 |
| 3 结论 |
（10）用rDNA-ITS方法鉴别内蒙古多种野生食用菌（论文提纲范文）
| 1 引言 |
| 2 试验材料与方法 |
| 2.1 供试材料 |
| 2.2 样品处理 |
| 2.3 DNA提取与优化 |
| 2.4 ITS PCR体系建立 |
| 2.5 测序 |
| 2.6 序列比对 |
| 2.7 生物信息学分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 DNA提取优化 |
| 3.2 ITS扩增结果 |
| 2.3鉴定结果 |
| 3.4 同源树的建立及结果分析 |
| 4 结论与讨论 |
| 4.1 结论 |
| 4.2 讨论 |
四、食用菌DNA提取方法研究（论文参考文献）
- [1]牡丹江周边野生大型真菌采集鉴定及抑稻瘟菌生防菌株筛查[D]. 赵世明. 牡丹江师范学院, 2021(08)
- [2]单增李斯特菌质粒DNA定性标准物质的研制及在银耳检测中的应用[D]. 马盼盼. 河南大学, 2020(02)
- [3]云南食用菌内生细菌多样性分析及抗生素抗性的研究[D]. 李银娇. 昆明理工大学, 2020(05)
- [4]不同黑木耳品种种质鉴定及优良菌株筛选研究[D]. 史灵燕. 河北工程大学, 2019(07)
- [5]承德及周边地区野生菌采集鉴定及生物学活性分析[D]. 李超. 河北工程大学, 2019(02)
- [6]中国东北元蘑种质资源评价及其三萜合成途径相关基因研究[D]. 田风华. 吉林农业大学, 2019(03)
- [7]冷诱导金针菇子实体发育相关基因分析及CRISPR-Cas9突变技术体系的建立[D]. 伍土恒. 华南农业大学, 2019(02)
- [8]我国不同地区印度块菌伴生微生物多样性及化学成分含量分析[D]. 李佳梅. 北京协和医学院, 2019(02)
- [9]高质量真姬菇全基因组提取方法筛选[J]. 孙溪,班立桐,王玉,肖萍,范志华,王旭峰,杨华,黄亮. 食品科技, 2018(12)
- [10]用rDNA-ITS方法鉴别内蒙古多种野生食用菌[J]. 刘晓婷,郭九峰,王淑妍,李亚娇,那日. 食药用菌, 2015(05)